利用DNA纤维实验检测人细胞中复制后缺口的积累与修复

本方案为研究DNA损伤后复制过程的机制开辟了新的可能性。该技术能够检测与DNA损伤相对应的单链DNA缺口的形成与修复。S1核酸酶可切割单链DNA，从而实现对复制后缺口的检测。

该方法最早于20世纪70年代在巴西由Dr. Meneghini和Dr. Cordiero-Stone首次使用，近期我们将其改进并应用于DNA纤维实验。利用此处所述技术研究复制后缺口的形成与修复，有助于深入了解维持基因组完整性的DNA修复机制及复制应激反应。对于本文描述的两种实验方案——S1纤维实验和缺口填补实验——均必须包含所有必要的对照，以确保对数据的准确解读。

该实验步骤将由本实验室的博士生Davi J.Martins和曾在我课题组工作期间开发了这些技术的合作者Annabel Quinet博士进行演示。首先，吸除培养基，立即向细胞中加入含有20 µM IDU的培养基。将细胞在37 °C、5% CO₂条件下精确孵育20分钟。

随后，用预热的PBS快速洗涤细胞两次，并用20焦耳/平方米的UV-C照射细胞。以未处理的细胞作为对照。立即向细胞中加入含有200微摩尔CldU的培养基，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下精确孵育60分钟。

随后，用预热的 PBS 洗涤细胞两次，并根据细胞系在室温下用 CSK 100 缓冲液处理 2 至 10 分钟以进行透化。经过 CSK 透化后，与透化前相比，可见细胞核几乎不含细胞质。为洗涤细胞核，需小心地沿每个孔的孔壁倾倒 PBS。

然后，用S1缓冲液洗涤细胞核。将细胞核分别在含有20单位/毫升S1核酸酶和不含S1核酸酶的S1缓冲液中，于37摄氏度孵育30分钟。接着，吸去S1缓冲液，加入含0.1% BSA的PBS。

刮取细胞核并转移至一个大约标注为1.5毫升的离心管中。始终将离心管置于冰上。在4°C条件下，以约4,600 ×g离心5分钟。

将沉淀重悬于PBS中，浓度约为每微升1,500个细胞。将试管置于冰上，并立即进行DNA纤维制备的涂片操作。用碳素铅笔在显微镜载玻片上做好标记，并将其平放在托盘上。

轻弹管底以确保混匀，取2微升细胞加至相应载玻片表面。加入6微升裂解缓冲液，上下吹打约5次以裂解细胞。用移液枪头将液滴轻轻向载玻片底部拉动，室温孵育5分钟，以裂解细胞核。

将载玻片倾斜约20至40度，使液滴以恒定的低速扩散至载玻片底部。在室温避光条件下干燥10至15分钟。随后，将载玻片浸入含有新鲜配制固定液的容器中，在室温下孵育5分钟，以将DNA固定在载玻片上。

用 PBS 清洗载玻片两次，每次五分钟，然后在室温下用新鲜配制的 2.5 摩尔盐酸变性 DNA 40 至 60 分钟。用 PBS 清洗载玻片三次，每次五分钟，随后在 37 摄氏度下用预先温育的 5% BSA 封闭 30 至 60 分钟。轻轻在纸巾上拍打载玻片，以去除多余的液体。

将30微升一抗溶液逐滴加入载玻片上，盖上盖玻片。在避光、湿润的室温环境中孵育1至1.5小时。将载玻片放入盛有PBS的染色缸中浸泡1至2分钟，然后小心移除盖玻片。

在烧杯中用PBST洗涤三次，每次五分钟，然后将切片置于PBS中。用纸轻轻拍打以去除多余液体，并在切片上滴加30 µL二抗。盖上盖玻片。

在避光湿润的环境中室温孵育45至60分钟。重复洗涤载玻片并除去多余PBS的步骤一次，然后向载玻片上滴加20微升封片试剂。盖上盖玻片，避免产生气泡。

在载玻片顶部细胞裂解处附近滴加一滴镜油。使用绿色通道，在背景中寻找绿色荧光点以找到焦平面。打开 Leica Application Suite 软件，点击采集，然后选择绿色通道。

在分析前先调整绿色通道的设置。然后切换至红色通道并调整设置。找到纤维的主要聚集区域，并移至边缘以寻找分布良好、无重叠的单根纤维。

仅使用一个通道选择图像的区域，以避免潜在的偏差。单击“采集叠加”图标，并根据显微镜的正确放大倍数调整软件设置。每张切片在绿色通道下沿整个切片采集约15至20张图像，随后在红色通道下重复采集。

两个通道现已合并，生成的叠加图像被移至一个独立的文件夹中。可以观察到呈红色和绿色的纤维。打开 ImageJ 软件，左键单击第五个图标，选择第二个选项，然后选择“分段线”工具。

单击鼠标左键绘制红色或绿色纤维束的精确路径，单击鼠标右键停止绘制。按下键盘上的 M 键以测量长度。对于 S1 纤维，记录每根纤维的红色和绿色纤维束测量值，并从不同图片中至少 150 根纤维测量红色和绿色纤维束的长度。

这些代表性图像显示了一条S1纤维。此处展示的是对照组新生DNA片段，该片段无缺口，且对S1核酸酶的切割具有抗性。经S1核酸酶切割后呈阳性的含缺口DNA片段导致CldU片段长度变短。

可在文本稿件中广泛描述的一种差异标记方案可用于标记缺口填补事件。在此项称为缺口填补检测的实验中，较长的IDU轨迹若至少含有一个CldU斑块或含有较少的CldU斑块，则对应于低密度的缺口填补；而较短的IDU片段（至少含有一个CldU斑块）以及较长的IDU轨迹但含有较多CldU斑块的情况，则对应于高密度的缺口填补。

本方案中的透化步骤对于S1核酸酶作用于受损DNA复制过程中形成的缺口至关重要。S1核酸酶也可用于彗星实验方案中，以检测经处理后仍持续存在的受损DNA复制过程中所形成的缺口。S1纤维实验奠定了新的研究范式，即复制后缺口可导致癌症的脆弱性，特别是在携带BRCA1和2基因突变的乳腺癌和卵巢癌中。