角膜缘血管丛全圆烧灼治疗啮齿动物手术诱发的青光眼
February 15th, 2022
该协议的目的是表征一种基于角膜缘血管丛 360° 热烧灼的青光眼性神经退行性变性的新模型，诱导亚急性高眼压症。
我们开发了一种简单的方法，通过暂时的眼压升高来诱导稳健和进行性青光眼变性。这代表了研究青光眼病理生理学关键点的独特机会。这是一种易于学习、非侵入性、低成本和高度可重复的模型，能够使用减少每次实验动物数量的体内功能分析和短期实验设计。
视网膜和视神经是中枢神经系统的可评估部分，因此对这些结构的进行性损伤进行性建模可以为其他神经退行性疾病提供有价值的见解。为了测量实验眼和对侧对照眼的基线眼压或眼压，将麻醉的大鼠置于工作台上的腹侧褥疮位置，使得角膜表面很容易接触到眼压计的尖端。放置眼压计尖端，使其略微垂直接触中央角膜区域。
然后，按下测量按钮获取测量值。接下来，将大鼠置于立体显微镜下的轻微侧卧位，并以40倍放大倍率检查实验眼。在手术过程中，通过滴注一滴羧甲基纤维素钠或透明质酸钠来保持对侧对照眼润滑。
接下来，使用弯曲的镊子，轻轻地将实验眼球向前推，以暴露角膜缘周围 360 度的脉管系统。然后，用另一只手，使用低温眼科烧灼术，轻轻烧灼角膜周围的血管。注意不要烧灼角膜周边。
通过观察巩膜缘烧灼的小圆形痕迹的出现、角膜缘脉管系统的闭塞和手术眼的瞳孔散大来确认外科手术是否成功。手术后，如前所述，检查双眼术后即时眼压。然后，将滴眼用醋酸泼尼松龙滴于实验眼的前表面。
40 秒后，用眼科抗生素软膏代替。使用由非甾体抗炎药和抗生素软膏组成的局部药物对实验眼进行每日临床随访。对于光运动反应分析，将大鼠放在一个由四台计算机显示器组成的四边形平台上进行习惯化。
将红色十字准线光标保持在自由移动的大鼠眼睛之间的视频帧上，因为它指示虚拟圆柱体的中心。观察光运动反应，包括由旋转分级引起的大鼠头部和颈部的反射跟踪。最初，引入低空间频率的刺激，然后逐渐增加频率，直到不注意到跟踪运动。
为了记录模式视网膜电图，在麻醉大鼠后，小心地将活性电极插入角膜的颞周。此外，将参比电极插入同侧颞眦的皮下组织，将接地电极插入其中一个后肢。然后将大鼠放置在距离刺激屏幕 20 厘米的位置，监测信号基线，并按下采集系统上的分析按钮开始采集。
分离视网膜后，将它们转移到含有一毫升PBS的24孔培养板中，保持内视网膜朝上。用在PBS中稀释的0.5%非离子表面活性剂洗涤组织，使组织透化。然后，将组织和封闭溶液在室温下轻轻摇动孵育一小时。
在孵育过程中，制备Brn-3a一抗溶液并储存在4摄氏度下。组织阻断后，将视网膜在 200 μL 一抗溶液中以 4 摄氏度温和孵育 72 小时，轻轻摇动。接下来，用PBS清洗纸巾。
将组织在室温下在 200 微升二抗溶液中孵育 2 小时，然后用核复染溶液孵育 10 分钟进行荧光核染色。经过三次PBS洗涤后，使用两把小刷子将视网膜转移到玻璃显微镜载玻片上，保持玻璃体面朝上。将视网膜背侧象限放在显微镜载玻片上。
最后，将 200 微升抗淬灭封固剂涂在玻璃盖玻片上，并将其放在平坦的视网膜上进行显微镜分析。在共聚焦落射荧光显微镜下，使用 40 倍放大倍率物镜检查平面支架以估计视网膜神经节细胞。眼球摘除术后，切除视神经眶内部分的近端段，包括部分眼内部分。
然后，立即将样品放入装有 200 至 300 微升冷固定剂的小瓶或试管中。两小时后，用冷的100微摩尔二甲胂酸钠缓冲液洗涤组织。然后，在4摄氏度的1%四氧化锇和5纳摩尔氯化钙中轻轻摇动，将组织后固定一小时。
用冷二甲胂酸钠缓冲液洗涤三次后，用冷蒸馏水洗涤视神经碎片，然后孵育过夜，并在4摄氏度下用1%小便池醋酸盐洗涤。第二天，用水洗涤三次后，以增加丙酮浓度逐渐脱水组织。然后，进行三轮包埋和环氧树脂丙酮溶液，然后将组织包埋在纯环氧树脂中 24 小时。
第二天，将样品从试样载体中取出，并在 60 摄氏度下将它们转移到包埋模具中 48 小时。聚合后，使用超薄切片机切割视神经碎片的横向半薄切片。然后，收集切片并将其转移到显微镜载玻片上。
用甲苯胺蓝染色切片，并使用光学显微镜以100倍放大倍率成像。对于超微结构分析，执行超薄横截面并将它们收集在铜网格上。然后，用醋酸尿液和柠檬酸铅染色切片进行透射电子显微镜检查。
与对照组相比，全圆烧灼术在手术后立即诱导眼压升高。术后眼压在第1天达到峰值，并在第6天逐渐降低至基线水平。此外，分别使用光运动反射和模式性视网膜电图在行为和电生理学上评估视网膜功能。
手术后，两个参数都显示出两个不同的损伤阶段:第 3 天的急性期和第 30 天的继发性退行性变性阶段。与对照视神经相比，轴突计数和半薄横经视神经切片在术后逐渐减少。来自对照眼的视神经的透射电子显微照片显示密集的有髓纤维被薄的神经胶质细胞突和明显的轴突微管和神经丝隔开。
相比之下，在高眼压3天后，观察到一些退化的纤维，神经胶质细胞过程中的细胞质空泡化和神经胶质细胞核中的染色质凝聚。七天后，退化的轴突纤维和高渗神经胶质细胞过程增加。14天后，观察到与轴突中神经胶质细胞过程侵袭相关的视神经纤维的更多紊乱。
此外，视网膜神经节细胞的密度随时间推移而降低，主要集中在视网膜背侧和颞侧象限。在进行此手术时，尝试用烧灼尖端轻轻触摸角膜缘血管，保留脊髓周边并确保在巩膜缘周围观察到连续的烧灼痕迹。在此程序之后，可以应用多种方法，例如眼睛结构的功能生化和免疫组织化学评估以及其他可能承认青光眼生理病理学的方法。
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概述
本研究提出了一种新型青光眼神经退行性模型，通过360°角角膜缘血管丛的热凝，导致亚急性眼内高压。该模型允许研究青光眼的病理生理学，并利用了一种非侵入性、低成本的方法进行体内功能分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 眼科学
- 神经退行性
背景
- 青光眼是视神经退行性和视力丧失的重要原因。
- 了解其潜在机制可以帮助开发治疗策略。
- 该模型旨在研究视网膜和视神经的进行性神经退行性变。
- 该方法可重复，且需要的动物数量较少，提高了实验效率。
研究目的
- 建立一个用于研究青光眼的稳健模型。
- 研究眼内高压对视网膜和视神经完整性的影响。
- 使用各种评估技术分析神经元反应。
使用的方法
- 该模型涉及360°角角膜缘血管的凝，以诱导眼内压升高。
- 使用大鼠作为生物模型，进行手术以诱导眼内高压。
- 眼内压测量和视动反应评估是关键的方法步骤。
- 术后进行视网膜神经节细胞的组织学评估。
- 进行电生理记录，包括视网膜图形电图，以评估视网膜功能。
主要结果
- 该研究成功地展示了由于诱导的眼内高压而导致的视网膜和视神经退行性变。
- 关键发现包括眼内压的改变以及由视动反应证明的视觉功能的随后变化。
- 组织学分析确认了视网膜神经节细胞的丢失，证明了该模型的有效性。
- 电生理数据显示出明显的损害，表明青光眼损伤。
结论
- 这种新型模型为研究青光眼的病理生理学提供了一个有价值的平台。
- 研究结果为神经退行性过程提供了见解，不仅适用于青光眼，而且可能适用于其他神经系统疾病。
- 该研究为未来眼部和神经退行性疾病的治疗和干预策略研究奠定了基础。
常见问题
Executive Industry Relevance
Robust preclinical models of glaucoma are essential for de-risking neuroprotective strategies and validating targets implicated in retinal ganglion cell degeneration. The described full-circle limbal vascular plexus cauterization in rodents enables reproducible induction of subacute ocular hypertension, supporting predictive confidence in early-stage discovery and translational research. This model's in vivo functional and histological outputs facilitate portfolio triage and mechanistic interrogation of neurodegenerative pathways relevant to ophthalmic drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven interrogation of glaucoma pathophysiology and neurodegeneration mechanisms.
- Supports functional target validation by linking intraocular pressure elevation to retinal ganglion cell loss.
- Facilitates mechanistic de-risking through quantifiable, progressive optic nerve degeneration.
- Provides a platform for evaluating candidate neuroprotective interventions in a controlled setting.
Screening & Assay Development
- Delivers a standardized, reproducible model for downstream functional and histological assays.
- Enables quantitative assessment of visual function via optomotor response and pattern electroretinogram.
- Supports assay development for RGC quantification and optic nerve pathology.
- Allows for scalable, short-term experimental designs with reduced animal usage.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant endpoints by modeling progressive RGC and optic nerve degeneration.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of neuroprotective strategies.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on functional and structural readouts.
- Supports translational biomarker development through in vivo and ex vivo analyses.
Pipeline & Workflow Integration
This model integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational validation of ophthalmic drug candidates.
- Discovery Biology: Provides a platform for null hypothesis testing and pathway clarification in glaucoma research.
- Screening: Offers reproducible, quantitative outputs for functional and histological assay readiness.
- Analytics: Enables statistical comparison of intraocular pressure, RGC counts, and optic nerve pathology across conditions.
- Translational Research: Supports alignment with clinical endpoints and biomarker strategies for neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable, standardized model for diverse neuroprotective and mechanistic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in glaucoma target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of preclinical workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling robust early de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of ophthalmic and neuroprotective assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent ocular surgery and functional vision assessment.
- Needs access to tonometry, electrophysiology, and advanced microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization of surgical and analytical protocols for reproducibility.
- Adaptable to various rodent strains and experimental timelines with protocol optimization.
- Limitations include species-specific differences in ocular anatomy and disease progression.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:57
Ocular Hypertension Surgery and Clinical Follow-up
2:53
Optomotor Response Analysis and Recording of Pattern-Electroretinogram
4:04
Quantification of Retinal Ganglion Cell Somas
5:38
Examination of the Optic Nerve
7:33
Results: Characterization of Glaucomatous Neurodegeneration by Limbal Vascular Plexus Cauterization
9:26
Conclusion
