Name: 角膜缘血管丛全圆烧灼治疗啮齿动物手术诱发的青光眼 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 了解通过360度角膜缘血管丛烧灼术建立啮齿动物青光眼模型的方法。该技术可诱导亚急性眼内压升高，用于研究视网膜神经节细胞退化及青光眼病理生理学机制。

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我们感谢实验室技术人员 José；Nilson dos Santos、Daianne Mandarino Torres、José Francisco Tibúrcio、Gildo Brito de Souza 以及 Luciano Cavalcante Ferreira。本研究由 FAPERJ、CNPq 和 CAPES 资助。

所有操作均遵循视觉与眼科研究协会（ARVO）发布的《眼科与视觉研究中动物使用声明》，并经里约热内卢联邦大学健康科学中心动物实验伦理委员会批准（方案编号 083/17）。本研究使用了2-3月龄、体重180-320 g的Lister Hooded大鼠，雌雄均有。然而，该操作可适用于不同品系及不同年龄范围的大鼠。
1. 眼压升高手术及临床随访
<ol>
	<li>在受控温度环境和12小时光照/黑暗循环（上午6点开灯，下午6点关灯）条件下饲养实验动物，提供标准颗粒状γ射线辐照饲料（Nuvilab® CR-1，Quimtia S/A，巴西）和经过三重过滤（含无毒活性炭）的饮水 随意摄取.</li>
	<li>配制一种麻醉剂储备混合液，由三份10%盐酸氯胺酮和一份2%盐酸赛拉嗪（溶剂：无菌水）组成。</li>
	<li>轻轻抓住动物背部皮肤以固定，并通过以下方法诱导麻醉&#160;按每克体重1 µL的剂量腹腔注射混合物（氯胺酮：75 mg/kg；赛拉嗪：5 mg/kg）。约5分钟后通过夹趾反应检查麻醉效果。</li>
	<li>使用0.5%盐酸丙美卡因滴眼液对双眼表面进行局部麻醉。等待30-60秒后，用无菌小棉签轻轻接触鼻侧或外侧球结膜，清除眼球前部残留的溶液。</li>
	<li>将动物置于实验台面上的仰卧位，使其角膜表面易于接触眼压计探头，测量实验眼及对侧对照眼的基础眼压。</li>
	<li>使用压平式或回弹式手持眼压计（图1A将眼压计探头置于与角膜中央区垂直的位置，使其轻微接触角膜。获取3至5次可靠的仪器自动平均值。每次平均值由设备在完成六次成功的单次测量后自动计算得出。
	<ol>
		<li>将回弹式眼压计装入探针，将设备尖端朝上放置，然后按一次测量按钮以开机，以避免探针脱落。开机后，显示屏将显示 00&#160;表明设备已准备就绪，可以进行测量。</li>
		<li>将设备置于探头尖端距离角膜1-4 mm的位置，快速而小心地按下测量按钮进行测量，过程中不得移动设备。每次成功测量均会发出短促的蜂鸣声提示，完成六次测量后，设备屏幕将显示平均值。 
		注意：尽管压平式眼压计使用经验丰富，但作者建议采用回弹式眼压计以优化整个操作流程，后者更易于获得可靠的眼内压测量值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将动物置于体视显微镜下稍呈侧卧位，于40倍放大下观察实验眼，仔细规划手术方案。操作过程中切勿忘记通过滴加羧甲基纤维素钠或透明质酸钠滴眼液，保持对侧对照眼的湿润。</li>
	<li>借助弯钳，轻柔地向前推动实验眼球，以暴露围绕角膜缘360°的血管网络13用另一只手，使用低温眼科电灼器（1,300 °F；Bovie Medical, USA）轻轻烧灼角膜周围的所有血管（图1B-). 
	注意：所述电灼器具有圆形尖端，应纵向接触角膜缘血管。</li>
	<li>注意避免烧灼角膜周边部，因为这可能导致术后角膜混浊，从而妨碍后续观察 体内 视网膜功能评估</li>
	<li>观察手术眼巩膜缘出现的小圆形烧灼痕迹、角膜缘血管闭塞以及瞳孔散大，这些是手术成功的标志。 
	注意：由于大鼠和小鼠的角膜缘血管结构在解剖学上相似13,24&#160;并且所使用的电灼器具有轻柔的细小尖端，该方案也可直接用于小鼠眼睛，无需任何调整。</li>
	<li>术后检查双眼的眼压，方法如步骤1.5所述。</li>
	<li>滴加一滴眼用醋酸泼尼松龙（1.2 mg/mL），使其与实验眼的前表面接触约40秒，随后更换为抗生素眼膏（盐酸土霉素30 mg/g加多粘菌素B 10,000 U/g；或环丙沙星3.5 mg/g）。术后给予盐酸曲马多肌肉注射（单次剂量；2 mg/kg）以预防疼痛。</li>
	<li>密切观察动物从麻醉中的恢复情况，最好在温暖的环境中进行，例如使用加热垫，或将其置于铺有适当垫料的饲养笼内。注意观察其呼吸模式。</li>
	<li>每天对实验眼进行临床随访，使用局部药物治疗，包括非甾体抗炎药（NSAID，例如酮咯酸氨丁三醇0.5%滴眼液）和抗生素眼膏（ preferably 与术后立即使用的相同）。 
	注意：建议使用非甾体抗炎药（NSAID）而非甾体类抗炎眼药水，因为后者可能诱发眼压升高，且常用于啮齿类动物糖皮质激素诱导性青光眼模型的建立。
	<ol>
		<li>在轻度镇静（氯胺酮：18.75 mg/kg；赛拉嗪：1.25 mg/kg）条件下，优先选择每天相同时间段测量眼内压（IOP），以避免因生理性昼夜节律性眼内压波动而产生偏差。</li>
		<li>在眼部检查期间，需注意罕见的临床并发症，如前房积血、角膜纤维化或与葡萄膜脱出相关的巩膜变薄。角膜水肿、结膜水肿和结膜充血较为常见，但为暂时性表现。</li>
		<li>术后约第7天可见完全的临床恢复。角膜缘血管重建通常在术后前两天开始，与眼压预期逐渐恢复至基线水平相一致。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 视动反应（OMR）分析
注意：本实验步骤使用了特定系统25。
<ol>
	<li>将四台计算机显示器排列成四边形，围成一个中央带有平台的实验区域。在显示器上显示一个虚拟圆柱体的图像，该圆柱体具有垂直方向的正弦波光栅（交替的黑白条纹），并以恒定速度（12度/秒）和对比度（100%）绕平台旋转。</li>
	<li>在平台正上方放置一台摄像机，以便实验者观察动物的运动。实验在明视觉条件下进行，并将软件优先设置为手动/独立模式，以分别评估每只眼睛的反应。</li>
	<li>让动物在平台上适应约2分钟。在动物自由活动时，将视频画面上的红色十字准星光标保持在其两眼之间，该光标指示虚拟圆柱体的中心位置（图1G）25。</li>
	<li>观察由旋转光栅诱发的动物头部和颈部的反射性追踪行为，即视动反应（OMR）。通过分别顺时针和逆时针旋转正弦波光栅的方向，测试左侧和右侧的视觉通路。
	<ol>
		<li>首先呈现低空间频率的刺激（0.042 周/度），然后逐步增加频率，直至不再观察到追踪运动。能够引发清晰视动反应的最高空间频率即为被测眼的阈值空间频率。</li>
		<li>若动物在测试过程中从平台上掉落，应立即将其放回平台并继续测试。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 图形视网膜电图（PERG）的记录
注意：视网膜电图采用特定的信号处理系统以及用于波形存储和分析的相关软件进行记录。
<ol>
	<li>通过肌内注射盐酸氯胺酮和盐酸赛拉嗪（分别为 75 mg/kg 和 5 mg/kg）使动物深度麻醉。深度麻醉（外科麻醉平面）可减少检查过程中因不自主肌肉运动或其他噪声源引起的伪迹。通过夹捏足趾观察有无反应来确认麻醉效果是否充分。 
	注意：上述麻醉剂不会影响反应幅度26。由于将插入角膜的小针作为活性电极，因此优先选择肌内麻醉而非腹腔注射，因为若大鼠需要追加剂量（初始剂量的一半）时，肌内注射更易于重复给药，且电极位置变动的可能性较低，从而在整个实验过程中（可持续长达 60 分钟）获得更可重复的记录。</li>
	<li>使用 0.5% 盐酸丙美卡因滴眼液对角膜进行局部麻醉，并用眼科润滑剂保持对侧眼的湿润。</li>
	<li>将活性电极（不锈钢针，0.25 mm × 15 mm）小心插入角膜颞侧周边部。同时，将参考电极和接地电极（不锈钢针，0.4 mm × 37 mm）分别插入同侧眼外眦的皮下组织和一只后肢中（图 1I）。</li>
	<li>进行模式视网膜电图（PERG）时，设置刺激为黑白翻转的棋盘格图形，以每秒 15 次翻转的频率交替，平均亮度保持恒定（250 cd/m²）。将带通滤波器设置为 1 Hz–100 Hz。 
	注意：快速翻转刺激可产生稳态 PERG，这是一种稳定且可重复的正弦波形，包含了最可能与视网膜神经节细胞（RGC）生物电反应相关的波组成分，即瞬态 PERG 中的 NII 偏转。</li>
	<li>将动物置于距刺激屏幕 20 cm 处（LCD 显示器，0.58 m；&#160;图 1I），监测信号基线，然后按下采集系统上的&#160;分析&#160;按钮开始 PERG 信号采集。&#160;</li>
	<li>在操作过程中，保持动物适应环境光照（约 140 lux 的白光）。本实验中，以随机顺序呈现六种不同的空间频率（单位：周/度：0.018、0.037、0.073、0.146、0.292、0.585）。 
	注意：用于信号处理的软件会自动进行平均化处理。通常对 200–300 个独立波形进行平均即可有效突出于背景噪声，从而用于分析波幅。</li>
</ol>
4. 视网膜神经节细胞胞体的定量分析
注意：以下步骤用于基于视网膜平铺切片的免疫组织化学染色，通过针对脑特异性同源盒/POU结构域蛋白3A（Brn3a）的抗体对标记的视网膜神经节细胞胞体进行定量分析。
<ol>
	<li>对实验动物实施颈椎脱位法安乐死，操作前应&#160;通过吸入二氧化碳诱导意识丧失。</li>
	<li>安乐死后立即在体视显微镜下用有齿镊和弯头剪刀解剖双眼。</li>
	<li>仔细解剖，使眼外肌的远端部分和泪阜仍附着于眼球，因其为视网膜地形定位的重要解剖标志（见步骤4.5）。尽量保留尽可能长的一段与眼球相连的视神经，以供后续分析使用。</li>
	<li>摘除眼球后，将眼睛置于含有1 mL 4%多聚甲醛（4% PFA）的0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）中，固定24小时以确保充分的化学固定。</li>
	<li>将视网膜与其余眼组织分离。
	<ol>
		<li>在解剖显微镜下，将眼球置于盛有1×PBS的培养皿中，并注意重要的解剖标志，如鼻侧泪阜、脉络膜裂和涡静脉的巩膜压迹，以确保正确的位置定向。27.</li>
		<li>使用有齿镊和弯剪（Westcott）从角膜中央穿入前房。在巩膜的上方（背侧）做两个朝向视神经巩膜孔的放射状切口，以界定眼球的背侧象限。</li>
		<li>在巩膜角膜缘处沿纵向进行360°环形切割，将角膜与眼球其余部分分离。移除晶状体和虹膜，并利用上述步骤（4.5.2）所述的相同巩膜放射状标记界定背侧视网膜象限。</li>
		<li>小心地将视网膜组织从脉络膜和巩膜上分离，避免在组织中造成随机撕裂以及最终丧失拓扑定位方向。</li>
		<li>将睫状体与视网膜分离 锯齿缘使用弯头无齿镊和弯头剪刀（牵拉玻璃体并在内界膜附近进行分离）以及小毛刷，仔细去除视网膜杯中残留的玻璃体。 
		注意：去除玻璃体是获得强而清晰的免疫组织化学信号的重要步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将分离的视网膜转移至24孔培养板中（每孔一个视网膜），每孔加入1 mL 1×PBS，保持视网膜内层朝上。</li>
	<li>用含0.5%非离子型表面活性剂的1×PBS（0.3 mL）洗涤组织3次，每次10分钟，以进行透化处理。随后将组织置于含有5%牛血清白蛋白（BSA）、2%非离子型表面活性剂和1×PBS的封闭液（0.25 mL）中，室温下轻轻振荡孵育60分钟。</li>
	<li>在步骤4.7中，将Brn3a一抗按1:200比例溶于含0.5%非离子型表面活性剂和5% BSA的1x PBS溶液中，配制抗体工作液，并于4 °C保存。</li>
	<li>组织块制备60 min后，将视网膜置于4 °C、0.2 mL一抗溶液中孵育72 h，期间轻柔振荡。</li>
	<li>用1×PBS清洗组织3次，每次10分钟，然后将组织在含有5% BSA的1×PBS中稀释1:750的二抗溶液0.2 mL中，室温孵育2小时。</li>
	<li>此外，将组织在核复染溶液中孵育10分钟，以进行荧光核染色。最后用1×PBS（0.3 mL）洗涤3次，每次重复，完成免疫组织化学染色步骤。</li>
	<li>借助两把小刷子将视网膜转移至玻璃载玻片上，保持玻璃体面朝上。将背侧视网膜象限朝上放置于载玻片上（此前已在步骤4.5.3中划定边界）。再作两条朝向视神经头的放射状切口，以界定其余三个象限（鼻侧、腹侧和颞侧）。 
	注意：切割的尺寸并非固定不变。尺寸不应过短，以免影响视网膜在载玻片上有效展平；也不应过长，以免达到视神经孔并使所界定的视网膜象限完全脱离其余组织。</li>
	<li>最后，在玻璃盖玻片上滴加0.2 mL抗荧光淬灭封片剂，将其覆盖于平铺的视网膜组织上，用于显微镜观察。为评估视网膜神经节细胞（RGCs）密度，使用40x/1.3物镜在共聚焦落射荧光显微镜下观察平铺样品。</li>
	<li>对于视网膜的每个象限，拍摄八张照片：中央视网膜区两张（距视盘约0.9 mm），中周视网膜区三张（距视盘约2.0 mm），周边视网膜区三张（距视盘约3.7 mm），每只视网膜共拍摄32张照片。使用FIJI软件计数Brn3a阳性细胞，并估算平均细胞密度。</li>
</ol>
5. 视神经检查
<ol>
	<li>安乐死后摘除眼球（步骤 4.1–4.3），切取视神经眶内段近端部分（1–2 mm），包括部分眼内段，并立即将样本放入含有 0.2–0.3 mL 冷固定液（含 2.5% 戊二醛的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液，pH 7.4）的样品管中，固定 2 小时。 
	注意：以下视神经处理步骤均在步骤 5.1 的同一管中进行</li>
	<li>用冷的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液清洗材料 3 次，每次 5 分钟。在 4 °C 条件下，于含 1.0% 四氧化锇、0.8% 铁氰化钾和 5 nM 氯化钙的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（0.1–0.2 mL）中轻轻振荡后固定 1 小时。</li>
	<li>用冷的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液清洗视神经片段 3 次，每次 5 分钟，随后用冷蒸馏水清洗 3 次，每次 1 分钟。在 4 °C 条件下，将材料置于含 1.0% 醋酸铀的蒸馏水溶液中染色过夜（0.1–0.2 mL），并轻轻振荡。再用冷蒸馏水清洗片段 3 次。</li>
	<li>使用梯度丙酮溶液（每次 0.5 mL）逐步脱水：在冰浴丙酮中分别进行以下步骤：15% 丙酮，2 次，每次 7 分钟；30% 丙酮，2 次，每次 7 分钟；50% 丙酮，2 次，每次 7 分钟；70% 丙酮，2 次，每次 7 分钟；80% 丙酮，2 次，每次 7 分钟；90% 丙酮，2 次，每次 7 分钟；最后在室温下用 100% 丙酮处理 2 次，每次 15 分钟。</li>
	<li>进行 3 次渗透/包埋步骤，依次更换以下溶液：环氧树脂:丙酮 = 1:2（总体积 0.5 mL），室温处理 12 小时；环氧树脂:丙酮 = 1:1（总体积 0.5 mL），室温处理 12 小时；环氧树脂:丙酮 = 2:1（总体积 0.5 mL），室温处理 12 小时。最后在纯环氧树脂中室温渗透 24 小时。</li>
	<li>将样品从样品载体中取出，转移至包埋模具中，在 60 °C 下聚合 48 小时。使用超薄切片机对视神经片段进行横切，制备半薄切片（300–400 nm），收集切片并转移至显微镜载玻片上。用甲苯胺蓝染色，并在光学显微镜下以 100 倍放大倍数成像。</li>
	<li>进行超微结构分析时，制备超薄横切片（70 nm），将切片收集于铜网上，用醋酸铀和柠檬酸铅染色。在透射电子显微镜下观察切片。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

角膜缘血管丛烧灼术（LPC）是一种新型的术后小梁模型，其优势在于靶向易于接触的血管结构，无需结膜或腱膜分离17,28。与涡静脉烧灼模型（一种基于脉络膜静脉引流功能受损的著名高眼压模型）不同，在LPC模型中，由于角膜缘静脉位于房水外流通路的上游，静脉淤血不会影响眼内压升高。此外，该技术易于掌握且成本较低，主要需要低温热凝设备即可完成。更重要的是，该模型具有独特的高眼压诱导率和完全临床恢复率（&gt; 90%，如先前报道）23，从而减少了实验所需动物数量，并支持进行电生理学和行为学分析。最后，术后相对较短时间内即可观察到视网膜神经节细胞层和视神经均出现青光眼性退行性改变，适用于短期或中期实验设计23。未来仍需进一步研究以阐明全周角膜缘血管系统烧灼对各视网膜分层的具体影响。
手术方案中的关键步骤包括：（1）电凝针尖必须平行于血管轴轻轻接触巩膜缘；（2）在电凝过程中以及动物操作过...

医学文献将青光眼理解为一组异质性的视神经病变，其特征是视网膜神经节细胞（RGCs）及其树突、胞体和轴突进行性退化，导致视盘结构性凹陷（挖空）以及视神经功能恶化，若未得到有效控制，最终会因中断视觉信息从眼睛向大脑的传递而导致失明1。目前，青光眼是全球范围内不可逆性失明的最主要原因，预计到2040年将影响约1.118亿人2，因而严重影响患者的生活质量（QoL），并引发重大的社会经济问题3。
眼内压（IOP）升高是青光眼发生和进展最重要的、也是唯一可调节的危险因素。在多种类型的青光眼中，除正常眼压性青光眼（NTG）外，其余所有类型在疾病临床病程中的某个阶段均伴有眼内压升高。尽管在降低眼内压以减缓或阻止疾病进展方面已取得显著的临床和手术进展，患者仍可能因青光眼而丧失视力4,5。因此，深入理解该疾病复杂且多因素的病理生理机制，对于开发更有效的治疗方法至关重要，尤其是为视网膜神经节细胞（RGCs）提供神经保护。
在研究疾病机制的多种实验方法中，基于眼内压升高（OHT）的动物模型最接近人类青光眼。啮齿类动物模型尤其有用，因为它们&#160;成本低、易于操作&#160;，可进行遗传操作，寿命短，并具有与人类相似的眼部解剖和生理特征，例如房水的生成与引流6,7,8,9,10,11,12,13。目前使用的模型包括：向巩膜上静脉注射高渗盐水导致小梁网硬化14、前房注射微珠15&#160;或黏弹性物质16、涡静脉烧灼17、使用氩激光对小梁网进行光凝18、角膜缘周围缝扎19，以及使用与年龄相关的OHT转基因模型（DBA/2J小鼠）8。然而，现有模型存在一些已报道的缺陷，如侵入性强、术后角膜混浊、眼前段结构破坏、学习曲线长、设备昂贵以及术后眼内压（IOP）变异大等，因此亟需开发一种替代性OHT模型以克服这些问题20,21,22。
本方案确立了一种基于啮齿类动物角膜缘血管丛烧灼术（LPC）诱导高眼压（OHT）以模拟青光眼的新型手术方法23一种简便、可重复、易于操作且非侵入性的模型，可实现高效、低变异的眼压升高，并具有独特的高比例完全临床恢复，因而提供 在体 在每次实验中使用较少数量的动物即可完成功能评估。该手术技术可诱导出亚急性眼压升高，眼压在数天内逐渐恢复至基线水平，模拟了急性闭角型青光眼中所见的高血压发作。此外，该模型在眼压恢复后仍持续出现青光眼性神经退行性变，这对于研究在人类青光眼中即使眼压得到良好控制后仍发生的视网膜神经节细胞继发性退变的机制具有重要意义。

<table><tbody><tr><td>丙酮</td><td>Isofar</td><td>201</td><td>用于电子显微镜组织制备（步骤5）</td></tr><tr><td>视网膜电图用活性电极</td><td>Hansol Medical Co</td><td>-</td><td>不锈钢针，0.25 mm &amp;times; 15 mm</td></tr><tr><td>Anestalcon</td><td>Novartis Bioci&amp;ecirc;ncias S/A</td><td>MS-1.0068.1087</td><td>盐酸丙美卡因 0.5%</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Vetec</td><td>560</td><td>用于电子显微镜组织制备（步骤5）</td></tr><tr><td>低温精细尖烧灼器 10/盒</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA00</td><td>低温眼科烧灼器</td></tr><tr><td>Cetamin</td><td>Syntec do Brasil Ltda</td><td>000200-3-000003</td><td>盐酸氯胺酮 10%</td></tr><tr><td>DAKO</td><td>Dako North America</td><td>S3023</td><td>抗荧光淬灭封片剂</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28718-90-3</td><td>二脒基-2-苯基吲哚；蓝色荧光核复染剂；发射波长 452&amp;plusmn;3 nm</td></tr><tr><td>Ecofilm</td><td>Crist&amp;aacute;lia Produtos Qu&amp;iacute;micos Farmac&amp;ecirc;uticos Ltda</td><td>MS-1.0298.0487</td><td>羧甲基纤维素钠 0.5%</td></tr><tr><td>EPON 树脂</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>-</td><td>用于电子显微镜的环氧树脂，由四种试剂混合组成：Poly/Bed 812 树脂（货号#08791）；DDSA - 十二烯基琥珀酸酐（货号#00563）；NMA - 纳迪克甲基酸酐（货号#00886）；DMP-30 - 2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚（货号#00553）</td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16110</td><td>用于电子显微镜组织制备（步骤5）</td></tr><tr><td>Hyabak</td><td>Uni&amp;atilde;o Qu&amp;iacute;mica Farmac&amp;ecirc;utica Nacional S/A</td><td>MS-8042140002</td><td>透明质酸钠 0.15%</td></tr><tr><td>Icare Tonolab</td><td>Icare Finland Oy</td><td>TV02（型号）</td><td>手持式回弹式眼压计</td></tr><tr><td>驴抗小鼠 IgG 抗体 + Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31570</td><td>二抗溶液</td></tr><tr><td>23 英寸 LCD 显示器</td><td>Samsung Electronics Co. Ltd.</td><td>S23B550</td><td>型号 LS23B550，用于视网膜电图记录</td></tr><tr><td>LSM 510 Meta</td><td>Carl Zeiss</td><td>-</td><td>共聚焦落射荧光显微镜</td></tr><tr><td>Maxiflox</td><td>Crist&amp;aacute;lia Produtos Qu&amp;iacute;micos Farmac&amp;ecirc;uticos Ltda</td><td>MS-1.0298.0489</td><td>环丙沙星 3.5 mg/g</td></tr><tr><td>MEB-9400K</td><td>Nihon Kohden Corporation</td><td>-</td><td>视网膜电图记录系统</td></tr><tr><td>单克隆小鼠 IgG1 抗 Brn3a 抗体</td><td>MilliporeSigma</td><td>MAB-1585</td><td>Brn3a 一抗溶液</td></tr><tr><td>Neuropack Manager v08.33</td><td>Nihon Kohden Corporation</td><td>-</td><td>视网膜电图信号处理软件</td></tr><tr><td>Optomotry</td><td>CerebralMechanics</td><td>-</td><td>视觉运动反应分析系统</td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19100</td><td>用于电子显微镜组织制备（步骤5）</td></tr><tr><td>亚铁氰化钾</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>20150</td><td>用于电子显微镜组织制备（步骤5）</td></tr><tr><td>视网膜电图用参考电极和接地电极</td><td>Chalgren Enterprises</td><td>110-63</td><td>不锈钢针，0.4 mm &amp;times; 37 mm</td></tr><tr><td>二甲胂酸钠缓冲液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12300</td><td>用于电子显微镜组织制备（步骤5）</td></tr><tr><td>Ster MD</td><td>Uni&amp;atilde;o Qu&amp;iacute;mica Farmac&amp;ecirc;utica Nacional S/A</td><td>MS-1.0497.1287</td><td>醋酸泼尼松龙 0.12%</td></tr><tr><td>Terolac</td><td>Crist&amp;aacute;lia Produtos Qu&amp;iacute;micos Farmac&amp;ecirc;uticos Ltda</td><td>MS-1.0497.1286</td><td>酮咯酸氨丁三醇 0.5%</td></tr><tr><td>Terramicina</td><td>Laborat&amp;oacute;rios Pfizer Ltda</td><td>MS-1.0216.0024</td><td>盐酸土霉素 30 mg/g + 多粘菌素B 10,000 U/g</td></tr><tr><td>Tono-Pen XL</td><td>Reichert Technologies</td><td>230635</td><td>数字压平式手持眼压计</td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T3605</td><td>远红荧光核复染剂；发射波长 661 nm</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-19-5</td><td>非离子型表面活性剂</td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td>用于电子显微镜组织制备（步骤5）</td></tr><tr><td>Xilazin</td><td>Syntec do Brasil Ltda</td><td>7899</td><td>盐酸赛拉嗪 2%</td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td>-</td><td>用于手术和视网膜解剖的体视显微镜</td></tr></tbody></table>

啮齿类动物手术诱导青光眼的角膜缘血管丛全周电凝术

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

青光眼是全球导致失明的第二大原因，是一组具有异质性的眼部疾病，其特征为视神经结构损伤和视网膜神经节细胞（RGC）变性，通过中断视觉信息从眼睛向大脑的传递而导致视觉功能障碍。眼内压升高是最重要的危险因素；因此，研究人员已通过遗传或实验方法在啮齿类动物中建立了多种眼高压模型，以探究该疾病的病因与病理机制。在这些模型中，已报道存在若干局限性，例如手术侵入性强、功能评估不足、需要大量培训以及视网膜损伤程度变异较大。本研究描述了一种简单、低成本且高效的方法，通过低温对角膜缘血管丛——房水引流系统的主要组成部分——进行全周烧灼，从而在啮齿类动物中诱导眼高压。该新模型技术操作简便、非侵入性强、可重复性好，可产生亚急性眼高压，并伴随进行性RGC和视神经变性，且具有独特的术后临床恢复率，允许 体内 通过电生理学和行为学方法进行的功能研究。

定量变量以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。除眼压（IOP）动态在高眼压（OHT）组与对照组之间的比较（图1F）外，统计分析均采用双因素方差分析，随后进行Sidak多重比较检验。以p值 < 0.05为具有统计学显著性。
图1展示了全周角膜缘丛烧灼（LPC）模型的手术步骤，关键解剖标志包括360°热诱导的角膜缘血管消失，以及手术结束时患眼出现轻度至中度瞳孔散大。
在本系列131只大鼠中，全周角膜缘脉丛烧灼术（LPC）导致术后即刻眼压从基线水平的13.0 ± 0.2 mmHg升高至22.7 ± 0.4 mmHg。术后眼压峰值出现在术后第1天（25.3 ± 0.6 mmHg），随后逐渐恢复至基线水平，于第6周时达到稳定th 术后第几天（统计分析：采用 Holm-Sidak 法进行多重比较校正的多次 t 检验； 图1F）。角膜纤维化或...

本实验方案的目的是表征一种基于360°热凝烧灼角膜缘血管丛以诱导亚急性眼内高压的青光眼神经变性新模型。

青光眼是全球导致失明的第二大原因，是一组以视神经结构损伤为特征的眼部疾病……

我们开发了一种基于短暂眼内压升高的简单方法，可诱导出稳定且渐进性的青光眼退变。该方法为研究青光眼发病机制中的关键环节提供了独特的机会。该模型易于掌握、无创、成本低且具有高度可重复性，能够实现活体功能分析，并可在每项实验中使用较少数量的动物进行短期实验设计。视网膜和视神经是中枢神经系统中可评估的部分，因此对这些结构进行渐进性损伤建模可为研究其他神经退行性疾病提供重要见解。为测量实验眼及对侧对照眼的基础眼内压（IOP），将麻醉后的大鼠仰卧置于实验台面上，使角膜表面易于接触眼压计的探针尖端。调整眼压计探针位置，使其垂直轻触中央角膜区域。然后，按下测量按钮以获取测量数据。接着，将大鼠置于立体显微镜下，呈轻度侧卧位，并在40倍放大倍数下检查实验眼。在操作过程中，通过滴加一滴羧甲基纤维素钠或透明质酸钠，保持对侧对照眼的湿润。接下来，使用弯头镊子轻轻将实验眼球向前推，以暴露围绕角膜缘360度的血管系统。然后，另一只手使用低温眼科烧灼器，轻柔地对角膜周围的所有血管进行烧灼。注意避免烧灼角膜周边部。通过观察巩膜缘出现的小圆形烧灼痕迹、角膜缘血管闭塞以及手术眼瞳孔散大，确认手术成功。术后，按照之前所述方法检测双眼的即刻眼压。随后，向实验眼的前表面滴加一滴醋酸泼尼松龙眼药水。40秒后，换用眼科抗生素软膏。每天使用由非甾体抗炎药和抗生素软膏组成的局部药物对实验眼进行临床随访。进行视动反应分析时，将大鼠置于由四台电脑显示器围成的四边形平台上的平台上进行适应性训练。将红色十字准线光标保持在自由活动大鼠双眼之间的视频画面上，因为该位置指示虚拟圆柱体的中心。观察由旋转光栅刺激引发的大鼠头部和颈部的反射性追踪反应，即视动反应。最初使用低空间频率的刺激，然后逐步增加频率，直至不再观察到追踪运动为止。记录图形视网膜电图时，先将大鼠麻醉，然后将记录电极小心插入角膜颞侧周边部。同时，将参考电极插入同侧眼外眦皮下组织，接地电极插入后肢之一。随后将大鼠置于距离刺激屏幕20厘米处，监测信号基线，按下采集系统上的分析按钮开始信号采集。分离视网膜后，将其转移至含有1毫升PBS的24孔培养板中，保持内层视网膜朝上。用含0.5%非离子型表面活性剂的PBS溶液洗涤组织以进行通透处理。随后，在室温下轻轻振荡孵育组织与封闭液，持续一小时。孵育期间，配制 Brn-3a 一抗溶液并置于 4 °C 保存。组织封闭后，将视网膜置于 200 µL 一抗溶液中，于 4 °C 轻柔振荡孵育 72 小时。随后，用 PBS 清洗组织。将组织在200 µL的二抗溶液中室温孵育2小时，然后用细胞核复染溶液孵育10分钟以实现荧光核染色。经过三次PBS洗涤后，使用两把小刷子将视网膜转移至载玻片上，保持玻璃体面朝上。在载玻片上定位时，使视网膜的背侧象限朝上。最后，在玻璃盖玻片上滴加 200 微升抗荧光淬灭封片介质，并将其覆盖在平铺的视网膜样本上，用于显微镜分析。使用共聚焦落射荧光显微镜，以 40 倍物镜观察平铺样本，以估算视网膜神经节细胞数量。眼球摘除后，切除视神经眶内段的近端部分，包括部分眼内段。然后，立即将样品放入含有 200 至 300 微升冷固定液的小瓶或试管中。两小时后，用冷的 100 微摩尔/升二甲胂酸钠缓冲液洗涤组织。接着，在 4 摄氏度下，于含 1% 四氧化锇和 5 纳摩尔/升氯化钙的溶液中轻轻振荡，对组织进行 1 小时的后固定。用冰冷的二甲胂酸钠缓冲液清洗三次后，再用冰冷的蒸馏水洗涤视神经组织片段，随后在4°C条件下用1%醋酸铀溶液孵育过夜。次日，在用水洗涤三次后，用逐步递增浓度的丙酮溶液对组织进行脱水处理。然后，用环氧树脂-丙酮溶液进行三轮浸透处理，最后将组织置于纯环氧树脂中浸泡24小时以完成包埋。第二天，将样本从样品载体中取出，并转移至包埋模具中，在60摄氏度下放置48小时。聚合完成后，使用超薄切片机切割视神经片段的横切半薄切片。然后，收集切片并将其转移至显微镜玻片上。使用甲苯胺蓝对切片进行染色，并在光学显微镜下以100倍放大倍数观察并成像。对于超微结构分析，进行超薄横切切片，并将其收集于铜网上。然后，用醋酸铀和柠檬酸铅对切片染色，用于透射电子显微镜观察。与对照眼相比，全环形烧灼术在术后立即引起眼内压升高。术后眼内压的峰值出现在第1天，随后逐渐下降，至第6天恢复至基线水平。此外，分别通过视动反射和图形视网膜电图从行为学和电生理学角度评估了视网膜功能。术后，两个参数均显示出两个不同的损伤阶段：术后第3天出现的眼压升高急性期，以及术后第30天出现的继发性退变阶段。与对照组视神经相比，术后轴突数量及半薄横切面视神经切片均呈进行性减少。对照眼视神经的透射电子显微镜图像显示，髓鞘化纤维致密排列，由细薄的胶质细胞突起分隔，且可见明显的轴突微管和神经丝结构。相比之下，在眼压升高三天后，观察到少量变性的纤维、胶质细胞突起中的胞质空泡化以及胶质细胞核内凝聚的染色质。七天后，变性轴突纤维和高渗性胶质细胞突起有所增加。而在14天后，视神经纤维的紊乱更加明显，并伴有胶质细胞突起侵入轴突之间。此外，视网膜神经节细胞的密度随着时间的推移而降低，主要发生在视网膜的上方和颞侧象限。在进行该操作时，应尝试用烧灼头轻轻接触角巩膜缘血管，避免损伤睫状体周边部，并确保在巩膜缘周围均能观察到连续的烧灼痕迹。在完成该操作后，可应用多种方法进行后续分析，例如对眼部结构进行功能性生化和免疫组织化学评估，以及其他有助于阐明青光眼病理生理学机制的方法。

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角膜缘血管丛全圆烧灼治疗啮齿动物手术诱发的青光眼

青光眼是全球主要的致盲原因之一。眼内压升高是其主要危险因素。激光光凝诱导的眼高压是已确立的动物模型之一。本视频演示了如何通过氩激光光凝在大鼠中诱导眼高压。...

SD大鼠激光诱导慢性高眼压模型

诱导大鼠模型中眼内压升高

来源：Lani-Louzada, R.，等．大鼠手术诱导性青光眼的角膜缘血管丛全周烧灼术．J. Vis. Exp.

烧灼诱导眼内高压后视网膜神经节细胞胞体的定量分析

采用激光光凝法对小鼠眼睛的房水引流系统进行处理，以诱导慢性高眼压。激光处理后，眼内压（IOP）可升高并持续数月。通过视觉运动反应测试监测实验动物的视力和对比敏感度下降情况。...

一种表征视觉缺陷的激光诱导小鼠慢性眼压升高模型

青光眼的特征是视网膜神经节细胞受损。在动物模型中诱导青光眼可为研究该疾病提供重要线索。本文概述了一种在动物模型中诱导视网膜神经节细胞（RGCs）丢失的实验方法 体内 大鼠模型及用于分析的全层视网膜制备方法...

诱导青光眼的实验操作步骤 体内 大鼠模型与视网膜整体装片制备

以下文章提供了一种简便且可重复的技术，用于有效建立可持续的小鼠角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）模型。该动物模型可用于测试和比较针对角膜缘干细胞疾病治疗方法的有效性。...

一种建立小鼠角膜缘干细胞缺乏症的简易机械方法

通过在大鼠和小鼠中应用角膜缘环扎缝线诱导慢性眼压升高，导致视网膜神经节细胞出现与青光眼一致的功能性和结构性损伤。...

一种通过巩膜周缝合诱导大鼠和小鼠青光眼的模型

本文介绍了一种使用玫瑰红（rose...

视网膜静脉阻塞小鼠模型的优化以减少变异性的研究

本方案描述了一种在小鼠模型中诱导精确且可重复的角膜和角膜缘碱烧伤的方法。该方案的优点在于能够使损伤均匀地分布于曲率较高的小鼠角膜和角膜缘区域。...

采用打孔-角膜环钻技术在小鼠模型中诱导角膜和角缘碱烧伤损伤

本方案描述了小梁切开隧道小梁成形术（3T）——一种微创青光眼手术，包括小梁切开、施莱姆管（SC）扩张以及张力缝线植入，以恢复生理性房水外流，并附有一组非对照病例系列。...

小梁切开器隧道式小梁成形术（3T）：原发性开角型青光眼的分步手术方案

了解通过360度角膜缘血管丛烧灼术建立啮齿动物青光眼模型的方法。该技术可诱导亚急性眼内压升高，用于研究视网膜神经节细胞退化及青光眼病理生理学机制。

啮齿类动物手术诱导青光眼的角膜缘血管丛全周电凝术

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