用土壤微生物感染植物根系的接种策略

虽然无数微生物在植物根部定殖，但这些相互作用很难分析，因为它们发生在地下。为了促进这一点，该协议收集提供了用土壤传播的微生物接种植物根部的策略的概述。根接种是研究根部微生物相互作用的基础，并且通过使用以下技术，可以在分子，细胞学或组织学水平上研究相互作用。

我们解释了三种使用疣作为根入侵微生物的接种系统，以及模型植物拟南芥。然而，将这些方法转移到其他植物如番茄或油菜，以及其他根部微生物，例如有益的偶然性，是可能的。通过在PDB中培养菌丝体并诱导孢子化和Czapek葡萄糖汤，提前准备黄萎病接种物。

然后首先将高压灭菌的培养基倒入培养皿中。培养基硬化后，将培养皿重新包装在无菌塑料袋中，并将其倒置在4至10摄氏度的冰箱中过夜。用手术刀切除凝固培养基上三分之一处的感染通道。

切割时避免将液体或空气吸入琼脂培养基下方。接下来，使用无菌移液器吸头在切割的上表面上分布50至100个表面灭菌的拟南芥种子。将种子放在切好的琼脂表面与培养皿壁接触的角度，以便根部可以在它们之间生长。

关闭培养皿并用透气胶带密封，以便交换气体。将培养皿在四摄氏度的黑暗中保持两天进行分层，以确保同步和有效的发芽。然后将板垂直放置在架子中，并在长时间的白天条件下在生长室中生长植物。

9至11天后，当根部到达感染通道时，水平放置板并打开它们。然后将500微升新鲜收获的分生孢子黄萎病直接加入感染通道。通过添加500微升模拟溶液而不是孢子来制备控制板。

水平孵育对照板和孢子接种板，直到液体浸泡。然后合上盖子，用透气胶带密封板。用黑色纸盒覆盖根部，使根部和土生真菌变暗。

在生长室中垂直孵育板。在接种后的首选时间点进行分析。首先，将透明的500毫升塑料杯灭菌到70~75%乙醇浴中浸泡20分钟。

在层流罩中擦干杯子。将高压灭菌的培养基倒入塑料杯中。准备一个塑料层，其中有五个预制孔，一个大在中心，四个小孔在每个角落。

在固化之前将塑料层放在介质上。用手术刀将琼脂穿过预制的中心孔切开至约1.5厘米的深度。取出切好的琼脂以形成感染通道，以便以后添加真菌孢子。

用移液器尖端在四个较小的孔中轻轻划伤琼脂培养基，以中断凝固的皮肤。使用移液器吸头将种子放入较小的孔中。用第二个倒置塑料杯关闭塑料杯，并用透气胶带密封。

将植物保持在四摄氏度，在黑暗中三天进行分层。然后将杯子系统在生长室中孵育。要用黄萎病菌接种幼虫，在感染通道中加入一毫升分生孢子溶液。

对于对照，添加一毫升无菌四分之一MS培养基作为模拟溶液。在接种后的首选时间点进行分析。首先，以三比一的体积比彻底混合土壤和沙子，这有利于以后从根部清洗基质。

将混合物倒入高压灭菌袋中，在高压灭菌器中以80摄氏度蒸汽20分钟。用土沙混合物填充花盆，然后将其转移到托盘中。将水倒入托盘中，大约三分之一的花盆高度，以便均匀浸泡土壤 - 沙子混合物。

用水喷洒混合物，以确保湿启动条件。在每个花盆中播种三到四颗种子，彼此之间保持足够的距离。将它们保持在四摄氏度进行分层，在黑暗中三天。

让幼苗在长时间的白天条件下生长，定期浇水，然后选择大小和年龄相似的植物进行根浸接种。从花盆中取出土壤并挖掘根部。在水容器中轻轻清洗根部，并将玫瑰花花放在水外。

将根在含有黄萎孢子溶液或模拟溶液的培养皿中孵育60分钟。用潮湿的蒸汽灭菌土壤准备新花盆，没有沙子。使用移液器吸头在每个花盆的土壤中心打一个洞。

将根部直接放入孔中，并用土壤轻轻地重新填充孔，以避免对植物造成额外的压力。在长时间的日照条件下培育植物，并定期浇水。在接种后的首选时间点进行分析。

在基于培养皿的系统中，在拟南芥的根部观察到黄萎病的成功感染。接种后2天，与对照组相比，标记基因MYB51在感染根系中具有强烈的诱导性，QRTPCR分析证实。在基于杯子的系统中，在受感染植物的叶子中发现了大量的真菌DNA，如图所示，与接种12天后的模拟对照相比。

QRTPCR分析显示，拟南芥根系中标记基因MYB51的转录本丰度丰富。使用该系统，将黄萎病接种到其他模型植物物种。在油菜中，在根部接种后12天，在幼苗基部切割的茎段中可检测到真菌DNA。

在番茄茎中也检测到真菌DNA，表明病原体在植物内繁殖。采用土系接种后21 d，模拟处理的拟南芥植物的花环看起来健康绿色，而受感染植物的叶子呈淡黄色或坏死性，绿叶面积较小，表明感染成功。切开培养皿系统中的感染通道时要注意，以防止琼脂滑动。

应用基于土壤的系统，在重新盆栽时不要压缩根部周围的土壤，以避免对植物造成进一步的压力。在根系接种后，例如，可以进行致病性测试，基因表达分析，功能基因组学或农用化学品测试，从而为根部微生物相互作用和改善农业的工具提供新的见解。