Name: 用土壤微生物感染植物根系的接种策略 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 了解三种植物根系接种策略，用于研究土壤微生物与拟南芥根系的相互作用。该方法可应用于分子、细胞及组织学水平的根际微生物互作分析，并适用于番茄和油菜等其他植物。

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作者感谢 Tim Iven 和 Jaqueline Komorek 在这些方法早期研究中的贡献，感谢 Wolfgang Dröge-Laser 团队（德国维尔茨堡大学药物生物学系）为本研究提供所需的仪器和资源，同时感谢 Wolfgang Dröge-Laser 和 Philipp Kreisz（均来自维尔茨堡大学）对稿件的审阅与批评指正。本研究由&#34;Deutsche Forschungsgemeinschaft&#34;（DFG，DR273/15-1,2）资助。

1. 真菌培养及植物接种系统的培养基
<ol>
	<li>液体马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）：在耐热烧瓶中，将21 g/L PDB溶于超纯水中。</li>
	<li>液体察氏葡萄糖肉汤（CDB）：在耐热烧瓶中，将42 g/L CDB溶于超纯水中。</li>
	<li>用于培养皿接种系统的培养基：在耐热烧瓶中，将1.5 g/L Murashige和Skoog培养基（MS）与8 g/L琼脂溶于超纯水中。 
	注意：该培养基中避免添加糖类，否则接种后会导致真菌过度生长。</li>
	<li>用于塑料杯接种系统的培养基：在耐热烧瓶中，将4.4 g/L MS、0.2 g/L MgSO4、1 g/L KNO3、0.5 g/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）和6.0 g/L琼脂溶于超纯水中，并用5 M KOH调节pH至5.7。 
	注意：该培养基中避免添加糖类，否则接种后会导致真菌过度生长。</li>
	<li>¼ MS培养基：将1.2 g/L MS溶于超纯水中。</li>
	<li>使用高压灭菌锅对上述所有溶液进行灭菌。将玻璃烧瓶放入灭菌篮中，盖紧盖子，在121 °C和98.9 kPa条件下灭菌15分钟。</li>
</ol>
2. 植物种子表面的灭菌
注意：在播种拟南芥、油菜和番茄种子之前，始终使用以下方案对种子表面进行灭菌。
<ol>
	<li>将种子转移至一个 2 mL 离心管中，将该管放入容积为 5.8 L 的干燥器内。</li>
	<li>通过将 6 mL 33% 盐酸（HCl）加入 100 mL 12% 次氯酸钠（NaClO）水溶液中，在干燥器内产生氯气。</li>
	<li>立即盖紧干燥器盖子，使种子在氯气中孵育 3 小时。</li>
</ol>
3. 使用Verticillium孢子（无性繁殖产生的分生孢子）制备接种物
注意：培养V. dahliae（菌株JR2）的方法与培养V. longisporum（菌株Vl43）的方法相同17,18,19。确保所有器械和培养基均为无菌状态，所有操作均在超净工作台中进行，以保持接种物的无菌性。
<ol>
	<li>在500 mL锥形瓶中加入150 mL液体PDB培养基（步骤1.1），并添加500 mg/L头孢噻肟补充培养基。</li>
	<li>将甘油保存管中的Verticillium分生孢子接种至PDB培养基中，用无菌泡沫塞封闭锥形瓶。</li>
	<li>将培养物置于暗盒中，室温（RT）下持续水平振荡（旋转摇床，60 rpm）培养7–10天，形成白色的小菌丝球。</li>
	<li>小心移除并弃去PDB上清液，大部分菌丝应保留在锥形瓶中。</li>
	<li>向锥形瓶中的菌丝加入100 mL液体CDB培养基（步骤1.2），并添加500 mg/L头孢噻肟补充培养基。</li>
	<li>继续在暗盒中室温下持续水平振荡（旋转摇床，60 rpm）培养4–5天以诱导产孢。随着分生孢子释放，上清液将变为黄灰色。</li>
	<li>取部分含孢子的液体（5–10 mL），经滤纸（颗粒截留能力为8–12 µm）过滤至无菌50 mL收集管中，以分离孢子与菌丝。</li>
	<li>使用血细胞计数板和显微镜测定孢子浓度，并用超纯水中无菌的¼ MS培养基稀释，直至达到下述孢子浓度。 
	注意：在显微镜下，V. longisporum的分生孢子多呈细长形，大小为7.1–8.8 µm，而V. dahliae的分生孢子较短（3.5–5.5 µm），近球形20。</li>
	<li>使用新鲜收获的分生孢子作为接种物。实验应始终使用新鲜收获的孢子，避免使用冻存菌种，因冷冻会显著降低可存活孢子数量19。</li>
	<li>如需长期保存，将孢子配制成高浓度孢子悬液（约1 × 108 个孢子/mL），加入25%甘油后于-80 °C冻存（可保存长达1年）。后续实验中，可用此甘油保存菌种接种步骤3.2中的PDB培养基。</li>
</ol>
4. 无菌的 体外 基于培养皿的接种系统
注意：对于培养皿系统17，需确保所有设备和培养基均为无菌，并且所有操作均在超净工作台中进行。
<ol>
	<li>高压灭菌后，将培养基（见步骤1.3）倒入培养皿中。</li>
	<li>培养基凝固后，将培养皿重新装入无菌塑料袋中，倒置存放于冰箱（4-10 °C。冷却的培养基有助于防止在后续步骤中培养基发生滑动。</li>
	<li>用解剖刀切下并移除感染通道及已凝固培养基的上三分之一部分（图1A）。切割时避免液体或空气进入琼脂培养基下方，否则培养基会滑动并闭合感染通道。</li>
	<li>用无菌移液器枪头将50–100粒表面灭菌的拟南芥种子均匀分散在切割后的培养基上表面。将种子置于切割后的琼脂表面与培养皿壁相交的夹角处，以便根在培养基与培养皿壁之间生长，这将有利于后续接种操作。</li>
	<li>关闭培养皿，并用透气胶带密封，以允许气体交换。</li>
	<li>在黑暗条件下层积处理2天后 4 °C，将培养板垂直放置于合适的支架中，并在适宜条件下培养植株 22 °C ± 1 °C 在人工气候室中，长日照条件（16 小时光照 / 8 小时黑暗）下培养。</li>
	<li>当大部分根系到达感染通道时（约9至11天大的幼苗），将培养皿水平放置，打开皿盖并加入 500 µL 新鲜收获的 Verticillium 分生孢子浓度为 4 x 105 将孢子/mL直接注入感染通道，确保液体在通道内均匀分布。</li>
	<li>类似地，通过添加制备对照平板 500 µL 使用模拟溶液（无菌的¼ MS培养基）代替孢子。</li>
	<li>将培养皿水平孵育几分钟，直至液体完全渗入，再次将培养皿垂直放置时无液体渗出。然后盖上皿盖，并用透气胶带密封。</li>
	<li>将培养皿垂直放置于生长室中孵育。可选步骤：用黑色纸盒覆盖根部，以遮蔽根系及土传真菌的光照（参见19).</li>
	<li>根据研究问题，在接种后的首选时间点进行分析（具体时间点参见图注）。以下是一些建议。
	<ol>
		<li>将叶片与根部分开剪切，并分别收获。从培养皿中取出琼脂条，以便于接触根部，然后用镊子小心地将根从琼脂中取出。立即将所有植物材料在液氮中速冻。
		<ol>
			<li>在液氮中研磨样品。从100 mg叶片材料中提取总DNA以进行测定 通过 定量PCR（qPCR）检测真菌DNA相对于植物DNA的含量（参见19).</li>
			<li>在液氮中研磨样品。取100 mg植物材料，提取总RNA。进行定量反转录PCR（qRT-PCR）以测定侵染期间植物基因（或真菌基因）的表达水平（参见19).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>小心地将根从琼脂中取出，避免损伤，并在荧光显微镜下观察。
		<ol>
			<li>确定植物报告基因系中标志基因的诱导情况（例如，荧光素酶、β-葡萄糖醛酸酶或荧光报告基因）17,19,21).</li>
			<li>通过使用真菌报告基因品系（例如 V. longisporum 组成型表达增强型绿色荧光蛋白， Vl-sGFP9）或通过染色技术（例如，使用5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺（X-beta-D-Glc-Nac））18).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 无菌的 体外 采用塑料杯组装的接种系统
注意：如该技术首次描述中所述19，确保所有设备和培养基均为无菌，并且所有操作均在超净工作台中进行。
<ol>
	<li>使用总体积为500 mL的透明塑料杯，并在70%-75%乙醇溶液中浸泡至少20 min以进行消毒。在超净工作台中将杯子晾干。</li>
	<li>将灭菌培养基（见步骤1.4）倒入塑料杯中。可选择性地向灭菌培养基中添加头孢噻肟（终浓度为50 mg/L），以防止细菌污染。拟南芥实验每杯使用150 mL培养基，较大植物物种（油菜、番茄）实验每杯使用250–300 mL培养基。</li>
	<li>在培养基凝固前，将一层塑料膜（已用70%-75%乙醇孵育20分钟灭菌）放置于培养基表面图1B). 
	注意：该塑料层在四个角上预制有孔，用于放置表面灭菌的种子，使种子能够接触培养基。之后，该隔离层可防止叶片与含真菌的培养基接触，从而避免微生物直接侵染叶片，迫使病原菌必须通过根部途径侵入。塑料层中央另有一个孔，用于切割形成侵染通道。</li>
	<li>当培养基凝固后，用解剖刀通过预制的中心孔切开琼脂，深度约为1.5 cm。移除切下的琼脂，以形成感染通道，便于后续加入真菌孢子。</li>
	<li>用移液枪头在四个较小的孔中轻轻刮擦琼脂培养基表面，以划破凝固的表层（这有助于种子从含水的琼脂培养基中吸水）。使用移液枪头将种子放入较小的孔中。</li>
	<li>用第二个倒置的塑料杯盖住塑料杯，并用透气胶带密封。胶带必须允许气体交换。</li>
	<li>在黑暗条件下分层处理3天后 4 °C，将杯式系统置于培养室中，在恒定温度下，拟南芥和油菜为12小时光照/12小时黑暗条件下培养，番茄为16小时光照/8小时黑暗条件下培养 22 °C 和60%湿度。</li>
	<li>按照建议的植株接种年龄进行操作：拟南芥为21天；油菜为5至7天；番茄为12天。</li>
	<li>接种植株 Verticillium 通过加入1 mL分生孢子溶液（推荐浓度：4 x 105 将孢子液（spores/mL）加入感染通道。制备对照样品时，向通道中加入1 mL不含孢子的模拟溶液（无菌¼ MS培养基）。</li>
	<li>根据研究问题，在接种后的首选时间点进行分析（具体时间点参见图注）。以下是一些建议。
	<ol>
		<li>使用数码相机从上方对植物进行拍照，保持每张照片的拍摄距离一致。量化叶面积（例如，使用 ImageJ22 或 叶片面积17,19；利用杯体长度设定比例尺，比较感染组与对照组。对病害症状的发展情况进行分类（如叶片变小、黄化或出现坏死）。 
		注意：如果拟南芥植株上有茎秆，需将其去除，以便获得更清晰的莲座状叶丛照片。</li>
		<li>去除根部，通过称重测定感病样本和对照样本地上部分的生物量（鲜重），并计算相对鲜重19.</li>
		<li>按照以下步骤采集用于分子分析的样本。</li>
		<li>拟南芥：若有茎则去除，从基部将莲座叶从根部切下。确保样品中不含有任何根部组织，并完整采集整个莲座叶。将来自不同植株的4–5个莲座叶合并为一个样品，用液氮速冻叶片材料。</li>
		<li>用镊子小心地将根从培养基中取出，用纸巾按压并轻拍以去除残留的琼脂，将来自不同植株的4-5条根合并为一个样品。立即在液氮中冷冻。</li>
		<li>油菜/番茄：从下胚轴切取茎段（例如，长度为1 cm；始终取自相同的茎区段）。每份样品合并4-5株植物的材料，并在液氮中速冻。</li>
		<li>在液氮中研磨样品。从100 mg叶片或茎组织中提取总DNA以进行测定 通过 qPCR检测真菌DNA相对于植物DNA的量（参见19).</li>
		<li>在液氮中研磨样品，取100 mg植物材料提取总RNA。通过qRT-PCR检测植株基因（或真菌基因）在侵染后的表达水平（参见19).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 基于土壤的盆栽接种系统
<ol>
	<li>将土壤与沙子按3:1（土壤:沙子）的体积比充分混合，以利于后续清洗根系表面的基质。将混合物倒入高压灭菌袋中。若混合物过于干燥，可加入适量水并混匀。蒸汽处理于 80 °C 在高压灭菌锅中灭菌20分钟，以尽量减少微生物污染。 
	注意：避免加热至超过 80 °C，因为这可能影响有机土壤中的养分。</li>
	<li>将土壤-沙子混合物装入花盆中，并将花盆放入托盘内。向托盘中加水至花盆高度的约1/3处，使土壤-沙子混合物充分吸水浸透。此外，使用喷雾瓶对基质进行喷水，以确保起始条件湿润。</li>
	<li>每个花盆中播种3-4粒种子（图1C）确保种子之间有足够的间距。将种子置于黑暗环境中培养3天，温度为 4 °C 用于分层处理以同步萌发。 
	注意：预先培养过量的植株，以便在接种实验中选择大小相似的植株，减少因个体差异导致的偏差。</li>
	<li>让幼苗在长日照条件下生长（16小时光照/8小时黑暗；恒定温度 22 °C；60% 湿度）并定期浇水。</li>
	<li>按照推荐的植物接种苗龄进行操作：拟南芥为21天，油菜为7天，番茄为10天。选择大小相近的植株进行“浸根接种”。15,17,23,24将土壤从花盆中取出，并小心地挖掘根部。</li>
	<li>轻轻在盛水容器中清洗根部，使莲座叶远离水面。将清洗后的根部置于含有溶液的培养皿中孵育60分钟 Verticillium 孢子溶液（推荐浓度：2 x 106 孢子/mL）。对于未感染的对照组，将根在不含孢子的模拟溶液（无菌¼ MS培养基）中孵育60分钟。</li>
	<li>准备装有湿润且经蒸汽灭菌土壤的新花盆（80 °C 20分钟）不加沙。用移液器吸头在每个花盆土壤的中心打一个孔。</li>
	<li>将根部直接放入孔洞中（每盆仅移栽一株植物）。插入根部后，需小心用土壤填满孔洞。避免按压土壤，否则换盆可能导致植株出现紫叶等胁迫症状。</li>
	<li>在长日照条件下培养感染组和对照组（16小时光照/8小时黑暗；恒定温度 22 °C；60% 湿度）并定期浇水。</li>
	<li>根据研究问题，在接种后的首选时间点进行分析（具体时间点参见图注）。以下是一些建议。
	<ol>
		<li>使用数码相机从上方拍摄植物照片，每次拍摄时保持相机与植物的距离一致。量化叶面积（例如，使用 ImageJ22 或 叶片面积17,19；使用花盆的直径设定比例尺，比较感染组与对照组。对病害症状的发展情况进行分类（如叶片变小、黄化或出现坏死）13. 
		注意：去除拟南芥的茎有助于拍摄莲座叶丛的照片。</li>
		<li>去除根部，通过称重测定感病样本和对照样本地上部分的生物量（鲜重），并计算相对鲜重19.</li>
		<li>或者，通过测量植株高度或对茎段上的真菌菌丝生长程度进行分级，以评估病害严重程度13.</li>
		<li>按照以下步骤采集用于分子分析的样品。</li>
		<li>拟南芥：去除茎部，从根茎处切下莲座叶，将来自不同植株的4-5个莲座叶组合为一个样品，用液氮速冻叶片材料。 
		注意：对于根部而言，若不通过清洗改变基因表达，很难将其从土壤中充分清洁。</li>
		<li>油菜/番茄：从下胚轴切取茎段（例如，长度为1 cm；始终取同一茎段区域）。将4-5株植物的材料合并为一个样品，液氮速冻。</li>
		<li>在液氮中研磨样品。从100 mg叶片或茎组织中提取总DNA以进行测定 通过 qPCR检测真菌DNA相对于植物DNA的量（参见19).</li>
		<li>在液氮中研磨样品，取100 mg植物材料提取总RNA。通过qRT-PCR检测植株基因（或真菌基因）在侵染后的表达水平（参见19).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
	<li>根据生物学重复实验计算平均值和标准差（± SD）。</li>
	<li>通过将感染组的所有结果除以对照组的结果来计算相对值。将平均值表示为例如“相对于模拟感染组”或“相对于野生型”。</li>
	<li>确定组间统计学显著性。</li>
</ol>
<img alt="植物病原体接种方法；实验装置A、B、C的示意图及qRT-PCR结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63446/63446fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：三种接种系统及其操作步骤的汇总。 这些图示以模式植物Arabidopsis thaliana为例展示各系统。对于其他植物种类，需调整实验时间。橙色框标示了各系统最推荐的后续分析方法。（A）在培养皿接种系统17中，倒入培养基并使其凝固，将培养皿于冰箱中放置过夜。随后用解剖刀切除上部三分之一以及感染通道（IC）（图示中白色区域为从琼脂中去除的部分，蓝紫色区域代表琼脂）。将种子置于切割后的表面，并盖上培养皿。经过春化处理后，将培养皿垂直放置，使植物生长。当大部分根系到达感染通道时，用移液器将孢子溶液直接加入通道中，确保溶液均匀分布。盖好培养皿，并在生长室中垂直培养。后续可进行的分析包括定量反转录PCR（qRT-PCR）表达分析、报告基因品系的显微观察以及微生物DNA的定量。（B）在塑料杯接种系统19中，倒入培养基后，将带有预制孔洞的分隔塑料层（四个角落的小孔用于放置种子，中央大孔用于形成感染通道）转移至其中。待培养基凝固后，用解剖刀切除中央孔中的琼脂以形成感染通道（IC）。在小孔处轻轻划破培养基表面，并接种种子。用倒置的杯子盖住容器，并用透气胶带（图中以黄色表示）密封。让植物生长。接种时，用移液器将孢子溶液直接加入感染通道中。封闭系统后，继续在生长室中培养。后续可进行的分析包括qRT-PCR表达分析、微生物DNA定量，以及鲜重、叶面积或其他病害特征的测定。（C）“根浸接种法”15,17,23,24：在基于土壤的接种系统中，用土壤与沙子的混合物填充花盆，播种后让幼苗生长。挖出大小相近的植株，并用水清洗根部。将洗净的根放入盛有孢子溶液的培养皿中。孵育后，将单株植物重新移栽至装有土壤的花盆中。后续可进行的分析包括叶片中的qRT-PCR表达分析、微生物DNA定量，以及鲜重、叶面积或其他病害特征的测定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63446/63446fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于土传植物病原体造成的产量损失巨大1，亟需改进耕作策略或作物品种。目前对土传病害致病机制的认识仍有限，这阻碍了抗性更强植物的培育。需要深入探究其潜在的致病机制，而这依赖于一个可靠的实验方法平台。已有报道的接种方法表明，通过结合多种系统，可有效解析根系-微生物相互作用中的多因素事件19。上述方案旨在为本领域的专家以及刚进入该领域的研究人员提供一套常规操作流程。该方法操作简便，可实现独立重复实验，且所需技术设备在标准的植物科学实验室中均具备。
在培养皿系统中可观察早期 Verticillium 感染事件（接种后数小时至6天），在基于土壤的系统中可观察晚期事件（&#62;21天），而在杯式系统中则可观察介于两者之间的时间段（4至21天）。将孢子加入培养皿系统的感染通道后，孢子可直接接触根部，从而便于检测早期防御反应。以MYB51的诱导为例，可通过基因报告系统、qRT-PCR，甚至全基因组范围的&#34;-组学&#34;方法轻松研究基因表达变化<sup cl...

自然土壤中栖息着数量惊人的微生物，它们对植物可能呈中性、有害或有益作用1。许多植物病原体为土传性，围绕在根部周围并侵袭地下器官。这些微生物属于多种不同的进化分支：真菌、卵菌、细菌、线虫、昆虫以及部分病毒1,2。一旦环境条件有利于感染，感病植物便会发病，导致作物产量下降。气候变化的影响，如全球变暖和极端天气，将增加土传植物病原体的比例3。因此，研究这些破坏性微生物及其对粮食和饲料生产乃至自然生态系统的影响将变得愈发重要。此外，土壤中还存在与根部密切互作并促进植物生长、发育和免疫能力的互利性微生物。当受到病原体侵袭时，植物可主动招募根际中特定的拮抗微生物，以抑制病原体从而支持宿主存活4,5,6,7。然而，有益根-微生物互作所涉及的分子机制和信号通路往往仍不清楚6。
因此，拓展对根系-微生物相互作用的普遍认知至关重要。为了开展模式研究并将研究成果转化为农业应用，必须建立可靠的根系接种土传微生物的方法。土壤中的有益互作可通过Serendipita indica（ formerly known as Piriformospora indica）、固氮的Rhizobium spp. 或菌根真菌进行研究；而常见的土传植物病原体则包括Ralstonia solanacearum、Phytophthora spp.、Fusarium spp. 和 Verticillium spp.1。后两者为全球分布的真菌属，可引起植物维管束病害2。Verticillium spp.（Ascomycota）可侵染数百种植物，主要为双子叶植物，包括一年生草本、木本多年生植物以及多种农作物2,8。Verticillium的菌丝从根部侵入，通过细胞间和细胞内途径向中柱延伸，定殖于木质部导管中2,9。在导管内，真菌度过其大部分生命周期。由于木质部汁液营养贫乏且含有植物防御物质，真菌必须适应这一特殊环境，这主要通过分泌与定殖相关的蛋白来实现，从而使病原菌能够在寄主中存活10,11。当真菌到达根部维管组织后，可沿木质部导管向顶传播至地上部分，导致寄主系统性定殖9,12。此时，植物的生长受到显著抑制9,10,13。例如，植株出现矮化、叶片黄化以及早衰等症状13,14,15,16。
该属中的一种是Verticillium longisporum，其对芸薹科寄主植物具有高度适应性，例如在农业上具有重要意义的油菜、花椰菜以及模式植物Arabidopsis thaliana12。已有多个研究结合V. longisporum与A. thaliana，深入揭示了土传维管束病害及其引发的根部防御反应13,15,16,17。利用V. longisporum / A. thaliana这一模式系统可实现简便的感病性检测，且两种生物均具备完善且易于获取的遗传资源。与V. longisporum亲缘关系较近的病原菌为Verticillium dahliae。尽管这两种真菌具有相似的维管束生活方式和侵染过程，但它们从根部向叶片扩展的效率以及在A. thaliana中引发的病害症状有所不同：通常V. longisporum诱导植株早衰，而V. dahliae感染则导致植株萎蔫18。最近一项方法学综述介绍了多种用于A. thaliana接种V. longisporum或V. dahliae的根部接种策略，有助于实验设计的规划19。在田间，V. longisporum偶尔会对油菜生产造成严重损害12，而V. dahliae的寄主范围非常广泛，包括葡萄、马铃薯和番茄等多种栽培作物8。这使得这两种病原菌均成为具有重要经济价值的研究模型。
因此，以下实验方案以V. longisporum和V. dahliae作为根部病原菌的模式生物，用以示范可能的根部接种方法。拟南芥（Arabidopsis thaliana）、油菜（Brassica napus）和番茄（Solanum lycopersicum）被选为模式寄主植物。各种方法的详细描述见下文文字及配套视频。文中讨论了每种接种体系的优缺点。综上所述，本套实验方案有助于针对根-微生物互作研究中的特定科学问题选择合适的方法。

<table><tbody><tr><td>琼脂（Gelrite）</td><td>卡尔·罗特</td><td>编号 0039</td><td>所有所述系统均需要 Gelrite</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;拟南芥&lt;/em&gt; 野生型</td><td>NASC 股票</td><td>Col-0 (N1092)</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌</td><td>Systec</td><td>VE-100</td><td></td></tr><tr><td>叶片面积</td><td>Datinf GmbH</td><td>&lt;em&gt;叶片面积&lt;/em&gt;</td><td>用于测定叶面积的软件</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Brassica napus&lt;/em&gt; 野生型</td><td>参见 Floerl &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;, 2008</td><td>快速循环油菜</td><td>基因组 ACaacc</td></tr><tr><td>头孢噻肟钠</td><td>Duchefa</td><td>C0111</td><td></td></tr><tr><td>奇卡内里烧瓶 500 mL</td><td>Duran Group / neoLab</td><td>E-1090</td><td>带四个挡板的锥形瓶</td></tr><tr><td>50 mL 收集管</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>114 × 28 毫米</td></tr><tr><td>Czapek 葡萄糖肉汤培养基</td><td>Duchefa</td><td>C1714</td><td></td></tr><tr><td>数码相机</td><td>尼康</td><td>D3100 18-55 VR</td><td></td></tr><tr><td>干燥器</td><td>Duran Group</td><td>200 DN，5.8 L</td><td>用盖子密封以容纳氯气</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Leica</td><td>Leica TCS SP5 II</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>卡尔·罗斯</td><td>P074.3</td><td></td></tr><tr><td>KNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>卡尔·罗斯</td><td>P021.1</td><td>&amp;ge; 99 %</td></tr><tr><td>KOH</td><td>卡尔·罗斯</td><td>6751</td><td></td></tr><tr><td>Leukopor</td><td>BSN medical GmbH</td><td>2454-00 AP</td><td>无纺布胶带 2.5 cm × 9.2 m</td></tr><tr><td>MES（2-(N-吗啉代)乙磺酸）</td><td>卡尔·罗斯</td><td>4256.2</td><td>Pufferan &amp;ge; 99 %</td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>卡尔·罗斯</td><td>T888.1</td><td>七水合硫酸镁</td></tr><tr><td>穆拉希吉 &amp;amp;Skoog 培养基（MS）</td><td>Duchefa</td><td>M0222</td><td>MS（含维生素）</td></tr><tr><td>NaClO</td><td>卡尔·罗斯</td><td>9062.1</td><td></td></tr><tr><td>Percival 培养箱</td><td>CLF Plant Climatics GmbH</td><td>AR-66L2</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td>大小 &amp;Oslash;xH：92 &amp;times; 16 mm</td></tr><tr><td>塑料杯（500 mL，透明）</td><td>Pro-pac，沙拉盒</td><td>5070</td><td>大小：108 &amp;times; 81 &amp;times; 102 mm</td></tr><tr><td>褶皱纤维素滤膜</td><td>Hartenstein</td><td>FF12</td><td>颗粒保留等级8&amp;ndash;12 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>poly klima 人工气候箱</td><td>poly klima GmbH</td><td>PK 520 WLED</td><td></td></tr><tr><td>马铃薯葡萄糖肉汤培养基</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>P6685</td><td>用于微生物学</td></tr><tr><td>花盆</td><td>P&amp;ouml;ppelmann GmbH</td><td>TO 7 D 或 TO 9.5 D</td><td>&amp;Oslash; 7 cm 分别 &amp;Oslash; 9.5 cm</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;启动子&lt;sub&gt;MYB51&lt;/sub&gt;::YFP&lt;/em&gt;</td><td>参见 Poncini &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;, 2017</td><td>MYB51 报告基因系</td><td>YFP（即带有NLS的3xmVenus）</td></tr><tr><td>2 mL反应管</td><td>Sarstedt</td><td>72.695.400</td><td>PCR性能测试</td></tr><tr><td>旋转（轨道）摇床</td><td>Edmund B&amp;uuml;hler</td><td>SM 30 C 控制器</td><td></td></tr><tr><td>沙（鸟类砂砾）</td><td>宠物餐厅，M&amp;uuml;ller Holding</td><td>786157</td><td></td></tr><tr><td>土壤</td><td>特殊育苗土</td><td>SP Pikier（SP ED 63 P）</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Solanum lycopersicum&lt;/em&gt; 野生型</td><td>参见 Chavarro-Carrero &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;, 2021</td><td>类型：Moneymaker</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Marienfeld</td><td>642710</td><td>深度 0.020 mm；0.0025 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>超纯水（Milli-Q纯化水）</td><td>MERK</td><td>IQ 7003/7005</td><td>经纯化后获得的水</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Verticillium dahliae&lt;/em&gt;</td><td>参见 Reusche &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;, 2014</td><td>分离 JR2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Verticillium longisporum&lt;/em&gt;</td><td>Zeise 和 von Tiedemann，2002</td><td>菌株 &lt;em&gt;Vl&lt;/em&gt;43</td><td></td></tr></tbody></table>

接种策略以感染植物根部的土传微生物

Inoculation Strategies to Infect Plant Roots with Soil-Borne Microorganisms

根际栖息着一个高度复杂的微生物群落，植物根系在此不断面临挑战。根系与多种多样的微生物密切接触，但针对土传相互作用的研究仍落后于对地上器官的研究。尽管文献中已描述了一些利用模式根部病原体侵染模式植物的接种策略，但要获得系统性的方法学综述仍然困难。为解决这一问题，本文详细描述了三种不同的根部接种体系，可用于深入理解根系-微生物互作的生物学特性。为便于说明， Verticillium 物种（即， V. longisporum 和 V. dahliae）被用作根部侵染的模式病原菌。然而，该方法可轻松适用于其他定殖于根部的微生物——无论是致病性还是有益微生物。通过定殖植物木质部，土传维管束真菌如 Verticillium spp. 具有独特的生活方式。在侵入根部后，它们会扩散 通过 木质部导管向顶运输，到达茎部，并引发病害症状。选取了三种代表性植物作为模式寄主： 拟南芥，具有重要经济价值的油菜（Brassica napus）和番茄（Solanum lycopersicum）。提供了详细的分步操作方案。展示了致病性测定、标记基因转录分析以及报告基因载体独立验证的代表性结果。此外，还深入讨论了每种接种系统的优缺点。这些经过验证的实验方案有助于为根-微生物互作相关研究问题提供研究思路。了解植物如何应对土壤中的微生物，对于开发改进农业的新策略至关重要。

根据方案，将植物接种 V. longisporum（菌株 Vl4325）或 V. dahliae（分离株 JR218）并进行培养。设计了多种实验场景，以验证该方案的有效性并突出其部分功能。图中展示了代表性结果。
参与抗菌性吲哚-葡糖硫苷（IG）生物合成的基因表达诱导是评估Verticillium感染的可靠指标17,19,26。在拟南芥中，MYB51（MYB结构域蛋白51；AT1G18570）编码一种转录因子，参与激活IG生物合成所需基因的表达27。MYB51可作为指示成功侵染的标记基因，因其在根部持续受到V. longisporum...

本方案详细总结了将土传微生物接种至植物根部的策略。以长孢轮枝菌（Verticillium longisporum）和大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）为例，介绍了三种不同的根部侵染体系。文中重点阐述了各体系的潜在应用及可能的后续分析方法，并讨论了每种体系的优缺点。

根际栖息着一个高度复杂的微生物群落，植物根系在此不断受到挑战。根系与多种多样的...密切接触。

尽管有无数微生物定植于植物根部，但由于这些互作发生在地下，因此难以分析。为了促进相关研究，本实验方案合集概述了对植物根部接种土传微生物的多种策略。根部接种是研究根-微生物互作的基础，通过使用以下技术，可在分子、细胞或组织学水平上研究这些互作关系。我们以大丽轮枝菌（verticillium）作为根部侵染微生物，拟南芥（arabidopsis）作为模式植物，介绍三种接种系统。然而，这些方法也可推广至其他植物，如番茄或油菜，以及其他根部微生物，例如有益的丝梗霉属真菌（serendipita）。提前通过在PDB培养基中培养菌丝，并在Czapek蔗糖培养液中诱导产孢，制备大丽轮枝菌的接种体。然后，将灭菌后的培养基倒入培养皿中。待培养基凝固后，用无菌塑料袋重新包装培养皿，并倒置存放于冰箱中，温度为4至10摄氏度，过夜。用解剖刀在已凝固培养基的上三分之一处切出并移除一条感染通道。切割时避免液体或空气进入琼脂培养基下方。接着，使用无菌的移液器吸头将50至100粒表面灭菌的拟南芥种子均匀分散在切开的上表面。将种子放置在琼脂切面与培养皿壁相交的夹角处，以便根部能在两者之间生长。用透气胶带密封培养皿，以允许气体交换。将培养皿置于4°C黑暗条件下处理两天，进行分层处理，以确保种子同步且高效萌发。随后将培养皿垂直放置于支架中，并在长日照条件下置于人工气候室中培养植株。当根系生长至感染通道处，经过9到11天后，将培养皿水平放置并打开。然后直接向感染通道中加入500 µL新鲜收获的Verticillium分生孢子。通过加入500 µL不含孢子的模拟溶液作为对照，制备对照组培养皿。将对照组和孢子接种的培养皿水平孵育，直至液体完全吸收。然后盖上皿盖，并用透气胶带密封。用黑色纸盒覆盖根部区域，以遮蔽根系和土壤中的真菌。将培养皿垂直放入培养室中孵育。在接种后的预定时间点进行分析。首先，将透明的500毫升塑料杯置于70%至75%乙醇溶液中浸泡20分钟以灭菌。在超净工作台中将杯子晾干。将高压灭菌后的培养基倒入塑料杯中。准备一个带有五个预制孔洞的塑料层，中央一个大孔，四个角落各有一个小孔。在培养基凝固前将其上的塑料层放置好。使用解剖刀通过预先制备的中心孔将琼脂切至约1.5厘米深度。移除切下的琼脂，以形成感染通道，便于后续加入真菌孢子。用移液枪枪头在四个较小的孔中轻轻刮擦琼脂培养基，以破坏凝固的表面层。用移液枪枪头将种子放入较小的孔中。用第二个倒置的塑料杯盖住原塑料杯，并用透气胶带密封。将植物置于黑暗条件下，在 4°C 环境中保存 3 天以进行春化处理。随后将杯式系统放入生长室中培养。为用轮枝菌接种植株，向感染通道中加入 1 毫升分生孢子溶液。作为对照，加入一毫升无菌的四分之一 MS 培养基作为模拟处理溶液。在接种后的预定时间点进行分析。首先，将土壤与沙子按三比一的体积比充分混合，以便后续彻底冲洗根部附

inoculation-strategies-to-infect-plant-roots-with-soil-borne

Research

科研

JoVE Journal

Environment

环境

用土壤微生物感染植物根系的接种策略

从在黑暗、无菌条件下预先萌发的水稻幼苗开始，以确保出苗整齐一致。将这些幼苗转移至含有已接种测试细菌的营养丰富半固体培养基的锥形瓶中。随着植物的生长，根部会向周围培养基中释放趋化性化合物。这些化合物促进细菌增殖，导致细菌在根部表面黏附、繁殖并形成菌落。随着根系的发育，细菌通过自然开口和细胞间隙进入植物体内。进入植物体内后，细菌会在植物的根部和茎部形成内生菌落。随着时间的推移，这些菌落与植物组织形成稳定的关系，并开始产生抗菌化合物。接下来，将幼苗转移至模拟自然环境条件的温室中。随着植物的生长，内生细菌产生的抗菌化合物作为生物防治剂，保护幼苗免受环境中有害微生物的侵害。...

水稻有益细菌的根系介导内生定殖

来源：Yi, Y., 等. 植物-微生物互作：芽孢杆菌属菌株Bacillus mycoides对马铃薯根系分泌物的转录响应。J. Vis. Exp. (2018)本视频演示了为研究植物-微生物相互作用而进行的芽孢杆菌（Bacillus...

利用植物根系分泌物处理细菌以模拟体外植物-微生物相互作用

来源：Rufián, J. S., 等. 植物组织内 Pseudomonas syringae 基因表达的单细胞分析. J. Vis. Exp.

通过真空渗透法将细菌病原体接种至Arabidopsis叶片中

本实验方案展示了两种接种方法，用于将虫生真菌Beauveria bassiana作为内生菌引入普通菜豆（Phaseolus...

将真菌昆虫病原菌定殖为内生菌：迈向内生生物防治

本文介绍了一种利用针头注射法将专性寄生真菌病原体Ustilago maydis接种于玉米和类蜀黍植物的方法。针头注射接种法可将真菌病原体精确地递送至植物叶片之间，病原菌在此处通过形成附着胞侵入植物体内。该方法效率高，能够实现U.

一种快速高效评估致病性的方法 Ustilago maydis 在玉米和大刍草品系上

利用标准培养皿制成的单个无菌微环境培养Medicago truncatula植物，使其与固氮细菌Sinorhizobium...

单株无菌微环境系统用于豆科植物Medicago truncatula与根瘤菌共生体Sinorhizobium meliloti的结瘤及生长研究

农杆菌浸润法和PVX农杆菌感染法是植物中外源基因瞬时异位表达的常规功能检测方法。这些方法在效应子组学策略（快速鉴定抗性基因和无毒基因）中是高效的检测手段，对现代分子植物病理学研究至关重要。它们满足了植物中进行高效高通量功能分析的需求。...

农杆菌浸润及PVX农杆菌感染在马铃薯和Nicotiana benthamiana中的应用

所述的水培共培养系统利用金属网筛支撑完整植物，并与细菌进行共培养。随后可分别收集植物组织、细菌及分泌的分子，用于下游分析，同时可对植物宿主及其相互作用的微生物或微生物组的分子响应进行研究。...

一种用于植物/微生物分子互作与信号传导同步系统分析的水培共培养系统

用针刺穿胡椒植株基部茎头是一种简便且省时的损伤方法。本文提供了通过视频详细展示感染胡椒植株的具体操作步骤。...

一种有效的接种方法 Phytophthora capsici 在黑胡椒植株上

防控西瓜枯萎病需要了解病原菌的生理小种组成。本文介绍了根浸法、带菌种子播种法和改良盘浸法三种接种方法，以验证其在尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp.

三种用于鉴定未知小种的接种技术对比 Fusarium oxysporum 小种 niveum 分离株

了解三种植物根系接种策略，用于研究土壤微生物与拟南芥根系的相互作用。该方法可应用于分子、细胞及组织学水平的根际微生物互作分析，并适用于番茄和油菜等其他植物。

接种策略以感染植物根部的土传微生物

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