Name: 使用DNA纤维测定检测人细胞中复制后间隙的积累和修复 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 了解DNA纤维测定技术在人细胞中检测复制后间隙积累与修复的方法。该技术利用S1核酸酶特异性识别单链DNA缺口，结合缺口填补实验实现定量分析，为研究DNA损伤修复机制与基因组稳定性维持提供重要工具。

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C.F.M.M. 实验室的工作得到了圣保罗州研究支持基金会（FAPESP，巴西圣保罗，资助编号 #2019/19435-3、#2013/08028-1 和 2017/05680-0）在 FAPESP 与荷兰科学研究组织（NWO，荷兰）国际合作研究项目下的支持；以及巴西国家科学技术发展委员会（CNPq，巴西巴西利亚联邦区，资助编号 #308868/2018-8）和高等教育人员进修协调办公室（CAPES，巴西巴西利亚联邦区，资助代码 001）的支持。

由于本研究使用人类细胞，相关工作已获得圣保罗大学生物医学科学研究所（ICB-USP，批准号 #48347515.3.00005467）伦理委员会的批准，允许开展涉及人类样本的研究。
注意：此处描述的实验方案在先前的出版物中已使用过，仅做了少量修改14,16,28。本文重点介绍以紫外光C（UVC）作为DNA损伤剂的应用，但其他DNA损伤剂（如顺铂和羟基脲）也已成功使用28。该实验方案适用于多种细胞系，包括U2OS、HEK293T、人成纤维细胞及其他细胞系14,28,29。在开展本实验前，必须明确研究的科学问题。使用S1核酸酶的DNA纤维实验（以下简称S1 Fiber）用于检测复制后单链DNA（ssDNA）缺口的存在，而缺口填补（或称PRR）实验则用于定量G2期的缺口填补事件。因此，若研究目标为分析复制后ssDNA缺口的存在情况，研究者应执行第2节（S1 Fiber实验设置），并直接进入第4节（铺展法DNA纤维制备）；若研究目标为分析缺口填补事件，则应直接进入第3节（缺口填补（PRR）实验设置）。
1. 试剂与准备
<ol>
	<li>胸腺嘧啶类似物：将5-碘-2'-脱氧尿苷（IdU）和5-氯-2'-脱氧尿苷（CldU）溶于1 N NH4OH中，配制成终浓度为100 mM的溶液。使用无菌注射器滤器（0.2 µm）过滤，分装后于-20 °C保存。</li>
	<li>抗体：一抗——抗BrdU大鼠单克隆抗体（Biorad）和抗BrdU小鼠单克隆抗体（BD）；二抗——Alexa Fluor 488标记的抗大鼠IgG和Alexa Fluor 594标记的抗小鼠IgG。</li>
	<li>S1纤维实验用细胞通透CSK100缓冲液：在蒸馏H2O中加入100 mM NaCl、10 mM MOPS [pH 7]、3 mM MgCl2 [pH 7.2]、300 mM蔗糖和0.5% Triton X-100。</li>
	<li>S1核酸酶缓冲液 [pH 4.6]：在H2O中加入30 mM醋酸钠 [pH 4.6]、10 mM醋酸锌、50 mM NaCl和5%甘油。 
	注意：S1核酸酶缓冲液的终pH必须为4.6，因为当pH > 4.9时，S1酶活性会下降50%。</li>
	<li>将来自A. oryzae的S1核酸酶用厂家提供的稀释缓冲液预稀释后，分装并储存在-20 °C。</li>
	<li>将秋水仙素溶于DMSO中，配制成终浓度为2 mM的溶液，用于检测间隙填补实验。</li>
	<li>裂解缓冲液：在H2O中加入200 mM Tris-HCl [pH 7.5]、50 mM EDTA和0.5% SDS。</li>
	<li>配制磷酸盐缓冲盐水（PBS）。</li>
	<li>在PBS中加入0.1% Tween-20，配制PBS-T缓冲液。</li>
	<li>在PBS中配制5%牛血清白蛋白（BSA）溶液。</li>
	<li>在PBS中配制0.1% BSA溶液。</li>
	<li>在PBS-T中加入1% BSA，配制PBS-T-BSA缓冲液。 
	注意：使用配备汞灯或氙灯的落射荧光显微镜，搭配波长510 nm、带宽42 nm的GFP（FITC，Alexa Fluor 488）发射滤光片，以及波长624 nm、带宽40 nm的Texas Red（Alexa Fluor 594）发射滤光片；或使用共聚焦显微镜，配备488 nm谱线（蓝色）激光检测绿色荧光（检测范围510–560 nm），以及561 nm谱线（黄色）激光检测红色荧光（检测范围575–680 nm）。使用浸油物镜（40x、63x或100x）。</li>
</ol>
2. S1 纤维实验设置（2 天）
<ol>
	<li>第1天：为每种细胞系接种4个孔，分别设置±UVC和±S1核酸酶处理组，细胞融合度为70–90%。 
	&#8203;注意：实验可使用12孔板进行，此时每孔使用0.5 mL溶液。</li>
	<li>第2天：在预热（37 °C）的细胞培养基中新鲜配制20 µM IdU和200 µM CldU。</li>
	<li>吸除培养基，立即加入含20 µM IdU的培养基，在37 °C、5% CO2（细胞培养箱）条件下精确孵育20分钟。</li>
	<li>用预热（37 °C）的PBS快速洗涤细胞两次。</li>
	<li>用20 J/m2 UVC照射细胞。未处理细胞作为对照。</li>
	<li>立即加入含200 µM CldU的培养基，在37 °C、5% CO2（细胞培养箱）条件下精确孵育60分钟。 
	注意：IdU和CldU的标记顺序可以互换，但第二种类似物的浓度应为第一种的5–10倍。类似物孵育时间可根据所用的基因毒性试剂进行调整，但第二次类似物孵育时间应足够长，以确保有足够时间形成单链DNA间隙14,16。若使用DNA损伤药物，应与CldU同时加入28,29,30。</li>
	<li>用预热（37 °C）的PBS洗涤细胞两次。</li>
	<li>在室温（RT）下用CSK100缓冲液对细胞进行透化处理，持续8–10分钟。 
	注意：可在明场显微镜下检查透化效果，此时仅应观察到细胞核。</li>
	<li>用PBS小心洗涤细胞核（沿每孔壁缓慢加入0.5 mL，仅数秒）。</li>
	<li>用S1缓冲液小心洗涤细胞核（沿每孔壁缓慢加入0.5 mL，仅数秒）。</li>
	<li>在37 °C（细胞培养箱）条件下，用含S1核酸酶（20 U/mL）或不含S1核酸酶（作为对照）的S1缓冲液孵育细胞核30分钟&#160;。</li>
	<li>吸除S1缓冲液，加入含0.1% BSA的PBS。</li>
	<li>刮取细胞核并转移至适当标记的1.5 mL离心管中。全程将离心管置于冰上。 
	注意：可在明场显微镜下检查细胞核是否成功脱离。</li>
	<li>离心收集细胞核：在4 °C下以约4600 x g离心5分钟。 
	&#8203;注意：与标准DNA纤维实验不同，此处无法对细胞核进行计数，因此需参考初始接种的细胞数量。或者，可额外保留一个未经透化处理的孔，使用血细胞计数板或细胞计数仪估算细胞数量。</li>
	<li>将沉淀充分重悬于PBS中，浓度约为1500个细胞/µL，将离心管置于冰上，并立即进行DNA纤维制备（铺展法，第4节）。</li>
</ol>
3. 间隙填补（PRR）实验设置（3天）
<ol>
	<li>第1天：每种细胞系接种两个孔： &#177; 在细胞汇合度约为70%时进行UVC照射。</li>
	<li>第2天：准备新鲜的IdU，浓度为20 &#181;37℃预热的 M &#176;C）细胞培养基</li>
	<li>用 20 J/m² 的剂量照射细胞2 UVC</li>
	<li>立即加入含有 20 的培养基 &#181;M IdU 并在 37 &#176;C，5% CO2（细胞培养箱）中精确孵育60分钟。</li>
	<li>用预热（37℃）的 PBS 洗涤细胞 &#176;C）PBS 洗涤两次。</li>
	<li>立即加入含 200 ng/mL nocodazole 的培养基，并将细胞在 37 &#176;C，5% CO2 （细胞培养箱）中孵育12-24小时（该步骤的时间在不同实验间必须保持一致）。 
	&#8203;注意：诺考达唑的浓度可能需要根据所使用的细胞系进行调整。如果使用基因毒性药物，请将细胞与IdU共同孵育 &#177; 药物28.</li>
	<li>第3天：吸除培养基，加入含有20 &#181;M CldU + 秋水仙素，在秋水仙素处理的最后4小时中于37℃孵育 &#176;C，5% CO2 （细胞培养箱）</li>
	<li>用预热（37℃）的 PBS 洗涤细胞 &#176;C）PBS。</li>
	<li>加入胰蛋白酶，在37℃孵育1-2分钟 &#176;C，5% CO2 （细胞培养箱）以解离细胞。</li>
	<li>加入等体积的细胞培养基，收集细胞（培养基 + 胰蛋白酶）至适当标记的1.5 mL离心管中。始终将离心管置于冰上。</li>
	<li>使用血细胞计数板或细胞计数仪对细胞进行计数。</li>
	<li>离心收集细胞：在约 350 x g 5 分钟，4 °C &#176;C.</li>
	<li>移去上清液，并将细胞重悬于 PBS 中，浓度约为 1500 个细胞/μL&#181;L. 将细胞置于冰上，并立即开始DNA纤维制备的铺展步骤（第3天或第4天）。</li>
</ol>
4. 通过铺展法进行DNA纤维制备（约1小时处理12张载玻片）
<ol>
	<li>用碳素铅笔在显微镜载玻片上做标记，并将其平放在托盘上。</li>
	<li>轻弹试管底部以确保细胞悬液均匀混合。</li>
	<li>在相应载玻片的顶部加入 2 µL 细胞悬液。 
	注意：可加入两滴细胞悬液，一滴在载玻片顶部，另一滴在载玻片中部。</li>
	<li>加入 6 µL 裂解缓冲液，用移液器轻轻吹打约 5 次以裂解细胞（避免产生气泡）。</li>
	<li>用移液器吸头将液滴略微向载玻片底部拉动，以引导液滴的扩散路径。</li>
	<li>室温孵育 5 分钟，以裂解细胞核。 
	注意：若裂解液干燥过快或未能充分干燥，可调整裂解缓冲液的体积和裂解时间。裂解缓冲液体积可在 5–7 µL 范围内调整，孵育时间可在 4–10 分钟之间调整。</li>
	<li>将载玻片倾斜约 20–40°，使液滴以恒定且缓慢的速度向载玻片底部扩散。</li>
	<li>在室温避光条件下干燥载玻片（10–15 分钟）。</li>
	<li>新鲜配制固定液：按 3:1 的比例混合甲醇与冰醋酸。</li>
	<li>将载玻片浸入盛有固定液的染色缸中，室温孵育 5 分钟，使 DNA 固定在载玻片上。 
	&#8203;警告：甲醇具有高毒性，应在通风橱中操作，并倒入适当的废液容器中处理。</li>
	<li>在室温避光条件下干燥载玻片，并于 4 °C 避光保存，直至进行染色。</li>
</ol>
5. DNA纤维的免疫染色（约6小时）
<ol>
	<li>用 PBS 清洗载玻片，每次 5 分钟，共清洗两次。</li>
	<li>用新鲜配制的 2.5 M HCl 在室温下变性 DNA，处理 40–60 分钟。 
	注意：配制 2.5 M HCl 时，必须将酸缓慢加入水中，切勿反向操作。该过程为放热反应，溶液会轻微升温。</li>
	<li>用 PBS 清洗载玻片，每次 5 分钟，共清洗三次。</li>
	<li>加入已预热至 37 °C 的 5% BSA 溶液进行封闭，在 37 °C 条件下孵育 30–60 分钟（该溶液可在 20 °C 保存，最多使用三次）。</li>
	<li>轻轻在纸巾上轻敲载玻片，去除多余液体。</li>
	<li>将 30 µL 一抗溶液（用 PBS-T-BSA 稀释的鼠抗 BrdU 抗体 1/20（用于检测 IdU）和大鼠抗 BrdU 抗体 1/100（用于检测 CldU））滴加至载玻片上，加盖盖玻片。在避光、湿润的孵育盒中室温孵育 1–1.5 小时。</li>
	<li>将载玻片放入盛有 PBS 的染色缸中浸泡 1–2 分钟，然后小心移除盖玻片。</li>
	<li>在染色缸中用 PBS-T 洗涤三次，每次 5 分钟，然后将载玻片置于 PBS 中。</li>
	<li>轻轻在纸巾上轻敲载玻片，去除多余液体。</li>
	<li>将 30 µL 二抗溶液（用 PBS-T-BSA 稀释至 1/75 的 Alexa Fluor 594 标记的抗小鼠抗体和 Alexa Fluor 488 标记的抗大鼠抗体）滴加至载玻片上，加盖盖玻片。在避光、湿润的孵育盒中室温孵育 45–60 分钟。</li>
	<li>将载玻片放入盛有 PBS 的染色缸中浸泡 1–2 分钟，然后小心移除盖玻片。</li>
	<li>在染色缸中用 PBS-T 洗涤三次，每次 5 分钟，然后将载玻片置于 PBS 中。</li>
	<li>轻轻在纸巾上轻敲载玻片，去除多余液体。</li>
	<li>将 20 µL 封片试剂滴加至载玻片上，加盖盖玻片，避免产生气泡。</li>
	<li>将载玻片在室温避光条件下干燥，随后于 4 °C 保存（如需长期保存，可置于 -20 °C）。</li>
</ol>
6. 图像采集与分析（每个样本约 1 小时）
注意：两种实验方案均可使用落射荧光显微镜。然而，对于间隙填补（PRR）实验，强烈推荐使用共聚焦显微镜，以获得更高分辨率的图像。
<ol>
	<li>在细胞裂解区域的玻片顶端附近滴加一滴镜油（显微镜专用），使用绿色通道通过在背景中寻找绿色荧光点来找到焦平面（可使用40倍、63倍和100倍物镜）。</li>
	<li>找到纤维的主要集中区域，然后移至边缘，仅使用一个通道选择成像区域，以寻找分散良好且不重叠的单根纤维，避免潜在偏差。</li>
	<li>每张载玻片在绿色和红色通道下沿整个载玻片范围拍摄约15–20张图像，并将两个通道合并以获得双色DNA纤维。 
	注意：若使用共聚焦显微镜，应以高分辨率（1024 × 1024 像素）拍摄图像，并对红色和绿色荧光均采用接近 1 的针孔值。</li>
	<li>使用 ImageJ（美国国立卫生研究院 NIH 提供的免费软件，&#160;https://imagej.nih.gov/ij/) 用于测量 IdU 和 CldU 纤维长度。
	<ol>
		<li>通过将图片拖入 ImageJ 窗口中来打开图片。</li>
		<li>使用显微镜软件生成的标尺（经过适当校准）将长度转换为微米。使用 直线 通过选择 5 作为工具th 从左到右点击 ImageJ 窗口中的图标，测量所提供图片中比例尺的微米数，并获得以像素为单位的测量值。点击 分析 &#62; 设定比例尺 并替换 &#34;像素距离&#34; 具有适当数量和的 &#34;长度单位&#34; 至 &#181;m.</li>
		<li>在 ImageJ 对话框中，选择 分段线 通过左键单击 5 来使用工具th 从左到右选择图标，然后从上到下选择第二个选项。</li>
		<li>通过左键单击绘制红色（IdU）或绿色（CldU）轨迹的精确路径，通过右键单击结束绘制。按下 M 使用键盘上的按钮测量长度。</li>
		<li>对于 S1 Fiber，仅分析红色-绿色（双色纤维）16从不同图片中至少测量150条纤维的红色和绿色片段长度，并记录每条单个纤维的红色和绿色片段长度数据。</li>
		<li>在进行间隙填补检测时，仅测量包含至少1个CldU（绿色）斑块但无连续CldU染色的IdU（红色）片段长度。从不同图像中分别计数至少10–15个带有至少1个CldU斑块的IdU片段。 
		注意：也可使用其他软件进行分析，例如 Zeiss LSM Image Browser。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于 S1 纤维，分别以散点图形式绘制 IdU 片段长度、CldU 片段长度以及比值（CldU/IdU 或反之），并标出中位数。</li>
	<li>将间隙填补事件测量为单位 &#34;每千碱基密度&#34;，将特定长度的IdU（红色）纤维上CldU（PRR，绿色）斑块的总数除以红色纤维的总长度（以千碱基为单位，按1 &#181;m = 2.59 千碱基31然后将数据绘制成带中位数的散点图。</li>
	<li>在两个实验中，两组样本之间的统计分析采用 Mann-Whitney 检验（非参数检验），两组以上样本之间的统计分析采用 Kruskal-Wallis 检验，随后进行 Dunn 多重比较检验。</li>
</ol>

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<li>Jansen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundancy+of+mammalian+Y+family+DNA+polymerases+in+cellular+responses+to+genomic+DNA+lesions+induced+by+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light.</a> Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071(2014).</li>
<li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap-filling+and+bypass+at+the+replication+fork+are+both+active+mechanisms+for+tolerance+of+low-dose+ultraviolet-induced+DNA+damage+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome.</a> DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).</li>
<li>Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postreplication+gaps+at+UV+lesions+are+signals+for+checkpoint+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).</li>
<li>Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+further+properties+of+single-strand-specific+nuclease+from+Aspergillus+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae.</a> European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).</li>
<li>Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+replication+fork+in+ultraviolet+light-irradiated+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells.</a> Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).</li>
<li>Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaps+and+forks+in+DNA+replication%3A+Rediscovering+old+models%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models.</a> DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).</li>
<li>Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-dependent+DNA+damage+bypass+is+separable+from+genome+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication.</a> Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).</li>
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<li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRIMPOL-mediated+adaptive+response+suppresses+replication+fork+reversal+in+BRCA-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells.</a> Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).</li>
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<li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255(2011).</li>
<li>Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trans+cell+cycle+effects+of+PARP+inhibitors+underlie+their+selectivity+toward+BRCA1%2F2-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells.</a> Genes & Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).</li>
<li>Taglialatela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REV1-Pol%CE%B6+maintains+the+viability+of+homologous+recombination-deficient+cancer+cells+through+mutagenic+repair+of+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).</li>
<li>Lim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP1+Is+required+for+replication+fork+protection+in+BRCA1-deficient+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors.</a> Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).</li>
<li>Peng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+roles+of+FANCJ+and+HLTF+protect+forks+and+restrain+replication+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress.</a> Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+translocase+FANCM%2FMHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).</li>
<li>Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+alkaline+comet+assay+and+enzyme-modified+alkaline+comet+assay+for+measuring+DNA+strand+breaks+and+oxidative+DNA+damage+in+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833(2016).</li>
<li>Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+in+vitro+DNA+damage+using+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Evaluating in vitro DNA damage using comet assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450(2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

标准DNA纤维实验方案的关键步骤已在先前的出版物中讨论过32。本文中，我们描述了标准DNA纤维实验的改进版本，用于研究复制后单链DNA（ssDNA）缺口的存在及其通过填补修复的过程，该方法最初在文献14中被描述。在检测复制后ssDNA缺口存在的情况下，使用S1纤维法时加入S1核酸酶，通常在细胞暴露于基因毒性试剂至少1小时后进行较为合适，以确保有足够时间形成并检测到缺口。然而，必须注意的是，在某些细胞系或遗传背景下，即使未额外施加基因毒性处理，使用S1核酸酶也可能导致纤维片段变短33,34。因此，必须设置完整的对照组，以准确判断基因毒性试剂处理是否确实导致了缺口的累积。此外，还需在ssDNA缺口不再形成或已被修复的条件下重复实验，以进一步验证S1纤维法的结果。
关于填补缺口（PRR）实验，优化UVC剂量或药物浓度至关重要，需确保其不影响DNA纤维的总体长度，因为结果是以每千...

早期的研究已提供证据表明，在细菌1和人类细胞2,3中，经DNA损伤剂处理后会出现复制后单链DNA（ssDNA）缺口的积累。在受损DNA模板的复制过程中，DNA合成机制可通过特定的跨损伤合成DNA聚合酶或模板转换机制绕过损伤位点。此外，复制体也可能直接跳过损伤位点，留下一个ssDNA缺口，待后续修复。最近的一项研究利用电子显微镜观察复制中间体的特定结构，明确证实了在真核生物中，基因毒性试剂处理会导致ssDNA缺口的形成4。最初认为，这些复制后缺口区域的形成仅仅是DNA半不连续复制模式的简单结果2。在此情况下，滞后链上的损伤可阻断冈崎片段的延伸，但复制叉的前进可通过下一个冈崎片段自然恢复，从而留下一个ssDNA缺口。然而，后续研究进一步表明，前导链上同样可能形成缺口，这一点最早在细菌中被发现5。在真核生物中，PRIMPOL是一种具有引物酶活性的独特DNA聚合酶，已被证明可通过其重新引物合成活性，在复制阻断性损伤的下游重启DNA合成6,7,8,9,10,11。因此，PRIMPOL的引物酶活性可能解释了在人类细胞中经DNA损伤剂处理后前导链上复制后ssDNA缺口的形成12。然而，直到最近，对这些缺口的检测及其修复过程的研究仍依赖于间接或耗时的方法，例如电子显微镜4或基于质粒的检测方法13。利用ssDNA特异性的S1核酸酶在人类细胞中检测缺口的方法最早由四十多年前的早期研究开创，当时采用了蔗糖梯度技术2,3。最近，我们课题组将该核酸酶应用于其他方法中，如DNA纤维和彗星实验，以检测正在复制的DNA中的ssDNA（即复制后缺口）14。这些新方法为当前关于复制后缺口的大量研究奠定了基础。本文中，我们描述了一种利用S1核酸酶结合DNA纤维实验检测复制后ssDNA缺口的策略，并阐述了DNA纤维实验中差异标记方案如何实现对这些缺口修复过程的研究。
DNA纤维实验是一种强大的技术，已被越来越多的实验室采用，并为复制叉动态及复制应激反应机制提供了宝贵的见解。简而言之，该技术基于核苷酸类似物（如CldU—5-氯-2'-脱氧尿苷，以及IdU—5-碘-2'-脱氧尿苷）在正在复制的DNA中的顺序掺入。收集细胞后，裂解细胞并将DNA分子铺展在带正电荷的载玻片上。随后通过特异性抗体检测CldU和IdU，可在荧光显微镜下观察为双色纤维。最后，通过测量IdU和CldU片段的长度，以识别因DNA损伤诱导所导致的DNA复制动态变化。该技术可用于研究多种现象，例如复制叉停滞、复制叉减缓、新生DNA降解，以及复制起始频率的变化15,16。
DNA纤维实验的一个局限性在于其分辨率仅为几个千碱基。由于复制后单链DNA（ssDNA）缺口的长度可能在数百个碱基范围内，因此无法通过标准的DNA纤维实验方案直接观察到这些缺口。此前已有间接证据表明，在经基因毒性试剂处理的人类细胞中，正在复制的DNA上存在ssDNA缺口。例如，在S期以外的细胞中检测到单链DNA结合蛋白——复制蛋白A（RPA）的募集，或通过碱性DNA解旋实验检测到ssDNA的形成，同时DNA纤维实验未发现复制叉长期停滞，这些现象均被归因于ssDNA缺口的积累12,17,18,19,20,21。此外，复制后ssDNA缺口可激活ATR依赖性的G2/M期检查点，导致经复制抑制剂处理的细胞发生周期阻滞18,19,20,21,22。
S1核酸酶可降解单链核酸，释放出5'-磷酸化的单核苷酸或寡核苷酸，且对ssDNA的亲和力比对RNA高5倍。双链核酸（DNA:DNA、DNA:RNA或RNA:RNA）对S1核酸酶具有抗性，除非使用极高的酶浓度。S1核酸酶还能在由切口、缺口、错配或发夹结构导致的单链区域处切割双链DNA。因此，S1核酸酶是一种特异性作用于ssDNA的内切酶，能够切割ssDNA缺口，最终产生双链断裂23,24。因此，在DNA纤维实验流程中加入S1核酸酶消化步骤，可间接检测复制后存在的ssDNA缺口。当存在缺口时，在DNA铺展前用S1核酸酶处理暴露的细胞核，会因S1酶切割缺口处固有的ssDNA而产生较短的纤维片段14。因此，纤维片段缩短即为该方法检测ssDNA缺口的读数指标。与标准DNA纤维实验相比，加入S1核酸酶的DNA纤维实验仅需额外增加两个步骤：细胞核暴露（细胞通透化）和S1核酸酶处理。需要注意的是，必须设置适当的对照，例如仅用遗传毒性试剂处理但未加S1核酸酶的样本，以及仅用S1核酸酶处理但未加遗传毒性试剂的样本。该实验流程本身，包括类似物掺入、S1处理和DNA铺展，可在一天内完成，无需特殊材料，仅需胸苷类似物、纯化的S1核酸酶、合适的初级和次级抗体以及荧光显微镜。总体而言，利用S1核酸酶的DNA纤维技术通过一种相对简单的方法，即可检测正在进行复制的复制叉上的ssDNA缺口。
由于复制应激反应机制所形成的复制后单链DNA（ssDNA）缺口可通过多种机制进行修复（或填补），包括跨损伤DNA合成或模板转换，这一过程被称为缺口填补或复制后修复（post-replication repair, PRR）25。这些过程发生在前进的复制叉之后，涉及不依赖于复制的DNA合成14,26,27。基于这些发现，可采用一种不同于标准DNA纤维实验的标记策略，直接在G2期可视化缺口填补事件14,16,26,28。具体而言，可使用一种胸苷类似物在基因毒性处理时及复制后ssDNA缺口形成期间标记复制叉，而使用另一种胸苷类似物标记缺口填补事件。在本实验方案中，细胞在基因毒性处理后立即或同时用第一种胸苷类似物（例如IdU）标记1小时，从而使新生DNA在缺口形成时被标记。在处理后加入诺考达唑（nocodazole），作用时间介于12至24小时之间，以将细胞阻滞在G2/M期，防止进入下一个S期。在诺考达唑处理的最后4小时内，向培养基中加入第二种胸苷类似物（例如CldU），使其在缺口填补过程中被掺入。重要的是，该实验仅可用于检测G2期的缺口填补事件，因为CldU的缺口填补信号无法与S期复制DNA中CldU掺入所产生的信号相区分。因此，为了最小化背景信号，CldU在损伤诱导后的掺入时间应与大多数细胞群体进入G2期的时间相吻合14。因此，该时间点将因细胞系和处理条件的不同而有所变化。建议在使用该实验前优化细胞周期进程。对这两种胸苷类似物进行共染色，可在由基因毒性处理期间生成ssDNA缺口时合成的新生DNA（IdU片段）上，观察到缺口填补（PRR）轨迹（CldU斑块）。

<table><tbody><tr><td>冰醋酸</td><td>合成</td><td>64-19-7</td><td>或者，BSA - Biosera - 货号 PM-T1725/100</td></tr><tr><td>氨水</td><td>合成</td><td>1336-21-6</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>抗体 anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td>-</td></tr><tr><td>抗体 anti-rat Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21470</td><td>-</td></tr><tr><td>抗体 小鼠抗BrdU</td><td>Becton Dickinson</td><td>347580</td><td>-</td></tr><tr><td>抗体 大鼠抗BrdU</td><td>Abcam</td><td>&amp;nbsp;Ab6326</td><td>-</td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>Pachane</td><td>PA 410</td><td>使用实验室中配备的通风橱</td></tr><tr><td>BSA（牛血清白蛋白）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>179693</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>CldU</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C6891</td><td>-</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>合成</td><td>7647-01-0</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>蔡司共聚焦 LSM 系列（7、8 或 9）</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>152460</td><td>或者，Olen - Kasvi 盖玻片（24 × 60 mm）- K5-2460</td></tr><tr><td>DMEM - 高糖</td><td>LGC/Gibco</td><td>BR30211-05/12100046</td><td>使用适用于所用细胞系的特定培养基。</td></tr><tr><td>EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐二水合物）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5314</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜 Axiovert 200</td><td>蔡司</td><td>-</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清）</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>Forma Series II 水套式 CO2 培养箱</td><td>Thermo Scientific 3110</td><td>13-998-074</td><td>使用实验室中的细胞培养箱</td></tr><tr><td>玻璃载玻片缸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5516</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-81-5</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>Idu</td><td>Millipore-Sigma</td><td>I7125</td><td>-</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>合成</td><td>7791-18-6</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>默克</td><td>67-56-1</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>丹维尔</td><td>M1021</td><td>或者，Olen - Kasvi 显微镜载玻片 - K5-7105 &lt;强&gt;或&lt;/strong&gt; 精密玻璃管 - 7105-1</td></tr><tr><td>MOPS（3-吗啉代丙磺酸）&amp;Aacute;cido 3-吗啉代丙烷 1-磺酸&amp;ocirc;nico</td><td>合成</td><td>1132-61-2</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>诺考达唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31430-18-9</td><td>-</td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲液）</td><td>Life Technologies</td><td>3002</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>任何用于免疫荧光的抗荧光淬灭封片剂均可使用</td></tr><tr><td>来自的S1核酸酶纯化自 &lt;em&gt;米曲霉&lt;/em&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>18001-016</td><td>将S1核酸酶用生产商提供的S1核酸酶稀释缓冲液预稀释（1/100 - 1/200），分装后于-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>SDS（十二烷基硫酸钠）</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>161-0302</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>三水合醋酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6131-90-4</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>合成</td><td>&amp;nbsp;7647-14-5</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-50-1</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>West 实验室研究</td><td>BP152-1</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>合成</td><td>9002-93-1</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>UVC 灯</td><td>非特异性</td><td>-</td><td>必需：254 nm 发射波长</td></tr><tr><td>VLX-3W 紫外辐射计</td><td>Vilber Loumart</td><td>-</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>乙酸锌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>557-34-6</td><td>或类似情况</td></tr></tbody></table>

利用dna纤维实验检测人细胞中复制后缺口的积累与修复

Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay

DNA纤维实验是一种简单且可靠的分析人细胞中DNA合成期间掺入的核苷酸类似物的方法，用于研究复制叉动态。然而，该技术的分辨率有限，仅为几千千碱基。因此，标准实验无法检测到低至数百个碱基的微小复制后单链DNA（ssDNA）缺口。本文介绍一种改良的DNA纤维实验方法，该方法利用S1核酸酶——一种特异性切割单链DNA的酶。当存在复制后ssDNA缺口时，S1核酸酶会靶向并切割这些缺口，产生较短的DNA片段，从而作为正在进行复制的复制叉上ssDNA缺口的检测指标。这些复制后ssDNA缺口是在受损DNA发生不连续复制时形成的，它们可以被修复 通过 与基因组复制无关的机制，这一过程被称为间隙填补或复制后修复。由于间隙填补机制涉及不依赖于S期的DNA合成，因此也可通过改变DNA纤维标记方案来监测间隙填补事件。总体而言，这些对DNA纤维实验的改进方法是研究人类细胞基因组中复制后间隙如何形成与填补的有力策略。

在 S1 纤维实验中，如果使用遗传毒性试剂处理导致复制后单链 DNA 缺口的产生，则与未经处理的样本以及经遗传毒性试剂处理但未进行 S1 切割的样本相比，经 DNA 损伤处理后 S1 处理的细胞核所获得的 DNA 纤维总长度会更短（图 1）。
或者，如果使用 S1 核酸酶处理对 DNA 纤维长度的影响与未处理细胞相比无明显差异，则可能存在以下几种解释：（1）在所使用的基因毒性试剂处理下，以及在特定的遗传背景下，未发生复制后单链 DNA 间隙（ssDNA gaps）的形成。事实上，我们此前已证明，在核苷酸切除修复缺陷（NER，XP-C 细胞）的细胞中，紫外线诱导的 6-4 光产物（6-4PP）会导致 ssDNA 间隙的形成，而环丁烷嘧啶二聚体（CPD）则不会14。（2）ssDNA 间隙已被修复，因而无法再被检测到。（3）由基因毒性试剂单独处理引起的 DNA 纤维缩短程度过于显著，从而掩盖了 S1 切割所导致的进一步缩短，使其无法被检测。
<p class="jove_c...

本文介绍了DNA纤维实验的两种改进方法，用于在诱导损伤后研究复制DNA中的单链DNA缺口。S1纤维实验利用特异性识别单链DNA的S1核酸内切酶来检测复制后缺口，而缺口填补实验则可用于可视化并定量分析缺口修复过程。

利用DNA纤维实验检测人细胞中复制后缺口的积累与修复

DNA纤维实验是一种基于核苷酸类似物免疫检测的简单且稳健的方法，用于分析复制叉动态，其中核苷酸类似物……

本方案为研究DNA损伤后复制过程的机制开辟了新的可能性。该技术能够检测与DNA损伤相对应的单链DNA缺口的形成与修复。S1核酸酶可切割单链DNA，从而实现对复制后缺口的检测。该方法最初由巴西的 Dr.Meneghini 和 Dr.Cordiero-Stone 于 20 世纪 70 年代首次使用，最近我们将其改进并应用于 DNA 纤维实验。利用此处所述技术研究复制后缺口的形成与修复，有助于深入理解维持基因组完整性的 DNA 修复机制及复制应激反应机制。对于本文所描述的 S1 纤维实验和缺口填补实验两种方案，均必须包含所有对照，以确保数据解读的准确性。该操作将由本实验室的博士生 Davi J. Martins 和曾在我课题组工作期间开发了这些技术的合作者 Annabel Quinet 博士进行演示。首先，吸除培养基，立即向细胞中加入含有 20 微摩尔 IDU 的培养基。将细胞在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下精确孵育 20 分钟。随后，用预热的PBS快速洗涤细胞两次，并用20焦耳/平方米的UV-C照射细胞。以未处理的细胞作为对照。立即向细胞中加入含有200微摩尔CldU的培养基，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下精确孵育60分钟。随后，用预热的 PBS 洗涤细胞两次，并根据细胞系在室温下用 CSK 100 缓冲液处理 2 至 10 分钟以进行透化。经 CSK 透化后，与透化前相比，可见细胞核几乎不含细胞质。洗涤时，小心沿每孔孔壁倾注 PBS，以清洗细胞核。然后，用S1缓冲液洗涤细胞核。将细胞核分别在含有20单位/毫升S1核酸酶和不含S1核酸酶的S1缓冲液中，于37摄氏度孵育30分钟。接着，吸去S1缓冲液，并加入含0.1% BSA的PBS。刮取细胞核并将其转移至一个大约标注为1.5毫升的离心管中。始终将离心管置于冰上。在4°C条件下，以约4,600 ×g离心5分钟。将沉淀重悬于PBS中，浓度约为每微升1,500个细胞。将试管置于冰上，并立即进行DNA纤维制备的铺展操作。用碳素铅笔在显微镜载玻片上做好标记，并将其平放在托盘上。轻弹管底以确保混匀，取2微升细胞加至相应载玻片顶部。加入6微升裂解缓冲液，上下吹打约5次以裂解细胞。用移液枪头将液滴轻轻向载玻片底部拉动，室温孵育5分钟，以裂解细胞核。将载玻片倾斜约20至40度，使液滴以恒定的低速扩散至载玻片底部。在室温避光条件下干燥10至15分钟。随后，将载玻片浸入含有新鲜配制固定液的容器中，在室温下孵育5分钟，以将DNA固定在载玻片上。用 PBS 清洗载玻片两次，每次五分钟，然后在室温下用新鲜配制的 2.5 摩尔盐酸变性 DNA 40 至 60 分钟。用 PBS 清洗载玻片三次，每次五分钟，再在 37 摄氏度下用预先温育的 5% BSA 封闭 30 至 60 分钟。轻轻拍打滤纸以去除载玻片上的多余液体。将 30 微升一抗以滴加方式加入载玻片，盖上盖玻片。在避光、湿润的室温环境中孵育 1 至 1.5 小时。将载玻片放入盛有 PBS 的染色缸中浸泡 1 至 2 分钟，然后小心移除盖玻片。用PBST在染色缸中洗涤三次，每次五分钟，然后将玻片置于PBS中。用纸轻轻拍打以去除多余液体，再向玻片上滴加30微升二抗。盖上盖玻片。在避光湿润的室温环境中孵育45至60分钟。重复洗涤载玻片并除去多余PBS的步骤一次，然后将20微升封片试剂逐滴加至载玻片上。盖上盖玻片，避免产生气泡。在载玻片顶部细胞裂解位置附近滴加一滴镜油。使用绿色通道，在背景中寻找绿色荧光点以找到焦平面。打开 Leica Application Suite 软件，点击采集（Acquire），并选择绿色通道。在分析前先调整绿色通道的设置。然后切换至红色通道并调整设置。找到纤维的主要聚集区域，再移动至边缘位置，寻找分布良好、无重叠的单根纤维。仅使用一个通道选择图片的区域，以避免潜在的偏差。单击“采集叠加”图标，并根据显微镜的正确放大倍数调整软件设置。每张切片在绿光通道下沿整个切片采集约15至20张图像，随后在红光通道下重复采集。两个通道现已合并，生成的叠加图像被移至一个独立的文件夹中。可以观察到呈红色和绿色的纤维。打开 ImageJ 软件，左键单击第五个图标，选择第二个选项，然后选择“分段线”工具。单击鼠标左键绘制红色或绿色纤维束的精确路径，单击右键停止绘制。按下键盘上的 M 键以测量长度。对于 S1 纤维，记录每根纤维的红色和绿色纤维束测量值，并从不同图像中至少 150 根纤维测量红色和绿色纤维束的长度。这些代表性图像显示了一条S1纤维。此处展示的是对照组新生DNA片段，该片段无缺口且对S1核酸酶切割具有抗性。经S1核酸酶切割后呈阳性的含缺口DNA片段导致CldU片段长度变短。可在文本手稿中广泛描述的差异标记方案用于标记缺口填补事件。在此称为缺口填补检测的实验中，较长的IDU轨迹若至少含有一个CldU斑块或含有较少的CldU斑块，则对应于低密度的缺口填补；而较短的IDU片段（至少含有一个CldU斑块）以及较长的IDU轨迹中含有较多CldU斑块的情况，则对应于高密度的缺口填补。本方案中的透化步骤对于 S1 核酸酶作用于受损 DNA 复制过程中形成的缺口至关重要。S1 核酸酶也可用于彗星试验方案中，以检测经处理后仍持续存在的受损 DNA 复制过程中所形成的缺口。S1 纤维试验为一种新范式奠定了基础，即复制后缺口可导致癌症脆弱性，特别是在携带 BRCA1 和 BRCA2 基因突变的乳腺癌和卵巢癌中。

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遗传学

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