2022年1月20日
离子淌度光谱法(IMS)是质谱法表征生物分子的有趣补充,特别是因为它对异构体敏感。该协议描述了串联IMS(IMS / IMS)实验,该实验允许分离分子并生成其片段的迁移率曲线。
该协议描述了如何在质谱仪中记录分子活化时产生的片段的离子迁移率曲线,并区分异构体结构。该协议允许聚糖根据其一些关键结构特征分为11组,从而提供难以获得的信息。它可以用于构建非常通用的分子网络,适用于许多分子家族,例如许多研究领域感兴趣的代谢物或药物。
这种方法充分利用了离子淌度光谱法的新概念,并且在仅靠质谱法无法区分两个结构的情况下非常有用。该实验需要对质谱和离子淌度的良好掌握。但是,如果仔细遵循每个步骤,则实验者应该成功实现该方法。
演示该程序的将是西蒙·奥利维尔(Simon Ollivier),他是我实验室的博士生。首先,从"调谐"页面设置单通道 IMS 序列,将仪器置于移动模式,然后打开"循环序列控制"窗口。从此新窗口的循环函数选项卡中选择高级模式,选择添加捆绑包,然后选择单/多通道。
等待一系列移动事件出现在同一窗口的"序列"选项卡中。调整顺序,使所有校准离子在循环IMS赛道上进行一次通过。请勿更改"注入"时间或"弹出"和"获取"时间,请将"分离"时间降低到一毫秒。
如果校准混合物的某些离子不适合显示的到达时间窗口,请在ADC设置选项卡中增加每个箱的推力次数,以更改IMS与正交加速度TOF分析仪的推杆的同步。要在"循环序列控制"窗口中录制两分钟的采集,请单击"采集"以打开"采集设置"弹出窗口,输入"文件名"、"描述"和"采集时长"、"分钟",然后单击"保存"。从 MS 调谐页面将仪器切换到 TOF 模式,以检查信号的稳定性。
记录样品的完整MS采集一分钟,这对于检查同位素模式和潜在污染物的存在非常有用。将仪器置于 MSMS 模式,从主调谐页面的四分频/毫秒配置文件选项卡。在MSMS质量场中选择目标铁的质量,以便在四极杆中进行隔离。
记录一分钟的采集,以在处理数据时检查前体隔离。要对目标异构体执行基于迁移率的选择,请在"循环序列控制"窗口中将仪器切换到迁移率模式,从"循环函数"选项卡中选择"添加捆绑包",然后选择"切片"。等待复杂的移动事件序列出现在"序列"选项卡中。
将"弹出并获取"事件放在第一个"单独"事件之后,然后单击"运行"。查找要实时显示的初始分离结果。通过更改序列中此事件的时间值,直到 IMS 峰值的分辨率令人满意,来增加多通道分离的第一个 Separate 事件的持续时间。
记录一分钟的采集以供参考。单击暂停,将"弹出并获取"事件放在"弹出"、"弹出到预存储"和"保留并弹出"事件下方。调整事件的持续时间,使目标峰值位于"弹出到预存储"区域中,而任何其他离子位于"弹出"或"保留并弹出"区域。
将"弹出和获取"事件放在序列末尾的"从预存储重新输入"和第二个"单独"事件的下方。单击"运行"以显示所选人口。检查隔离的质量。
记录一分钟的采集以供参考。在"序列"选项卡中,在用户定义的事件时间旁边的列中,查找所有事件的汇总时间。请注意在"从预存储重新注射"事件行中找到的 Time Abs,用于执行 CCS 校准。
将直接进行"弹出"和"获取"的"分离"事件的持续时间设置为一毫秒。在"从预存储重新输入"行中,勾选"启用激活"框,并使用内置控件优化碎片。如果分段与内置控件不符,请取消选中启用激活框,然后继续手动优化重新注入电压,增加预阵列梯度,并降低阵列偏移电压,直到结果令人满意。
要在"采集"弹出窗口中记录两分钟的采集,请勾选"保留漂移时间"选项以生成仅包含到达时间的文件,而不是标记为_dt.raw的 M 对 Z。在对阿拉伯木聚糖五糖混合物进行MS分析后,光谱显示出同位素模式,在Z 685.24的M处具有单个峰,表明这两种化合物本质上是异构体的。通过环状IMS细胞分离五糖的加合物,并分离出三个峰,具有不同的到达时间。
纯 XA3XX 在 83 和 90 毫秒处显示峰值,而 XA2XX 在 94 毫秒处显示峰值。在IMS分离的第一阶段后,抛出属于XA3XX的离子,并选择94毫秒处的峰值进行IMS-IMS分析。在没有激活的情况下重新注入离子后进行三次分离,并在199毫秒处获得XA2XX的峰值。
生成的IMS-IMS MS数据使用到达时间和M在Z维度上进行去卷积,从而生成IMS-IMS光谱。将相对强度高于0.2%的峰值导出用于CCS校准,从而得到质心CCS校准的IMS-IMS光谱。检查前体离子的分离始终很重要,否则,光谱可能来自目标化合物和污染物的混合物。
我们以前使用IMS-IMS光谱来构建网络并对化合物进行分类,但它们也可用于搜索数据库以进行化合物鉴定。这项技术是最近才出现的,但我们预计它将在糖组学以及分析师面对异构体分子的任何环境中非常有用。
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该协议概述了一种串联离子迁移率谱仪(IMS/IMS)实验,用于表征生物分子,特别关注异构体鉴别。它能够将糖类分类为不同的结构组,从而促进分子网络的构建。
Cyclic ion mobility spectrometry (IMS/IMS) enables high-resolution structural discrimination of isomeric biomolecules, addressing a critical gap in analytical confidence for glycomics and complex metabolite profiling. This capability strengthens early discovery and target validation by providing molecular fingerprints that mass spectrometry alone cannot resolve, supporting risk-adjusted portfolio decisions. The method's reproducibility and structural specificity position it as a strategic asset for biopharma R&D pipelines confronting isomeric complexity.
Cyclic IMS/IMS integrates into the analytical discovery continuum, bridging early discovery, lead identification, and preclinical workflows where isomeric discrimination is essential.