从小鼠垂体开发类器官 体外 探索垂体干细胞生物学的模型
2022年2月25日
垂体是机体内分泌系统的关键调节器官。本文介绍了一种从小鼠垂体发育而来类器官的新颖三维体外模型，用于研究垂体干细胞群体，而该群体的生物学特性与功能目前仍知之甚少。
我们的类器官模型在探索垂体干细胞生物学方面具有重要价值，不仅适用于稳态条件，也适用于垂体重塑条件，例如腺体的新生儿成熟期、与衰老相关的功能衰退以及腺体内的肿瘤生长。迄今为止，我们的垂体类器官技术是唯一能够可靠且稳健地培养和扩增原代小鼠垂体干细胞的工具。本实验操作将由我研究团队的博士研究生 Emma Laporte 和 Charlotte Nys 演示。
首先，用去离子水清洗小鼠头部以去除血液。在头部喷洒70%乙醇以创造无菌环境。然后，使用无菌外科工具去除两耳之间的皮肤。
打开颅骨时，使用无菌剪刀折断鼻梁。从鼻梁开始，向两侧耳部方向进一步撑开颅骨。使用无菌镊子取出颅骨和脑组织，注意不要触碰垂体。
用钝头镊子去除鞍膈。然后在体视显微镜下将腺垂体前叶与后叶及中间叶分离。用钝头镊子小心分离前叶，并将其收集至含有3毫升A培养基的10毫升锥形瓶中。加入2毫升预热的2.5%胰蛋白酶溶液。
在37摄氏度下孵育15分钟。加入2毫升预热的DNA酶溶液，轻轻旋转锥形瓶10次。静置使垂体沉降至底部，然后移除上清液。
加入2 mL预热的胰蛋白酶抑制剂溶液，在37°C下孵育10分钟。当垂体沉至底部时，移除上清液。加入2 mL预热的B培养基，孵育5分钟。
向其中加入 2 毫升预热的 C 培养基，孵育 15 分钟。让垂体沉至管底，吸去上清液。然后用预热的 C 培养基清洗三次。加入 2 毫升预热的 C 培养基。用无菌、火焰抛光的巴斯德吸管反复吹打垂体组织多次，直至肉眼不可见组织碎片为止。
将悬液转移至含有4.5毫升预热DNA酶溶液的15毫升离心管中。用2毫升预热的C培养基冲洗培养瓶三次，并将悬液转移至该离心管中。混匀收集的细胞悬液，然后通过40微米细胞滤网过滤至30毫升离心管中。
用2毫升培养基C将离心管和细胞滤筛冲洗三次，并将悬液转移至离心管中。用2毫升BSA填充玻璃巴斯德吸管。将吸管尖端置于离心管底部，轻轻吹出，形成可见的密度层。
在4°C条件下，以190 × g离心10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1毫升冰预冷的高级DMEM/F-12培养基中。随后使用细胞计数仪对细胞进行定量。
在4°C条件下，以190 × g离心细胞悬液10分钟，弃上清液。用高级DMEM/F-12培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度至每毫升1.1 × 10⁶个细胞。按30:70的比例将ECM加入所需体积的细胞悬液中，并充分混匀。
在预热的48孔板的每个孔中加入30微升该混合液。将培养板倒置，于37摄氏度下孵育20分钟，使ECM凝固。孵育结束后，小心加入250微升预热的垂体类器官培养基，培养基中添加10微摩尔的ROCK抑制剂。
每两到三天更换一次不含ROCK抑制剂的培养基，持续10至14天，直至类器官完全生长。传代类器官时，首先轻轻吸除培养基，加入400微升预冷的高级DMEM/F-12培养基以解离细胞外基质（ECM）。随后，将类器官收集至微量离心管中。
用400微升预冷的高级DMEM/F-12洗涤孔板。在4摄氏度下，以200 ×g离心5分钟。弃去上清液，加入400微升预热的TrypLE Express酶。
通过反复倒置管子混匀，于37摄氏度孵育5分钟。加入400微升预冷的高级DMEM/F-12培养基。在4摄氏度下以200 × g离心5分钟，弃去上清液。
用100 µL预冷的高级DMEM/F-12重悬沉淀。收窄P-200枪头，用该枪头通过剧烈吹打解离类器官，直至获得类器官碎片。加入800 µL高级DMEM/F-12。
在4°C条件下以190 × g离心10分钟，弃去上清液。传代类器官时，将沉淀物重悬于适量体积的改良型DMEM/F-12培养基中，并以30:70的比例加入细胞外基质（ECM），充分混匀。
按照文稿中所述方法继续进行类器官的接种与培养。将垂体前叶解离得到的单个细胞接种于细胞外基质（ECM）中，并在垂体类器官培养基中进行培养。接种后14天，类器官已完全发育，直径可达500微米。
在此阶段，类器官呈现出囊状形态，由上皮层包裹着管腔。不建议使用生长后出现致密结构的孔。传代时，使用类器官碎片进行接种。
传代7天后，观察到具有囊状结构的类器官生长良好。应弃去致密的类器官，因为生长不良的类器官可能在培养中占据主导。对上皮标志物E-cadherin以及细胞角蛋白8和18进行免疫荧光染色分析，证实了类器官的上皮特性。
垂体干细胞标志物 Sox2 和 Trop2 的表达表明类器官具有干细胞特性，而垂体特异性标志物 LHX3 则显示了类器官的垂体表型。增殖标志物 Ki67 的表达表明构成类器官的细胞处于增殖状态。实时定量 PCR 分析显示，即使经过多次传代，类器官中干细胞标志物的表达水平仍高于前叶组织，证实了干细胞的富集。
在初始接种时，将适当数量的单细胞接种于ECM凝胶滴中至关重要；而在传代类器官时，必须注意重新接种组织碎片而非单细胞。
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概述
本文介绍了一种利用小鼠垂体类器官开发的新型三维体外模型，用于研究垂体中的干细胞群体。该模型对于探索不同条件下（包括新生期成熟过程和肿瘤生长）垂体干细胞生物学具有重要意义。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 干细胞生物学
- 内分泌学
背景
- 垂体调节内分泌系统。
- 了解其干细胞群体对于深入认识多种疾病状况至关重要。
- 目前研究这些细胞的技术存在局限性。
- 本研究介绍了一种培养垂体干细胞的可靠方法。
研究目的
- 建立小鼠垂体的三维类器官模型。
- 研究垂体干细胞的生物学特性与功能。
- 提供一种用于研究影响垂体腺疾病状况的工具。
使用的方法
- 小鼠垂体干细胞的分离。
- 类器官培养体系的建立。
- 干细胞生长与扩增的评估。
- 该模型在不同生理条件下的应用。
主要结果
- 类器官模型成功支持了原代小鼠垂体干细胞的生长。
- 该模型可用于探索干细胞在稳态和组织重塑条件下的行为。
- 已展现出研究与衰老相关功能衰退的潜力。
- 为了解垂体腺中肿瘤生长动态提供了新见解。
结论
- 所开发的类器官模型是垂体研究领域的一项重大进展。
- 它为研究干细胞生物学提供了一个独特的平台。
- 该技术有助于更好地理解与垂体相关的疾病。
常见问题
行业重要性概要
建立小鼠垂体来源类器官作为一种稳健的体外模型，能够在稳态和重塑条件下系统性地探索垂体干细胞生物学。该平台解决了内分泌学和再生医学研究项目中靶点验证和机制去风险化的重要空白。该模型具有良好的可重复性和长期扩增能力，可为早期发现和转化研究提供可靠的预测依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在特定条件下研究垂体干细胞的表型及活化状态。
- 通过重现体内干性特征及组织特异性标志物，支持生物学风险评估。
- 有助于提高内分泌及再生医学项目中靶点筛选的预测可靠性。
筛选与检测方法开发
- 提供一种经过验证的三维系统，用于定量评估干细胞的增殖与分化。
- 通过可重复的类器官扩增及标志物表达分析，实现检测方法的标准化。
- 支持对影响垂体干细胞功能或组织重塑的化合物进行高通量筛选前的准备工作。
转化与临床前研究
- 与垂体成熟、衰老及肿瘤发生的疾病相关模型相一致。
- 支持从发现到干细胞靶向干预的临床前验证的连续性研究。
- 通过建模健康与病变腺体状态，支持基于风险调整的推进研究。
流程与工作流整合
该类器官模型可整合到从发现到临床前研究的连续过程中，实现对垂体干细胞靶点的假设验证、通路解析及功能验证。
- 发现生物学：在受控条件下支持对干细胞活化及表型的零假设检验。
- 筛选：提供可重复的定量输出，用于评估化合物对类器官生长和标志物表达的影响。
- 分析：可测量增殖（Ki67）、干性（Sox2、Trop2）和组织特异性标志物（LHX3），用于比较分析。
- 转化研究：模拟与内分泌疾病相关的关键生理转变和疾病状态。
- 企业级复用：提供可扩展、可重复使用的平台，支持跨项目的干细胞生物学研究。
运营与企业影响
- 科学价值：提高垂体干细胞研究的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化类器官培养、扩增和表型分析的工作流程。
- 战略价值：通过实现可靠的早期验证，提升决策效率和资本使用效益。
- 项目组合影响：支持对内分泌和再生医学发现项目的基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备类器官培养、干细胞标志物分析和定量成像方面的专业知识。
- 需要具备先进的细胞培养、成像和分子分析基础设施。
- 要求跨团队在类器官接种、传代和标志物验证方面实现标准化，以确保可重复性。
- 若应用于小鼠垂体以外的其他物种或疾病模型，可能需要进行方法优化。
- 细胞密度和组织片段选择的严格控制对于获得稳定的类器官质量至关重要。
