Name: 土壤生物多样性中参与顽固性物质降解的真菌的分离与筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 了解从土壤样本中分离具有降解顽固性物质潜力的真菌菌株的方法，用于生物修复研究。该方案通过选择性培养基筛选和酶活性测定，评估真菌对石油烃和塑料的降解能力。

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我们感谢帕维亚大学高等博士培训学院（SAFD）以及索尔维格·托西教授为本工作提供了机会。

1. 从土壤中筛选能够降解难降解材料的真菌菌株
<ol>
	<li>抗生素溶液的配制。
	<ol>
		<li>将青霉素（50 mg/L）、链霉素（40 mg/L）、氯四环素（40 mg/L）、新霉素（100 mg/L）和氯霉素（100 mg/L）加入250 mL去离子无菌水中。</li>
		<li>在将氯霉素加入抗生素溶液之前，先将其溶解于3 mL浓度≥99%的乙醇中。</li>
		<li>将抗生素溶液置于磁力搅拌器上（不加热），并在溶液中放入磁力搅拌子搅拌10分钟。储存于4 °C条件下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养基的配制。
	<ol>
		<li>将1 g商品化腐殖酸、3.26 g Bushnell-Haas肉汤（BH）和15 g琼脂加入1 L去离子水中，于121 °C条件下高压灭菌20分钟（腐殖酸琼脂）。</li>
		<li>在超净工作台内将腐殖酸琼脂倒入培养皿中。</li>
		<li>将4 g木质纤维素、3.26 g BH和15 g琼脂加入1 L去离子水中，于121 °C条件下高压灭菌20分钟（木质纤维素琼脂）。</li>
		<li>在超净工作台内将木质纤维素琼脂倒入培养皿中。</li>
		<li>在超净工作台内，待培养基在培养皿中凝固后，使用带有0.2 µm滤膜的无菌注射器吸取1 mL抗生素溶液并加至已制备的平板上，以实现灭菌。</li>
		<li>使用无菌一次性L型涂布棒将抗生素溶液均匀涂布于平板表面，并在超净工作台内自然晾干。</li>
		<li>将20 g麦芽提取物肉汤和15 g琼脂加入1 L去离子水中，于121 °C条件下高压灭菌20分钟（麦芽提取物琼脂 - MEA）。</li>
		<li>在超净工作台内将MEA倒入培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>土壤取样及土壤稀释。
	<ol>
		<li>采集目标土壤样品，深度为10 cm，去除表层的植物、草和枯叶，并将其放入无菌聚乙烯袋中。</li>
		<li>到达实验室后，使用2 mm筛网对土壤进行过筛，去除根系和植物残渣。</li>
		<li>若无法立即进行后续分析，将过筛后的土壤样品储存于4 °C条件下。</li>
		<li>在超净工作台内，取1 g过筛土壤加入含有10 mL无菌去离子水的无菌15 mL离心管中（1 × 10-1稀释度），水平振荡30分钟。</li>
		<li>在超净工作台内，于悬液沉降前，用无菌移液器吸取1 mL的1 × 10-1稀释液转移至9 mL去离子水空白管中（1 × 10-2稀释度），充分涡旋混匀。</li>
		<li>于悬液沉降前，用无菌移液器吸取1 mL的1 × 10-2稀释液转移至9 mL去离子水空白管中（1 × 10-3稀释度），充分涡旋混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将土壤稀释液涂布于选择性培养基上。
	<ol>
		<li>在超净工作台内，使用带无菌吸头的微量移液器吸取100 µL的1 × 10-3稀释液，转移至腐殖酸琼脂培养皿上。每个样品至少涂布4至5个培养皿。</li>
		<li>使用无菌一次性L型涂布棒将稀释液均匀涂布于培养皿表面。</li>
		<li>在超净工作台内自然晾干10–15分钟。</li>
		<li>使用木质纤维素琼脂培养皿重复步骤1.4.1–1.4.3。</li>
		<li>于25 °C避光条件下培养，最长不超过15天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从选择性培养基上生长的真菌菌落分离至生长培养基。
	<ol>
		<li>从制备后第3天开始，每天检查所制备的选择性培养基培养皿中是否有真菌菌落生长，持续观察最多15天。</li>
		<li>检查所有存在的真菌菌落之间的相似性。如有必要，制备玻片并在光学显微镜下观察。 
		注：目标是分离尽可能多的真菌菌落，但必须避免从不同平板中反复分离相同的真菌菌株，因此该步骤非常重要。应寻找具有不同宏观和微观形态的菌落。</li>
		<li>在超净工作台或本生灯旁，用无菌接种针轻轻挑取所选真菌菌落的一小部分菌丝，将其转移至新的MEA培养皿中进行分离。 
		注：此步骤中操作需格外轻柔和精确，因为原始培养皿中可能存在其他真菌菌落，污染风险较高。若接种后的MEA平板上出现多个真菌菌株，则重复步骤1.5.3。</li>
		<li>于25 °C避光条件下培养7天。这些即为后续用于特定难降解物质降解测试的真菌菌株。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 难降解物质上的生长试验
<ol>
	<li>在凡士林上的生长试验。
	<ol>
		<li>将20 mL液体BH（3.26 g/L BH）转移至50 mL试管中，并在121 °C下高压灭菌20分钟。</li>
		<li>将7 mL去离子水转移至15 mL玻璃试管中，并向每支试管中加入若干块破碎的玻璃盖玻片碎片。</li>
		<li>在121 °C下高压灭菌20分钟。</li>
		<li>在超净工作台内，使用无菌移液器向每支50 mL BH试管中加入1 mL凡士林。保留部分仅含BH的试管作为阴性对照。</li>
		<li>在超净工作台内，使用无菌接种针从MEA平板（步骤1.5.3中制备）表面刮取选定真菌菌株的菌丝体，并将其转移至含有破碎盖玻片的15 mL玻璃试管中。</li>
		<li>将每支试管在涡旋振荡器上振荡2分钟，使破碎的盖玻片切割真菌菌落块，形成真菌悬液。</li>
		<li>向每支含凡士林的试管中接种200 µL真菌悬液。每种真菌菌株设两个重复。</li>
		<li>对于阴性对照，将200 µL真菌悬液加入仅含液体BH的试管中。此外，保留几支不含任何真菌接种物的凡士林试管，以检测培养基是否污染。</li>
		<li>将试管置于25 °C黑暗条件下培养，并在接种后15天和30天进行观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在废发动机油上的生长试验。
	<ol>
		<li>将3.26 g BH和15 g琼脂加入1 L去离子水中，于121 °C高压灭菌20分钟（BHA）。</li>
		<li>在超净工作台内将BHA倒入培养皿中。</li>
		<li>待其凝固后，向BHA培养皿中加入500 µL废发动机油，并使用无菌一次性L型涂布棒将其均匀涂布于培养基表面。</li>
		<li>使用从步骤1.5.3制备的平板上采集的菌丝体，对每种真菌菌株分别接种至废发动机油BHA平板上。操作时在本生灯火焰旁或超净工作台内进行，以防污染。每种真菌菌株设两个重复。</li>
		<li>对于阴性对照，仅接种不含废发动机油的BHA培养皿。此外，保留几块未接种任何真菌的废发动机油BHA培养皿，以检测培养基是否污染。</li>
		<li>将培养皿置于25 °C黑暗条件下培养，并在接种后15天和30天进行观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在塑料上的生长试验。
	<ol>
		<li>将200 µL真菌悬液（步骤2.1.5–2.1.6）加入96孔微孔板中。每种真菌菌株与塑料组合设三个重复。</li>
		<li>向每孔真菌悬液中加入10 mg不同类型的塑料粉末（聚对苯二甲酸乙二醇酯 - PET、聚氯乙烯 - PVC、高密度聚乙烯 - HDPE、聚苯乙烯 - PS、聚氨酯 - PUR）。</li>
		<li>对于阴性对照，不添加塑料粉末，而是向含真菌悬液的孔中加入200 µL灭菌BH溶液。此外，针对每种塑料粉末，另设一孔加入200 µL灭菌BH溶液和10 mg相应塑料粉尘，以检测培养基是否污染。</li>
		<li>将微孔板置于25 °C黑暗条件下培养，并在接种后15天和30天进行观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 定性酶学检测
<ol>
	<li>木质素降解酶定性比色检测。
	<ol>
		<li>将27 g马铃薯葡萄糖肉汤（PD）和15 g琼脂加入1 L去离子水中，在121 °C下高压灭菌20分钟（PDA）。</li>
		<li>待培养基稍冷却但仍为液态时，在超净工作台中加入没食子酸（5 g/L），并将培养基倒入培养皿中。</li>
		<li>用各真菌菌株接种PDA + 没食子酸平板，菌丝取自步骤1.5.3制备的平板。操作时在本生灯旁或超净工作台中进行，避免污染。</li>
		<li>设置阴性对照：制备仅含PDA（不含没食子酸）的培养皿，并接种各真菌菌株（每种菌株一个平板）；另准备一个含PDA + 没食子酸但不接种真菌的培养皿。</li>
		<li>将培养皿置于25 °C黑暗条件下培养，接种后7天观察结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>漆酶定性比色检测。
	<ol>
		<li>将27 g PD和15 g琼脂加入1 L去离子水中，在121 °C下高压灭菌20分钟（PDA）。</li>
		<li>待培养基稍冷却但仍为液态时，在超净工作台中加入愈创木酚（400 µL/L），并将培养基倒入培养皿中。</li>
		<li>用各真菌菌株接种PDA + 愈创木酚平板，菌丝取自步骤1.5.3制备的平板。操作时在本生灯旁或超净工作台中进行，避免任何污染。</li>
		<li>设置阴性对照：制备仅含PDA（不含愈创木酚）的培养皿，并接种各真菌菌株（每种菌株一个平板）；另准备一个含PDA + 愈创木酚但不接种真菌的培养皿。</li>
		<li>将培养皿置于25 °C黑暗条件下培养，接种后7天观察结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白酶定性检测。
	<ol>
		<li>通过向去离子水中添加K2HPO4 (1 g/L)、KH2PO4 (0.5 g/L)、MgSO4·7H2O (0.5 g/L)、MnCl2·4H2O (0.001 g/L)、CuCl2·2H2O (1.4 x 10-5 g/L)、ZnCl2 (1.1 x 10-5 g/L)、CoCl2·6H2O (2 x 10-5 g/L)、Na2MoO4·2H2O (1.3 x 10-5 g/L)、FeCl3·6H2O (7.5 x 10-5 g/L) 和明胶/蛋白胨 (0.02 g/L) 配制YES培养基。</li>
		<li>将YES培养基置于磁力搅拌器上（不加热），在培养基中放入磁力搅拌子搅拌10分钟。</li>
		<li>待所有盐类完全溶解后，将5 mL溶液转移至20 mL无菌玻璃小瓶中，并在121 °C下高压灭菌20分钟。</li>
		<li>阴性对照：准备若干含5 mL BH溶液的20 mL无菌玻璃小瓶，并在121 °C下高压灭菌20分钟。</li>
		<li>在超净工作台中，将每种菌株的真菌悬液（步骤2.1.5.–2.1.6.）各取200 µL接种至已灭菌的YES培养基小瓶中（每种真菌菌株至少设两个重复）。对每种真菌菌株，同时将200 µL相同真菌悬液加入BH灭菌小瓶中作为阴性对照。</li>
		<li>将小瓶置于25 °C黑暗条件下培养21天，每隔7天观察一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酯酶定性检测。
	<ol>
		<li>通过向1 L去离子水中添加蛋白胨（10 g/L）、NaCl（5 g/L）、CaCl2（0.1 g/L）和10 mL吐温80配制吐温80培养基。</li>
		<li>将吐温80培养基置于磁力搅拌器上（不加热），在培养基中放入磁力搅拌子搅拌10分钟。</li>
		<li>待所有成分完全溶解后，将5 mL溶液转移至20 mL无菌玻璃小瓶中，并在121 °C下高压灭菌20分钟。</li>
		<li>阴性对照：准备若干含5 mL BH溶液的20 mL无菌玻璃小瓶，并在121 °C下高压灭菌20分钟。</li>
		<li>在超净工作台中，将每种菌株的真菌悬液（步骤2.1.5.–2.1.6.）各取200 µL接种至已灭菌的吐温80培养基小瓶中（每种真菌菌株至少设两个重复）。对每种真菌菌株，同时将200 µL相同真菌悬液加入BH灭菌小瓶中作为阴性对照。</li>
		<li>将小瓶置于25 °C黑暗条件下培养21天，每隔7天观察一次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

土壤丰富的生物多样性是真菌的丰富来源，这些真菌具有多种代谢能力，其中一些可能成为生物修复的潜在候选者。选择性培养基试验（方案第1部分）是易于操作且有效的方法，可用于分离能够以天然复杂聚合物作为唯一碳源生长的真菌。真菌可产生胞外非特异性水解酶和氧化还原酶30，例如木质素降解酶漆酶和过氧化物酶31。这些酶可降解木质纤维素和腐殖酸，同时也可降解多种不同的异生物质，包括烃类、芳香族化合物和氯化有机化合物32。
所述方法产生的结果易于解读，且实施成本较低。这些特点使其可被非专业人员使用。然而，某些方面，如无菌操作和形态学鉴定，需要特别注意。例如，土壤悬液振荡30分钟（步骤1.3.4）是必要的，以使真菌孢子和繁殖体从土壤微结构中释放出来，并悬浮于溶液中。通过此方式，对土壤悬液进行稀释涂布，即可分离出最多种类的真菌菌株。对真菌菌株进行宏观和显微形态学鉴定，有助于区分不同菌株，避免重复分离同一真菌菌株。此外，保持无菌状态并防止微生物污染至关重要，因为其他活...

土壤是地球上生命的基本组成部分，也是许多生态系统的基础。土壤中的矿物质、有机质和微生物可被视为一个系统，它们之间存在着密切的关联与相互作用。这些化合物之间的相互作用对陆地过程、环境质量和生态系统健康具有重要影响1。土壤污染在全球范围内造成了严重的环境问题。农药、石油产品、塑料及其他化学品等难降解且有毒物质的随意、长期和过量施用，对土壤生态产生严重影响，并因此可能改变土壤微生物群落。土壤中的微生物群落由多种处于不同生理状态的生物组成，其中大多数为细菌和真菌。土壤中的许多污染物具有中长期稳定性，其持久性可能导致微生物进化出适应性机制，从而利用这些难降解物质作为营养源2,3。因此，这些微生物可被用于生物修复技术。
生物修复利用微生物及其酶来降解或转化废弃物，使其变为毒性较低或无毒的化合物，从而减轻污染的影响。古菌、细菌、藻类和真菌等多种生物均具有这种生物修复能力4。由于真菌具有独特的降解作用，因此在生物修复中尤为具有前景。它们通过菌丝网络攻击不同的底物，能够比其他微生物更有效地穿透土壤基质。此外，它们还能进入污染物难以清除的不可及孔隙5，并且能够在低湿度条件下存活6。更重要的是，真菌可合成多种非特异性酶系，通常用于降解纤维素、木质素和腐殖酸等天然难降解物质。在缺乏天然底物的情况下，这些酶仍可参与多种难降解污染物的降解，如烃类、塑料和农药7,8,9,10。因此，尽管已有许多真菌种类被报道具有生物修复能力，但目前对尚未深入研究的物种探索兴趣日益增加，以筛选可用于降解难降解污染物的候选菌种。目前已知具有生物修复特性的真菌主要属于子囊菌门11,12,13、担子菌门14,15&#160;和毛霉门。例如，青霉属（Penicillium）和曲霉属（Aspergillus）真菌已被广泛证实可降解脂肪族烃类13、多种塑料聚合物16,17,18、重金属19以及染料20。类似地，对担子菌如黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）和彩绒革盖菌（Trametes versicolor）的研究也揭示了它们在芳香烃13和塑料21等难降解物质氧化过程中的作用。另一类参与生物降解过程的真菌是接合菌，包括根霉属（Rhizopus spp.）、毛霉属（Mucor spp.）和坎宁安霉属（Cunninghamella spp.）22,23。其中，坎宁安霉属（Cunninghamella）能够氧化芳香烃类化合物，被认为是研究多种异源物质代谢产物解毒机制的模式生物13。
多种真菌酶参与了顽固性物质的主要降解过程24,25，例如酯酶、漆酶、过氧化物酶和蛋白酶。漆酶是一类含铜的氧化酶，在细胞内产生后被分泌到胞外，能够催化多种酚类和芳香族化合物的氧化反应。它们可降解邻位和对位二酚、含氨基的酚类、木质素以及含芳基的二胺类化合物26。过氧化物酶利用过氧化氢作为介体来降解木质素及其他芳香族化合物。存在多种不同的过氧化物酶，其中对降解有毒物质最具潜力的是木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶27。
酯酶和蛋白酶属于胞外酶或细胞外酶，这类酶在细胞外发挥作用，但仍与产生它们的细胞相连接。这些酶能够催化难降解的大分子物质水解为较小的分子。由于其底物特异性较低，这些酶在多种污染物的生物修复中可发挥关键作用，例如纺织染料、造纸和制浆工业及皮革鞣制过程中排放的废水、石油产品、塑料以及农药28,29,30。
已有多种用于筛选具有生物修复能力的真菌菌株的筛选方法被发表。例如，已有研究利用以秸秆为基础的琼脂培养基来筛选在多环芳烃（PAH）降解方面具有高潜力的白腐真菌31；也有研究将腐烂木材的小块放置于麦芽提取物琼脂（MEA）上以分离木材腐朽真菌32。然而，大多数已提出的方法仅针对特定活性筛选非常特定的真菌种类。本研究提出一种更广泛的方法，用于筛选具有更广作用范围的土壤真菌。该方法首先将土壤样品进行系列稀释后涂布于添加了腐殖酸或木质纤维素并混有抗生素的培养基上，以筛选出能够降解这些天然难降解物质的真菌。事实上，腐殖酸和木质纤维素由于具有极为复杂的分子结构，极难被生物降解，因此可作为检测真菌降解能力的优良指标33,34。随后，对初筛获得的真菌进一步进行筛选，以鉴定其是否具有降解特定污染物（如凡士林、废机油和塑料）的潜力。最后，通过定性酶学试验检测能够产生参与难降解物质生物降解过程相关酶类的真菌菌株。为此，开展蛋白酶和酯酶试验，同时使用没食子酸和愈创木酚作为漆酶及其他木质素降解酶产生的指示剂35,36。选择这些底物的原因在于，真菌将其氧化为棕褐色产物的能力与其具备木质素降解能力之间存在显著相关性37,38,39。
通过这些实验方案，可以直接从土壤样品中分离出具有高降解潜力和广泛作用谱的真菌菌株。这些真菌菌株的分离有助于寻找可用于生物修复的新候选菌株。

<table><tbody><tr><td>96 孔微孔板</td><td>Greiner bio-one</td><td>650185</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>VWR</td><td>84609.05</td><td></td></tr><tr><td>Bushnell-Haas 肉汤</td><td>Fluka</td><td>B5051</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Eurobio</td><td>GABCRL006Z</td><td></td></tr><tr><td>金霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0001451</td><td></td></tr><tr><td>CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>CuCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3279</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m 滤膜</td><td>Whatman</td><td>10462200</td><td></td></tr><tr><td>没食子酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7384</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Biosigma</td><td>VBS634</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 玻璃小瓶</td><td>SciLabware</td><td>P35467</td><td></td></tr><tr><td>愈创木酚</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5502</td><td></td></tr><tr><td>高密度聚乙烯 (HDPE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>434272</td><td></td></tr><tr><td>腐殖酸</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>53680</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>木质纤维素</td><td>/</td><td>/</td><td>经灭菌处理的生物乙醇生产废弃物</td></tr><tr><td>L 形涂布棒</td><td>Laboindustria S.p.a</td><td>21133</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>A.C.E.F</td><td>8235</td><td></td></tr><tr><td>麦芽提取物肉汤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70146</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;L 微量移液器</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>200&amp;nbsp; &amp;mu;L 微量移液器</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5005</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1651</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>新霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0401000</td><td></td></tr><tr><td>青霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1504489</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83059</td><td></td></tr><tr><td>聚对苯二甲酸乙二醇酯 (PET)</td><td>Goodfellow</td><td>ES306031</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Laboindustria S.p.a</td><td>21050</td><td></td></tr><tr><td>凡士林（液体石蜡）</td><td>A.C.E.F</td><td>009661</td><td></td></tr><tr><td>马铃薯葡萄糖肉汤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6685</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯 (PS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>331651</td><td></td></tr><tr><td>聚氨酯 (PUR)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GF20677923</td><td></td></tr><tr><td>聚氯乙烯 (PVC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81388</td><td></td></tr><tr><td>无菌离心管</td><td>Greiner bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 无菌玻璃小瓶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SU860051</td><td></td></tr><tr><td>1000&amp;nbsp; &amp;mu;L 无菌吸头</td><td>Gilson</td><td>F172511</td><td></td></tr><tr><td>200&amp;nbsp; &amp;mu;L 无菌吸头</td><td>Gilson</td><td>F172311</td><td></td></tr><tr><td>无菌聚乙烯袋</td><td>WHIRL-PAK</td><td>B01018</td><td></td></tr><tr><td>无菌注射器</td><td>Rays</td><td>5523CM25</td><td></td></tr><tr><td>链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-6501</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>使用过的发动机油</td><td>/</td><td>/</td><td>由意大利一家私营公司提供的碳氢化合物、发动机添加剂和金属的复杂混合物</td></tr><tr><td>50 mL 小瓶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33108-U</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0152</td><td></td></tr></tbody></table>

从土壤生物多样性中分离与筛选降解难降解材料的真菌

Isolation and Screening from Soil Biodiversity for Fungi Involved in the Degradation of Recalcitrant Materials

环境污染问题日益严重，鉴定参与生物修复过程的真菌是一项至关重要的任务。土壤中蕴藏着极为丰富的微生物多样性，是获取此类生物修复真菌的良好来源。本研究旨在通过多种筛选试验，寻找具有生物修复潜力的土壤真菌。采用以难降解物质作为唯一碳源的矿物培养基进行真菌生长试验。首先，将土壤稀释液接种于添加了腐殖酸或木质纤维素的矿物培养基平板上。对生长出的真菌菌落进行分离，并在不同底物上进行测试，包括复杂的烃类混合物（如凡士林和废机油）以及多种塑料聚合物粉末（PET、PP、PS、PUR、PVC）。在生长试验基础上，结合定性酶学检测，分析酯酶、漆酶、过氧化物酶和蛋白酶的产生情况。这些酶参与难降解物质的主要降解过程，所筛选真菌菌株若能组成型分泌这些酶，则具有应用于生物修复的潜力。本研究分离并测试了100多个菌株，发现多个具有较好生物修复潜力的菌株。综上所述，所描述的筛选方法是一种简便且低成本的从土壤中鉴定具有生物修复潜力真菌菌株的技术。此外，可根据实际需求，在基础培养基中添加其他难降解物质，从而针对不同污染物定制相应的筛选试验。

选择性培养基方法（方案第1部分）能够对土壤中丰富的生物多样性进行筛选，并选出具有高生物修复潜力的真菌。利用腐殖酸和木质纤维素培养基，分离出超过100株真菌。这些真菌可产生参与难降解天然物质生物降解的酶类，而这些天然物质的化学结构与许多污染物相似。然而，通过选择性培养基分离得到的真菌菌株仍需进一步筛选。具体而言，选择性试验用于分离能够降解腐殖酸和木质纤维素的菌株，生长试验则用于筛选能够以特定污染物作为唯一碳源生长的真菌，定性酶活性试验则用于描述其代谢活性。
生长试验主要针对真菌降解碳氢化合物（凡士林和废发动机油）以及塑料（PET、PVC、HDPE、PS、PUR）的能力。在试验中，每种物质均作为所选真菌菌株的唯一碳源。通过比较添加该物质的样品与仅含基本培养基（根据试验不同为BH或BHA）的对照样品之间的菌落生长差异，评估真菌利用这些物质的能力。结果采用定性评分标准进行描述（图1），评分范围从与对照组无生长差异（0），到低（+）、中（++）和高（+++）程度的生长差异。
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本文介绍了一种用于筛选土壤生物多样性中参与难降解材料降解的真菌菌株的实验方案。首先，分离能够在腐殖酸或木质纤维素上生长的真菌菌株，随后通过酶学实验以及对烃类和塑料等污染物的降解能力测试其活性。

环境污染是一个日益严重的问题，鉴定参与生物修复过程的真菌是一项重要任务。土壤中栖息着多种多样的真菌……

本方案具有重要意义，因为它能够直接从土壤样品中分离出具有高降解潜力的真菌菌株，作为生物修复候选菌株。该方案是一种低成本的筛选方法，用于寻找具有生物修复潜力的真菌。此外，其结果易于解读。由于该技术涉及微生物操作，必须在无菌条件下进行，使用超净工作台或本生灯以避免污染。首先，采集目标土壤样品，并使用2毫米孔径的筛网对土壤进行过筛，以去除根系和植物残渣。在超净工作台内，将1克过筛后的土壤加入无菌的15毫升离心管中。然后，加入10毫升无菌去离子水，制成10的负一次方稀释液。将试管水平振荡30分钟。在悬液尚未沉降前，用无菌移液管吸取1毫升10的负一次方稀释液，转移至含有9毫升去离子水的空白试管中，制成10的负二次方稀释液。充分涡旋混匀悬浮液。同样，从10⁻²稀释管中制备10⁻³稀释液。在选择性培养基上涂布土壤稀释液时，使用带无菌吸头的微量移液器吸取100 µL的10⁻³稀释液，转移至腐殖酸琼脂培养皿中。使用无菌一次性L形细胞涂布棒将稀释液均匀涂布于培养皿表面。制备四至五个这样的培养皿。同样，从10⁻³稀释管制备木质纤维素培养皿。将培养皿在室温下晾干10至15分钟，然后在25°C黑暗条件下培养15天。检查所有真菌菌落的形态相似性。如有必要，制备玻片并在光学显微镜下观察。在超净工作台或本生灯下，使用无菌接种针从菌落中轻轻取下菌丝体的一小部分，分离每种选定的真菌菌株。将分离出的菌落转移至新的麦芽提取物琼脂（MEA）培养皿中。将20毫升布什内尔-哈斯（BH）培养基转移至50毫升玻璃瓶中。将7毫升去离子水转移至15毫升的离心管中，并向每管加入碎玻璃盖玻片碎片。将离心管在121摄氏度下高压灭菌20分钟以进行灭菌。为检测在凡士林上的生长情况，于超净工作台内使用无菌移液器向每个50毫升BH离心管中加入1毫升凡士林。保留一些仅含BH的离心管作为阴性对照。使用无菌针头从MEA平板上挑取所选真菌菌株的表面菌丝，并将其转移至含有破碎盖玻片的15毫升玻璃离心管中。将离心管在涡旋振荡器上振荡两分钟，使破碎的盖玻片切割真菌菌落小块，形成悬浮液。向每管凡士林中加入200 µL菌悬液。每种真菌菌株设两个重复。阴性对照组中，将200 µL真菌悬液加入仅含BH培养基的试管中。同时，保留一支未接种真菌的凡士林试管，以检测培养基是否受到污染。将试管置于25°C黑暗条件下培养，并在接种后15天和30天进行观察。为检测在废机油上的生长情况，将500 µL废机油转移至BHA培养皿中，并将机油均匀分布。然后，通过从MEA平板上采集菌丝体，将真菌菌株接种到平板上。为检测真菌在塑料上的生长情况，将200 µL真菌悬液转移至96孔微孔板中。每种真菌菌株与塑料的组合设置三个重复。向每个含有真菌悬液的孔中加入10毫克不同的塑料粉末。对于阴性对照，向含有真菌悬液的孔中加入200微升BH培养基。此外，针对每种塑料粉末，另取一个孔加入200微升BH溶液和10毫克相应塑料粉尘，以检测是否存在污染。将平板置于25摄氏度避光条件下培养，并在15天和30天后进行观察。进行定性漆酶比色试验时，配制1升马铃薯葡萄糖琼脂（PDA），121摄氏度高压灭菌20分钟。灭菌后，待培养基冷却至仍保持液态时，在超净工作台中加入400 µL愈创木酚，混匀后倒入培养皿中。通过从MEA平板上采集菌丝，将真菌菌株接种至含愈创木酚的PDA平板。作为阴性对照，为每种真菌菌株准备不含愈创木酚的PDA平板，并另设一个仅含PDA和愈创木酚的平板。将平板置于25°C黑暗条件下培养，并在七天后观察结果。进行定性酯酶试验时，配制一升吐温80培养基。然后将培养基置于磁力搅拌器上，不加热，使搅拌子浸于培养基中。10分钟后，待所有成分完全溶解，将五毫升培养基转移至20毫升无菌小瓶中，并进行高压灭菌。向已灭菌的吐温80培养基小瓶中加入200微升真菌悬液。对于阴性对照，将5毫升经高压灭菌的BH培养基加入20毫升小瓶中，然后向该小瓶中加入200微升真菌悬液。将小瓶置于25摄氏度避光条件下孵育21天，每隔7天观察一次。评估了真菌菌株以凡士林、使用过的发动机油和塑料粉末作为唯一碳源在不同程度上生长的能力。通过比较对照BH培养基与含凡士林培养基中菌落生长的差异，评估真菌利用凡士林的能力。近75%的测试菌株能够利用凡士林作为其唯一碳源，其中21%表现出最大生长量。同时监测了仅含BHA以及存在发动机油条件下的平板生长情况。近90%的菌株能够在废发动机油上生长，其中39%表现出最大生长量。真菌菌落周围形成红棕色晕圈，表明漆酶及其他木质素降解酶的产量较高。约60%的真菌能够产生漆酶。此外，17%的菌株在愈创木酚培养基上菌落周围产生明显的深色晕圈。通过吐温80培养基中白色沉淀物的形成来评估酯酶活性。近60%的菌株表现出酯酶活性，其中13%表现出较强的沉淀形成能力。通过向最低培养基中添加目标难降解物质，该方案可被调整用于筛选能够降解任何污染物的真菌。

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科研

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Biology

生物学

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