使用DNA纤维测定检测人细胞中复制后间隙的积累和修复
February 3rd, 2022
在这里，我们描述了DNA纤维测定的两种修饰，以研究病变诱导后复制DNA的单链DNA间隙。S1纤维测定能够使用ssDNA特异性S1内切酶检测复制后间隙，而间隙填充测定允许间隙修复的可视化和定量。
我们的实验方案为研究复制如何在受损DNA上发生开辟了新的可能性。这些技术可以检测与DNA病变相反的单链DNA间隙的形成和修复。S1核酸酶切割单链DNA并允许检测复制后间隙。
这种方法最初由Meneghini博士和Cordiero-Stone博士于20世纪70年代在巴西使用，最近由我们应用于DNA纤维测定。使用这里描述的技术来研究复制后间隙的形成和修复，可以为DNA修复和复制应激反应的机制提供见解，从而保持基因组完整性。对于此处描述的两种方案，S1光纤和间隙填充测定，包括所有对照以确保准确解释数据至关重要。
该程序将由我们实验室的博士生Davi J.Martins和Annabel Quinet博士演示，后者之前在我们小组工作时开发了这些技术。首先，吸出培养基，并立即将具有20微摩尔IDU培养基的培养基加入细胞中。将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育20分钟。
然后，用预热的PBS快速洗涤细胞两次，并用每平方米20焦耳的UV-C照射它们。使用未经处理的细胞作为对照。立即将含有200微摩尔CldU的培养基加入细胞中，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育60分钟。
之后，用预热的PBS洗涤细胞两次，并根据室温下的细胞系用CSK 100缓冲液透化它们2至10分钟。CSK通透后，与通透之前相比，几乎看不到细胞质的细胞核。小心地将PBS倒入每个孔的侧面，用PBS洗涤细胞核。
然后，用S1缓冲液洗涤细胞核。将细胞核在S1缓冲液中用每毫升20个单位的S1核酸酶孵育，并且没有S1核酸酶，在37摄氏度下孵育30分钟。接下来，吸出S1缓冲液并在PBS中加入0.1%BSA。
刮取细胞核并将其转移到大约注释的1.5毫升管中。始终将管子放在冰上。将细胞核以约4， 600倍G在4摄氏度下离心5分钟。
以每微升约1， 500个细胞的浓度重悬于PBS中的沉淀。将试管放在冰上，并通过铺展方案立即进行DNA纤维制备。用碳铅笔注释显微镜载玻片，并将其平放在托盘上。
点击管的底部以确保均质化，并在相应的载玻片顶部添加两微升细胞。加入六微升裂解缓冲液，并通过上下移液约五次来裂解细胞。使用移液器尖端将液滴稍微拉向载玻片底部，并在室温下孵育五分钟以裂解细胞核。
将滑块倾斜约20至40度，并允许液滴以恒定的低速扩散到滑块的底部。让载玻片在室温下在黑暗中干燥10至15分钟。然后，将它们浸入装有新鲜制备的固定溶液的罐中，并在室温下孵育五分钟，以将DNA固定在载玻片上。
用PBS洗涤载玻片两次，持续5分钟，并在室温下用新鲜制备的2.5臼齿氯酸使DNA变性40至60分钟。用PBS洗涤载玻片三次，持续五分钟，并用5%BSA阻止先前在37摄氏度下加热30至60分钟。轻轻拍打纸张以从载玻片中取出多余的液体。
向载玻片滴加30微升一抗，并在顶部放置盖玻片。在室温下在黑暗潮湿的室中孵育1至1.5小时。将载玻片放入装有PBS的罐子中一到两分钟，然后小心地取下盖玻片。
用PBST在罐子中洗涤三次，持续五分钟，然后将载玻片放入PBS中。轻轻敲击纸张以除去多余的液体，并向载玻片滴加30微升二抗。在上面放一个盖玻片。
在室温下在黑暗潮湿的室中孵育45至60分钟。重复洗涤载玻片的步骤，再次去除多余的PBS，并向载玻片滴加20微升的安装试剂。在上面放一个盖玻片，避免气泡。
在滑轨顶部附近放置一滴浸油，其中细胞被裂解。使用绿色通道并搜索背景中的绿色点以查找焦点。打开徕卡应用套件软件，单击"获取"，然后选择绿色通道。
在分析之前调整绿色通道的设置。然后，更改为红色通道并调整设置。找到纤维的主要浓度，然后移动到边缘，以找到均匀分布的，不重叠的单个纤维。
仅使用一个通道来选择图片的区域，并避免潜在的偏差。单击"获取叠加层"图标，然后调整软件以获得正确的显微镜放大倍率。每张幻灯片在绿色通道处拍摄大约15到20张照片，同时在整张幻灯片旁边拍摄，然后在红色通道上拍摄。
现在，两个通道已合并，创建的叠加层将移动到唯一的文件夹中。可以看到带有红色和绿色的纤维。打开 ImageJ 软件，左键单击第五个图标，选择第二个选项，然后选择分割线工具。
单击鼠标左键可绘制红色或绿色区域的确切路径，单击鼠标右键可停止绘制。按下键盘上的 M 按钮以测量长度。对于 S1 光纤，请跟踪每根光纤的红色和绿色区域测量值，并从不同图片中测量至少 150 根光纤的红色和绿色区域长度。
S1光纤显示在这些代表性图像中。这里显示了没有间隙且不受S1核酸酶切割影响的对照新生DNA束。DNA束阳性的间隙被S1核酸酶切割，导致CldU束长度较短。
可以执行文本手稿中广泛描述的差异标记方案来标记间隙填充事件。在该测定中，称为间隙填充测定，具有至少一个CldU贴片或更少CldU贴片的较长IDU轨迹对应于低间隙填充密度。较短的 IDU 束（至少具有一个 CldU 贴片）和较长的 IDU 束（具有较多的 CldU 贴片）对应于高间隙填充密度。
该方案的透化步骤对于S1核酸酶作用于复制受损DNA期间形成的间隙至关重要。S1核酸酶也可用于彗星测定方案，以检测在复制治疗后仍然存在的受损DNA期间形成的间隙。S1纤维测定为复制后间隙可能导致癌症脆弱性的新范式铺平了道路，特别是在携带BRCA1和2基因突变的乳腺癌和卵巢癌中。
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概述
本文介绍了DNA纤维测定法的两种改进方法，用于研究损伤诱导后复制DNA中的单链DNA间隙。S1纤维测定法使用ssDNA特异性S1内切酶检测复制后的间隙，而间隙填充测定法则可视化和定量间隙修复。
关键研究组成部分
科学领域
- DNA修复机制
- 复制压力反应
- 基因组完整性
背景
- 单链DNA间隙的形成和修复对于维护基因组完整性至关重要。
- 20世70年代的先前工作为这些测定法奠定了基础。
- 了解这些过程可以提供关于受损DNA上DNA复制的见解。
- 准确的控制对于解释这些测定法的结果至关重要。
研究目的
- 调查受损DNA上的复制如何发生。
- 检测单链DNA间隙的形成和修复。
- 增强对DNA修复机制和复制压力反应的理解。
使用的方法
- S1纤维测定法用于检测复制后的间隙。
- 间隙填充测定法用于可视化和定量单链DNA间隙的修复。
- 包括必要的控制以便准确解释数据。
- 将历史技术适应于现代测定法。
主要结果
- 使用S1纤维测定法成功检测到单链DNA间隙。
- 通过间隙填充测定法定量间隙修复。
- 对DNA修复机制和复制压力反应的见解。
- 证明了控制在实验设计中的重要性。
结论
- 改进的DNA纤维测定法为研究受损模板上的DNA复制提供了宝贵的工具。
- 了解单链DNA间隙可以为更广泛的基因组完整性研究提供信息。
- 这些技术可以推动DNA修复研究领域的进展。
常见问题
Executive Industry Relevance
Detection and quantification of post-replicative single-stranded DNA gaps are critical for de-risking early discovery programs targeting genome stability and DNA repair pathways. The modified DNA fiber assay with S1 nuclease enables direct measurement of replication stress responses and repair dynamics, informing target validation and mechanistic confidence in oncology and genome maintenance portfolios. This capability supports predictive assessment of DNA repair liabilities and informs risk-adjusted advancement decisions in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of DNA repair mechanisms at replication forks under genotoxic stress.
- Supports functional validation of targets involved in post-replicative gap formation and repair.
- Provides mechanistic de-risking for candidate targets in genome integrity pathways.
- Facilitates predictive confidence in pathway modulation and synthetic lethality strategies.
Screening & Assay Development
- Establishes robust, quantitative readouts for replication fork dynamics and gap repair events.
- Standardizes detection of ssDNA gaps for reproducible compound screening and profiling.
- Enables assay scalability and platform reuse for evaluating DNA repair modulators.
- Supports reliable assessment of compound effects on replication stress and repair fidelity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of replication stress, particularly in BRCA-deficient cancers.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation of DNA repair-targeted agents.
- Enables risk-adjusted go/no-go decisions based on quantitative repair phenotypes.
- Supports translational biomarker development for genome instability signatures.
Pipeline & Workflow Integration
This modified DNA fiber assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum for genome maintenance and oncology programs.
- Discovery Biology: Quantifies post-replicative gap formation and repair, clarifying DNA damage response pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound and genetic perturbation studies.
- Analytics: Provides tract length measurements and gap-filling quantification for comparative analysis.
- Translational Research: Links mechanistic repair phenotypes to disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for ongoing DNA repair and replication stress research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in DNA repair target validation and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Enhances assay standardization, reproducibility, and scalability across R&D teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency in genome stability programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of DNA repair and replication stress targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in DNA fiber assay execution and quantitative image analysis.
- Needs access to fluorescence microscopy and image processing infrastructure.
- Demands rigorous control inclusion for accurate data interpretation and cross-team comparability.
- Adaptable to various human cell models but may require protocol optimization per system.
- Resolution limited to detection of gaps above a few hundred bases; smaller lesions may remain undetected.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:27
S1 Fiber Experimental Setup
3:51
DNA Fiber Preparation by Spreading
4:58
Immunostaining of DNA Fibers
6:45
Image Acquisition and Analysis
8:39
Results: Post-Replicative ssDNA Gaps on Ongoing Forks by S1 Fiber Assay and Post-Replicative Repair by Gap Filling
9:42
Conclusion
