Name: 检测植物-真菌相互作用中果胶的双重染色方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 学习使用双重染色法检测咖啡叶片中的果胶，以研究植物与真菌的相互作用。该方法利用棉蓝和钌红染色，在普通光学显微镜下清晰识别真菌菌丝和吸器结构，无需昂贵设备即可诊断咖啡锈病等生物营养型和死体营养型真菌病害。

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作者感谢 Hudson W. P. de Carvalho 博士为本研究的开展提供的支持。作者还感谢“Elliot Watanabe Kitajima 教授电子显微镜实验室”提供的光学显微镜设备。作者感谢&#160;Dr. Flávia Rodrigues Alves Patrício 提供带有病害症状的植物材料。

1. 缓冲溶液和试剂的准备
<ol>
	<li>通过将4.28 g二甲胂酸钠加入100 mL蒸馏水中，再用0.2 N HCl调节pH至7.25，制备2 M二甲胂酸缓冲液。</li>
	<li>通过混合以下成分制备100 mL卡诺夫斯基固定液：10 mL 25%水溶液戊二醛、10 mL 10%水溶液甲醛、25 mL 2 M二甲胂酸缓冲液和0.5 mL 0.5 M CaCl226，再用蒸馏水定容至100 mL。 
	注意：该溶液可在冰箱中保存6个月。 
	警告：二甲胂酸缓冲液具有毒性，因此应在通风橱或开放区域操作固定液；避免吸入其蒸气，操作时应佩戴手套。</li>
	<li>通过混合以下成分制备水相霍格兰营养液：3 mM Ca(NO3)2·4H2O、2 mM NH4H2PO4、5 mM KH2PO4、2 mM MgSO4·7H2O、9.07 mM MnSO4、0.765 mM ZnSO4·7H2O、46.4 mM H3BO3、0.09 mM Na2MoO4·H2O、0.01 mM CuSO4，以及36 mM FeSO4·7H2O（以乙二胺四乙酸铁络合物形式）27。</li>
</ol>
2. 植物样品与真菌接种
注意：对于受咖啡锈病影响的叶片实验，在巴西圣保罗州皮拉西卡巴市圣保罗大学核能农业研究中心（CENA）的温室中培育并保存了五株两个月大的阿拉比卡咖啡（Coffee arabica）卡图艾品种幼苗。
<ol>
	<li>在生长室中，将咖啡植株种植于装有约5.5 pH的Hoagland水培营养液的500 mL塑料盆中，培养4个月。生长室温度维持在27 ± 3 °C，采用LED灯提供光周期，光照时长为12小时，光子通量为250 µmol photons s-1 m-2。在4个月内每周更换一次Hoagland营养液。</li>
	<li>选取5株植株上各4片展开的叶片，将其远轴面按照文献28所述方法接种1 × 103&#160;H. vastatrix夏孢子。接种后，用黑色塑料袋覆盖植株，置于黑暗环境中培养48小时。接种后30天采集病斑组织。</li>
	<li>从位于巴西圣保罗州坎皮纳斯市圣保罗州生物研究所（地理坐标：-22.906506126269942, -47.015075902025266）的阿拉比卡咖啡品种Obatã（Coffea arabica cv. Obatã）植株上采集由Cercospora coffeicola引起的典型病斑。在处理样品前，先在体视显微镜下观察病斑，确认是否存在咖啡C. coffeicola的分生孢子。随后制备部分载玻片以观察分生孢子，进一步验证病害病因22。</li>
</ol>
3. 样品收获、固定与脱水
<ol>
	<li>使用解剖刀和镊子，从病斑中部区域（黄斑；图1）采集约 10 mm2 的叶片样品，并将其浸入 30 mL 卡诺夫斯基固定液中（图1&#160;和 图2A）。固定步骤可在冰箱中进行 48 小时。</li>
	<li>使用油泵对叶片样品进行至少四次低真空处理（500–600 mBar），每次 15 分钟，以增强固定液在叶片组织中的渗透性。此步骤需同时旋转样品（图1）。</li>
	<li>固定完成后，将叶片样品用蒸馏水稀释的 0.5 M 卡考基缓冲液（pH 7.2）洗涤三次，每次 5 分钟，随后将其转移至梯度乙醇系列（30%、50%、70%、90%（2 次）、100%（2 次））中，每种乙醇浓度处理 15 分钟（图1 和 图2B）。</li>
</ol>
4. 硬树脂包埋步骤
<ol>
	<li>按照制造商的说明，分三步逐步将样品转移至甲基丙烯酸乙二醇酯（GMA）中。首先，在磁力搅拌下将GMA粉末（1 g）与100 mL基础树脂（组织树脂试剂盒；材料表）混合，配制溶液A，然后按以下步骤操作。
	<ol>
		<li>将样品浸入1:2的溶液A与100%乙醇的混合液中，持续3小时。</li>
		<li>将样品浸入1:1的溶液A与100%乙醇的混合液中，持续3小时。</li>
		<li>将样品浸入纯基础树脂中，持续2至4天。在此步骤中，每天至少四次将样品置于低真空条件下15分钟，随后进行旋转处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 聚合反应
注意：聚合过程需要1.2 mL塑料模具、基础树脂和固化剂（详见材料表中商业试剂盒的详细信息）。
<ol>
	<li>在烧杯中将15 mL溶液A（步骤4.1）与1 mL固化剂混合，旋转搅拌2分钟，制备聚合溶液（溶液B）。</li>
	<li>取1.2 mL聚合溶液（溶液B）加入塑料模具中。使用木签将病变叶片样品从纯基础树脂转移至溶液B中（图2C）。避免使用镊子，以免造成组织压损。</li>
	<li>确保在溶液B于5分钟内迅速变粘稠前，快速将叶片样品垂直定向放置于塑料模具中。单个模具中可放置多个病变叶片样品。 
	注意：在处理大量样品前，建议先多次练习上述步骤。当样品数量较多时，不同模具间的聚合时间可能存在差异，叶片样品的垂直定向可能难以实现。</li>
	<li>当叶片样品达到垂直定向后，静置30分钟，然后将塑料模具转移至含有硅胶的塑料或玻璃容器中，以防止潮湿。继续静置2–3小时完成聚合。</li>
	<li>经过2–3小时后，当树脂与叶片样品完全聚合，使用砂纸对聚合块底部进行打磨，将其从塑料模具中分离。随后将聚合块粘附于一块木片上（图2D）。</li>
</ol>
6. 切片
<ol>
	<li>使用配备8 cm钢制刀片的旋转式切片机（图2E），将包埋块切成5 µm厚的切片。将切片置于覆盖有蒸馏水的载玻片上。将载有漂浮切片的载玻片转移至40 °C的加热板上干燥，以促进切片与载玻片的黏附。</li>
	<li>干燥后（图2F），用包埋块编号和载玻片序号标记载玻片。</li>
</ol>
7. 双重染色过程
<ol>
	<li>用 2 mL 5% 乳酸酚棉蓝（由 40% 甘油、20% 苯酚和 20% 乳酸溶于水中制成）覆盖切片，并在 45 °C 的加热板上加热 5 分钟（图 3A）。</li>
	<li>将载玻片在盛有蒸馏水的烧杯中清洗三次，以去除多余的染料（图 3B-D）。</li>
	<li>用 2 mL 0.01% 水溶性钌红染色 1 分钟（图 3E）。</li>
	<li>将载玻片在盛有蒸馏水的烧杯中清洗三次，以去除多余的染料（图 3F,G）。</li>
	<li>在切片上滴加一滴蒸馏水，并用 24 mm × 60 mm 的盖玻片覆盖，用于进行光学显微镜分析。</li>
</ol>

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<li>Lecker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+lactophenol+cotton+blue+slide+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Community+Eye+Health+Journal%22%5BJournal%5D)">Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts.</a> Community Eye Health Journal. 12 (30), 24(1999).</li>
<li>Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactic+acid+in+wool+dyeing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Society+of+Dyers+and+Colourists%22%5BJournal%5D)">Lactic acid in wool dyeing.</a> Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103(1895).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究介绍了一种替代性的双重染色组织化学检测方法，用于分析包裹活体营养型病原系统中吸器的细胞壁果胶组成。本方法的目的还在于证明其在检测死体营养型真菌及其诱导的细胞壁变化方面的有效性。在咖啡锈菌（Hemileia vastatrix）侵染咖啡薄壁组织的过程中，细胞壁中的果胶可包裹吸器及其颈部结构。Silva 等人也曾报道在咖啡与 H. vastatrix 的病害系统中，纤维素和胼胝质也参与了此类包裹作用14,29。在与植物防御机制相关的细胞壁多糖中，果胶在植物-病原物互作系统中具有重要作用10,11,12。因此，了解果胶的功能具有重要的组织病理学价值。
由Cercospora coffeicola引起的咖啡树尾孢菌病会破坏叶片组织...

植物细胞壁防御机制对于抑制真菌侵染至关重要。自20世纪90年代以来，已有研究报道了细胞壁厚度和组成在真菌侵染过程中的变化。th 世纪1,2这些变化可由真菌病原体诱导，从而刺激乳突状结构（papilla）的形成，以阻止真菌侵入细胞，或用于包裹菌丝，将宿主细胞原生质体与真菌吸器隔离。动态细胞壁屏障（即乳突和完全包裹的吸器）的形成对于促进植物抗性具有重要意义3组织病理学研究已探讨了与真菌相关疾病中的这些机制，并描述了细胞壁多聚物（如纤维素、半纤维素（阿拉伯木聚糖）和胼胝质）作为抵御真菌侵染的抗性机制。4,5,6,7.
细胞壁是抵御微生物侵袭的第一道屏障，能够阻碍植物与真菌之间的相互作用。果胶类多糖构成细胞壁，在双子叶植物初生细胞的细胞壁成分中约占30%，其中同型半乳糖醛酸聚糖是最丰富的聚合物（约60%）8。高尔基体分泌复杂的果胶化合物，这些化合物包含半乳糖醛酸链，其可能被甲基化，也可能未被甲基化8,9。自2012年以来，文献指出果胶甲基酯化程度对于决定微生物果胶酶在侵染过程中的相容性至关重要10,11,12。因此，需要建立相关实验方案以检测果胶类化合物在植物-真菌病害系统中的存在及其分布情况。
已有多种技术用于检测乳头状结构或吸器的包裹情况。目前采用的参考方法包括固定组织的透射电子显微镜（TEM）以及活体和固定组织的光学显微镜观察。关于透射电镜，多项研究已证实细胞壁附加物在真菌抗性中的结构作用13,14,15,16，且使用凝集素和抗体是定位碳水化合物聚合物的一种复杂方法16。然而，研究表明光学显微镜是一种重要的研究手段，组织化学和免疫组织化学工具能够帮助更深入地理解乳头状结构及吸器包裹物的组成6,7。
致病性真菌主要有两种生活方式：活体营养型和死体营养型。活体营养型真菌依赖宿主活细胞获取营养，而死体营养型真菌则先杀死宿主细胞，再在死亡的组织中生长繁殖17在拉丁美洲，由真菌引起的咖啡叶锈病 Hemileia vastatrix是咖啡作物中的一种重要病害18,19. Hemileia vastatrix 表现出专性寄生特性，在抗性咖啡物种或品种中观察到的结构变化包括超敏反应、细胞壁上胼胝质、纤维素和木质素的沉积，以及细胞肥大14&#160;已有相关报道。据作者所知，文献中尚未报道果胶在咖啡锈病抗性中的重要性。另一方面，引起尾孢菌病的坏死性真菌会以果胶为靶标 通过 一组与细胞壁降解相关的酶，如果胶酶和多聚半乳糖醛酸酶20咖啡尾孢菌病，由真菌引起 Cercospora coffeicola 也是咖啡作物的主要威胁之一21,22该真菌在叶片和果实上均引起坏死性病斑。侵入后， C. coffeicola 通过细胞内和细胞间途径定殖植物组织23,24,25.
本实验方案旨在检测细胞壁中真菌结构和果胶的存在。该方法可用于鉴定植物在与真菌形成活体营养相互作用时，由寄主诱导产生的与果胶相关的反应（使用钌红染料对果胶的多聚半乳糖醛酸中的酸性基团进行特异性染色）。同时，该方案也有助于验证死体营养型真菌对果胶质细胞壁的降解作用。本研究结果表明，双重染色法能够有效区分真菌的结构及其生殖阶段。

<table><tbody><tr><td>Blades DB80 HS</td><td>Leica</td><td>14035838383</td><td>切片</td></tr><tr><td>二甲胂酸盐缓冲液</td><td>EMS</td><td># 11652</td><td>固定</td></tr><tr><td>棉蓝乳酚</td><td>Metaqu&amp;iacute;mica</td><td>70SOLSIG024629</td><td>染色</td></tr><tr><td>甲醛</td><td>EMS</td><td>#15712</td><td>固定</td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>EMS</td><td>#16216</td><td>固定</td></tr><tr><td>组织树脂试剂盒</td><td>Technovit /EMS</td><td>#14653</td><td>包埋用组织树脂</td></tr><tr><td>加热板</td><td>Dubesser</td><td>SSCD25X30-110V</td><td>染色</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Zeiss</td><td>#490040-0030-000</td><td>图像采集</td></tr><tr><td>切片机（Leica RM 2540）</td><td>Leica</td><td>149BIO000C1 14050238005</td><td>切片</td></tr><tr><td>塑料包埋模具托盘</td><td>EMS</td><td>10176-30</td><td>染色</td></tr><tr><td>钌红</td><td>LABHouse</td><td>#006004</td><td>染色</td></tr><tr><td>显微图像分析软件 Axion Vision</td><td>Zeiss</td><td>#410130-0909-000</td><td>图像采集</td></tr><tr><td>真空泵</td><td>Prismatec</td><td>131 TIPO 2 V.C.</td><td>固定</td></tr></tbody></table>

双重染色法检测植物-真菌互作中的果胶

Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction

植物细胞利用不同的结构机制（组成型或诱导型）来抵御真菌侵染。其中，包裹作用是一种高效的诱导型机制，可将真菌吸器与植物细胞原生质体隔离。相反，在坏死性互作中，细胞壁的多聚组分之一——果胶，会成为多种果胶降解酶的作用靶标。本文介绍了一种通过光学显微镜检测果胶和真菌菌丝的实验方案。研究对象包括咖啡锈菌Hemileia vastatrix侵染后咖啡叶片细胞中富含果胶的包裹结构，以及由Cercospora coffeicola诱导的叶肉细胞壁的改变。将病害叶片样品用卡诺夫斯基（Karnovsky）固定液固定，脱水后包埋于乙二醇甲基丙烯酸酯中，包埋时间为2–4天。所有步骤均通过抽真空去除细胞间隙中的空气，以提高包埋效果。将包埋块切成5–7 µm厚的切片，置于载玻片的水滴上展平，随后在40 °C下加热30分钟。接着，使用乳酚棉蓝（5%棉蓝溶于乳酚）和水溶性钌红（0.05%）对切片进行双重染色，前者用于检测真菌，后者用于检测果胶（果胶中聚半乳糖醛酸的酸性基团）。结果显示，Hemileia vastatrix的真菌吸器被果胶物质所包裹。在咖啡尾孢菌病中，叶肉细胞出现细胞壁溶解现象，并观察到细胞间隙中的菌丝和分生孢子梗。本文所描述的方法可有效检测植物与真菌互作过程中与果胶相关的防御反应。

GMA 包埋切片上的棉蓝乳酚染色显示，在活体营养和死体营养真菌互作过程中，咖啡叶肉细胞之间和内部均存在多种真菌结构。
在活体营养型病害系统中，采用双重染色法染色后，Hemileia vastatrix 的菌丝具有细胞壁和致密的原生质体内容物，在海绵组织和栅栏组织中均呈现深蓝色（图4A、B）。吸器母细胞（Hmc）和吸器也表现出明显的深蓝色（图4C）。用钌红复染后，真菌在细胞间隙中的分布清晰可辨（图4D）。深蓝色的Hmc有助于识别侵染区域。在互作过程中，H. vastatrix 的Hmc突破寄主细胞壁，形成吸器颈，其周围可被果胶类物质包围（图4E、F）。然而，富含果胶的包裹结构（粉红色至红色）并不能阻止吸器的形成（<strong class="xf...

本方案描述了一种在咖啡-真菌互作中检测果胶的显微方法。

植物细胞利用不同的结构机制（组成型或诱导型）来抵御真菌侵染。 encapsulation 是一种……

该实验方案具有重要意义，因为它能够识别植物与真菌之间的相互作用。该方法不仅能对果胶进行染色，还能显示病原菌细胞壁多糖的缺陷，并允许鉴定真菌的结构。这一简单且易于操作的技术可利用光学显微镜完成，无需使用扫描电子显微镜等昂贵设备。此外，该技术是一种快速的方法，可为植物组织病理学研究提供优异的植物结构区分效果。该技术能够识别植物与真菌的相互作用，因此有助于诊断由活体营养型和死体营养型真菌（如咖啡锈病和尾孢菌病）引起的各种病害。首先，使用解剖刀和镊子从病斑中部采集约10平方毫米的叶片样品，并将其浸入30毫升Karnovsky固定液中。利用油泵对叶片样品施加500至600毫巴的低真空处理，每次15分钟，至少重复四次，以增强固定液在叶片组织中的渗透性。固定完成后，将叶片样品在蒸馏水中稀释的0.5 M卡考基酸盐缓冲液中洗涤三次，每次5分钟，随后将样品转移至梯度乙醇系列中，每种乙醇浓度下处理15分钟。为逐步将样品转移至乙二醇甲基丙烯酸酯中，首先在磁力搅拌下将1克乙二醇甲基丙烯酸酯粉末与100毫升基础树脂混合，配制溶液A。然后将样品浸入溶液A与100%乙醇按1:2体积比配制的混合液中，持续3小时。接着将样品浸入溶液A与100%乙醇按1:1体积比配制的混合液中，持续3小时，最后将样品浸入纯基础树脂中，放置2至4天。每天至少四次将样品置于低真空环境中处理15分钟，随后进行旋转。在烧杯中将15毫升溶液A与1毫升固化剂混合，旋转两分钟，制备得到聚合用溶液B。取1.2毫升上述聚合用溶液B加入塑料模具中。使用木签将病变叶片样品从纯碱性树脂转移至溶液B中，避免使用镊子，以免造成组织压损。将叶片样品迅速调整为垂直于塑料模具的方向，因为溶液B会迅速变粘稠。当叶片样品达到垂直方向后，静置30分钟，然后将塑料模具转移至含有硅胶的塑料或玻璃容器中，以防止湿气影响。待树脂与叶片样品在两到三小时后完全聚合，使用砂纸锉刀打磨块状样品的底部，将其从塑料模具中分离出来。然后，将组织块粘附到一块木材上。使用配备8厘米钢制刀片的旋转式切片机将组织块切成5微米厚的切片。将切片置于覆盖有蒸馏水的玻片上。然后，将载玻片转移至加热板上，在40摄氏度下干燥，以促进组织切片与载玻片的黏附。干燥后，用组织块编号和切片编号标记载玻片。在切片上覆盖2 mL乳酚棉蓝溶液（含5%棉蓝），并在加热板上于45摄氏度加热5分钟。用盛有蒸馏水的烧杯将载玻片清洗三次，以去除多余的染料。加入2毫升0.01%的水溶性钌红溶液染色1分钟。再次用盛有蒸馏水的烧杯将载玻片清洗三次，以去除多余的染料。在切片上滴加一滴蒸馏水，盖上盖玻片，以进行光学显微镜观察。在双重染色法中，含有细胞壁和致密原生质体内容物的咖啡驼孢锈菌（Hemileia vastatrix）菌丝在海绵组织和栅栏组织中均呈深蓝色。吸器母细胞和吸器也呈现深蓝色。使用钌红进行反染色，可清晰界定真菌在细胞间隙中的分布。在互作过程中，咖啡驼孢锈菌（Hemileia vastatrix）吸器母细胞突破寄主细胞壁，并形成被果胶类物质包围的吸器颈。尽管吸器颈周围存在富含果胶的粉红色至红色包被，但仍无法阻止吸器的形成。在某些情况下，富含果胶的包被对吸器的包裹并不完全；而在另一些情况下，吸器则被完全包裹。在真菌不存在的病灶边缘，富含果胶的细胞壁保持了结构的完整性。双重染色法证实了细胞间菌丝的存在。在相互作用区域，果胶质细胞壁因溶解而出现完整性丧失。在近轴表皮中发现了分生孢子等生殖结构。在气孔下室中发现了呈卷曲结构的咖啡生尾孢（Cercospora coffeicola）菌丝，病灶区域的栅栏组织似乎发生了细胞壁裂解。应避免使用镊子，因其可能导致组织压碎。有必要进一步对锈病、炭疽病、尾孢菌病、黑粉病以及其他专性寄生、半专性寄生和腐生型植物-真菌互作系统开展组织病理学研究，以探讨该技术在不同病害系统中的应用潜力。

double-staining-method-to-detect-pectin-in-plant-fungus-interaction

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

检测植物-真菌相互作用中果胶的双重染色方法

本视频展示了一种双重染色方法，使用钌红和乳酸酚棉蓝对咖啡锈病植株中植物与真菌互作过程中的果胶和几丁质进行可视化观察。该实验步骤有助于理解植物在真菌感染过程中的防御机制。...

双重染色法：利用钌红与乳酚棉蓝染色技术可视化植物-真菌互作

本视频介绍了一种利用显微镜培养并定性分析真菌菌丝上细菌生物膜的方法。细菌生物膜常在真菌表面形成，涉及多种细菌与真菌的相互作用过程，例如代谢协作、竞争或捕食。...

一种用于制备样本以观察菌丝上生物膜形成细菌的方法

本视频演示了一种免疫染色技术，用于定位植物组织中的阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）和果胶。经过固定并包埋在树脂中的植物组织切片，使用针对AGP和果胶的特异性一抗、荧光标记的二抗以及一种纤维素结合型荧光染料进行染色，以揭示它们在细胞壁中的组织特异性共定位情况。...

植物组织中阿拉伯半乳聚糖蛋白和果胶的免疫定位

植物细胞壁的组成因组织类型而异，可能包含木质素、纤维素、半纤维素和果胶。已有多种染色技术被开发用于在细胞类型水平上观察这些差异。本文汇编了常用的细胞壁染色技术。...

组织化学染色 拟南芥 次生细胞壁组分

活性荧光染料是现代真菌细胞生物学中活细胞成像分析的重要工具。本文详细介绍了已知及较少使用的荧光染料在丝状真菌中用于追踪质膜动态、内吞/外排作用以及细胞壁形态发生的应用方法。...

膜和细胞壁选择性荧光染料在丝状真菌活细胞成像中的应用

本方案详细描述了用于阿拉伯半乳聚糖蛋白和果胶免疫定位的植物材料如何进行固定、包埋于亲水性丙烯酸树脂中、切片并载于玻片上。我们将展示如何利用特异性抗体检测细胞壁相关的表位。...

植物组织细胞壁中阿拉伯半乳聚糖蛋白和果胶的荧光免疫定位

本实验方案描述了两种物种——Zea mays 和 Festuca rubra 根部丛枝菌根定殖模式与策略的评估方法。采用 MycoPatt...

菌根图谱作为探索红羊茅（Festuca rubra）和玉米（Zea mays）根部定殖模式与真菌策略的工具

本实验方案旨在提供收集、固定和保存菌异养植物样品的详细步骤，并应用多种显微技术（如扫描电镜、透射电镜、光学显微镜、共聚焦显微镜和荧光显微镜），以研究菌根真菌在植物组织及经菌根真菌接种萌发的种子中的定殖情况。...

用于解读菌根异养植物组织中真菌定植及种子共生萌发的显微技术

由于土壤不透明，其内部微生物组分之间的相互作用难以在细胞分辨率下直接观察。本文介绍了两种微流控工具，为研究真菌-微生物相互作用提供了新的机会。这些装置用途广泛且操作简便，能够实现高时空控制，并在细胞水平上进行高分辨率成像。...

用于在细胞水平上探究真菌-微生物相互作用的微流控工具

本文旨在提供详细的实验方案，用于分离植物相关内生真菌、长期保存分离物、形态学表征，以及提取总DNA，以用于后续的分子鉴定和宏基因组分析。...

分离、鉴定及全基因组DNA提取以鉴定菌根异养植物中的内生真菌

本报告介绍了培养和实验操作单细胞链型植物藻类Penium...

实验筛选方案、免疫细胞化学及基于显微镜的成像技术在Penium margaritaceum中的应用

学习使用双重染色法检测咖啡叶片中的果胶，以研究植物与真菌的相互作用。该方法利用棉蓝和钌红染色，在普通光学显微镜下清晰识别真菌菌丝和吸器结构，无需昂贵设备即可诊断咖啡锈病等生物营养型和死体营养型真菌病害。

双重染色法检测植物-真菌互作中的果胶

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