Name: 使用循环离子淌度光谱仪进行串联离子淌度实验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学习使用循环离子淌度光谱仪进行串联离子淌度实验，用于生物分子表征和异构体鉴别。该方法可将聚糖分类为11个结构组，构建适用于代谢物和药物等多种分子家族的分子网络，为传统质谱难以区分的结构提供关键信息。

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S.O. 感谢法国国家科研署对其博士研究的资助（项目编号 ANR-18-CE29-0006）。

作者声明无利益冲突。

SELECT SERIES Cyclic IMS 是一种强大的工具，能够在无需上游色谱分离的情况下，选择特定质荷比（m/z）和离子淌度的离子群体。该仪器可生成该离子群体的二维碎片图谱，并从中提取出 MS/MS 和 IMS/IMS 谱图。然而，用户在实验过程中必须注意若干需要特别关注的关键点。
首先，用户应仔细检查质谱隔离窗口中是否存在可能的同重数干扰物。实际上，四极杆的隔离窗口相对较宽，了解可能在四极杆中被共选出的、m/z 略有差异的离子，将有助于用户在离子淌度中正确指认目标峰。
其次，在进行初始分离时，操作者必须确保所有离子在循环离子淌度池中经历相同次数的循环。这是循环式装置中离子淌度分离的一个重要且关键的环节。若对特定离子的循环次数评估错误，可能导致峰的错误鉴定与误读。由于单次循环路径较短（约1米），不同离子群体的循环次数控制较为困难，淌度差异较大的物种可能迅速发生重叠。
特别地，当离子群通过时，若阵列改变方向，则一个峰可能在两次不...

对生物分子进行全面的化学表征是理解其潜在生物学功能特性的关键。为此，近年来发展出了&#34;组学&#34;科学，旨在对生物浓度下的化学结构进行大规模表征。在蛋白质组学和代谢组学中，质谱（MS）已成为揭示生物介质中结构异质性的核心技术，这尤其得益于其高灵敏度以及通过串联质谱（MS/MS）提供结构信息的能力。在MS/MS策略中，首先根据质量选择某一离子，随后使其碎裂，最终采集其碎片的质量，从而建立该分子的指纹图谱。MS/MS谱图尤其可用于比对谱图数据库1,2，或尝试重建母体结构3,4。基于“相似谱图对应相似化合物”的假设，MS/MS数据还可用于构建分子网络（MNs），通过相似性评分将相关分子物种相互关联5,6。
然而，由于质谱（MS）技术本质上只能检测离子的质荷比（m/z），该方法对多种处于（立体）异构范围内的结构特征不敏感。例如，碳水化合物由多个单糖亚基组成，其中许多互为立体异构体，甚至为差向异构体（如 Glc 与 Gal，或 Glc 与 Man）。这些亚基通过糖苷键连接，而糖苷键在连接位置（位置异构）和异头碳的立体构型（异头异构）上可能存在差异。这些特性使得单独使用质谱难以区分碳水化合物异构体7，仅能通过高能活化方法解决位置异构问题8,9,10。尽管衍生化是一种打破立体异构基团等价性的可行方法11，但其需要复杂的样品前处理。另一种更直接的方法是将质谱与对异构现象敏感的分析维度联用，例如离子迁移谱（IMS）。
由于本方案面向已熟悉离子淌度质谱（IMS）基本概念的用户，且相关详细综述已在其他文献中发表12,13，此处仅对IMS的基本原理作简要概述。IMS是一种气相分离技术，依赖离子与缓冲气体及电场之间的相互作用，最终根据离子的气相构象实现分离。目前商用仪器中可采用多种不同原理的IMS与质谱（MS）联用技术：部分仪器在交变的高、低电场下运行（非对称场离子淌度分离，FAIMS），而大多数则在低电场条件下运行，主要包括漂移管离子淌度分离（DTIMS，线性递减电场）、行波离子淌度分离（TWIMS，对称电势波）以及捕集式离子淌度分离（TIMS，利用高速缓冲气流对抗电场以捕获离子）13。低电场方法可获得一种称为碰撞截面（CCS）的参数，该参数表征离子-气体对在分离过程中相互作用的有效表面积（单位为 Å2 或 nm2）。理论上，CCS与仪器无关，因此可用于生成可在不同实验室间重复验证的数据14。离子淌度分离可能受到多种参数的影响，尤其是迁移池内气体压力和温度的波动。通过CCS校准可有效缓解此类影响，因为校准物和待测物会受到相似的环境影响13。然而，必须将仪器安装在温度可控的环境中，并配备可靠的气体压力控制系统。
离子迁移谱（IMS）的一个有趣发展是IMS/IMS，该技术由Clemmer团队于2006年首次提出，可视为质谱/质谱（MS/MS）的类比方法15,16。在IMS/IMS中，首先根据目标离子的离子迁移率对其进行选择性分离；随后对该离子进行活化（直至可能发生碎裂），并对活化后的离子或其碎片重新进行一次IMS分析。最初的仪器设计将两个IMS单元串联排列，中间通过一个离子漏斗连接，活化过程即在该漏斗处进行。自那时以来，尽管已有多种IMS/IMS装置被提出（综述见Eldrid和Thalassinos17），但首台具备IMS/IMS功能的商用质谱仪直到2019年才问世18。该仪器通过引入另一项技术突破——IMS单元的循环设计，显著改进了最初的概念。
循环离子迁移谱（IMS）单元理论上可近乎无限地增加漂移路径长度，从而提高仪器的分辨能力19。这一目标通过特殊的仪器几何结构实现，其中循环行波离子迁移谱（TWIMS）单元被垂直置于主离子光学轴线上。在IMS单元入口处设有多功能阵列区域，可控制离子路径的方向：(i) 将离子侧向导入以进行IMS分离，(ii) 向前传输至质谱（MS）检测器进行检测，或 (iii) 从IMS单元反向返回并储存至前置阵列单元。从该前置储存单元中，离子可被激活，其碎片重新注入IMS单元进行离子淌度测量，该方法已成功用于立体异构体的表征20。最终获得的数据包含前体离子及其碎片的离子淌度和m/z信息。
在最近一项使用该环状设计进行聚糖分析的研究中（Ollivier 等）21），我们证明了此类离子迁移谱/离子迁移谱（IMS/IMS）数据中片段的迁移率谱可作为生物分子的“指纹”，并可用于分子网络分析策略。由此构建的网络称为离子迁移分子网络（IM-MN），能够以结构相关的方式对糖组学数据集进行组织，而仅基于串联质谱（MS/MS）数据构建的网络（MS-MN）则提供的信息有限。为补充该研究并帮助使用环状离子迁移谱（Cyclic IMS）的用户实施该工作流程，本实验方案详细描述了数据采集的完整流程。本方案仅聚焦于生成可用于构建IM-MN网络的IMS/IMS数据（参见21）或任何其他自选应用。本文不讨论IM-MN的构建，因为分子网络的实验方案已有公开资源可供参考。22. 为获得有价值且可重复的 IMS/IMS 采集结果，必须遵循的关键步骤将被重点强调。以 Ollivier 研究的寡糖之一为例 等21，具体步骤如下：（i）样品制备，（ii）环状离子淌度谱（Cyclic IMS）仪器调谐，（iii）数据的自动峰提取，以及（iv）碰撞截面（CCS）校准。

<table><tbody><tr><td>33-&amp;alpha;-L- 与 23-&amp;alpha;-L-阿拉伯呋喃糖基-木寡四糖（XA3XX/XA2XX）混合物</td><td>Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland</td><td>O-XAXXMIX</td><td>XA&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;XX + XA&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;XX 混合物</td></tr><tr><td>33-&amp;alpha;-L-阿拉伯呋喃糖基-木寡四糖（XA3XX）</td><td>Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland</td><td>O-XA3XX</td><td>纯 XA&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;XX 标准品</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 离心管，1.5 mL，Eppendorf 品质，无色，1,000 支</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>0030120086</td><td>用于制备碳水化合物储备液及其稀释液</td></tr><tr><td>FALCON 50 mL 聚丙烯锥形离心管，30 × 115 mm</td><td>Corning Science M&amp;eacute;xico S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico</td><td>352070</td><td>用于制备 100 mM LiCl 水溶液储备液</td></tr><tr><td>氯化锂（ACS 级试剂，&amp;ge;99%）</td><td>Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France</td><td>310468</td><td>用于向样品中掺杂锂离子</td></tr><tr><td>Major Mix IMS/Tof 校准试剂盒</td><td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td><td>186008113</td><td>质谱与离子淌度校准溶液</td></tr><tr><td>MassLynx 4.2 SCN1016 版本 6（Waters 嵌入式分析平台，Cyclic IMS 2.9.1 版本 9）</td><td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td><td>721022377</td><td>用于仪器控制与数据处理的 Cyclic IMS 厂商软件</td></tr><tr><td>用于 HPLC 的甲醇，PLUS 梯度级</td><td>Carlo-Erba Reagents, Val de Reuil, France</td><td>412383</td><td>高纯度溶剂</td></tr><tr><td>MS 亮氨酸脑啡肽试剂盒</td><td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td><td>700002456</td><td>用于质谱仪调谐的参考化合物</td></tr><tr><td>SCHOTT DURAN 100 mL 硼硅酸盐玻璃瓶</td><td>VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US</td><td>218012458</td><td>用于制备 50:50 MeOH/水溶液中 500 &amp;micro;M LiCl 溶液</td></tr><tr><td>SELECT SERIES Cyclic IMS</td><td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td><td>186009432</td><td>配备环形离子淌度池的离子淌度-质谱联用仪</td></tr><tr><td>网站：http://mzmine.github.io/</td><td>MZmine 开发团队</td><td>-</td><td>MZmine 软件下载链接</td></tr><tr><td>网站：https://github.com/siollivier/IM-MN</td><td>INRAE, UR BIA, BIBS 设施，南特，法国</td><td>-</td><td>内部 R 脚本下载链接，包含 CCS 校准函数</td></tr></tbody></table>

使用环形离子淌度质谱仪进行串联离子淌度实验

Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments

准确表征化学结构对于理解其潜在的生物学机制和功能特性至关重要。质谱法（MS）是一种常用工具，但并不总是足以完全揭示所有结构特征。例如，尽管碳水化合物具有重要的生物学意义，但由于存在多个层次的异构现象，其表征过程十分复杂。离子淌度谱法（IMS）是一种很有前景的补充技术，因为它对离子构象敏感，因而能够区分异构体。
此外，近年来的技术进步显著改进了该方法：与线性离子淌度谱（IMS）仪器相比，新一代的环状离子淌度谱（Cyclic IMS）仪器提供了更多功能，例如更高的分辨能力，或进行串联离子淌度（IMS/IMS）实验的可能性。在IMS/IMS实验中，首先根据离子的淌度选择特定离子，随后将其碎裂并重新分析，以获得其碎片的离子淌度信息。最近的研究表明，此类IMS/IMS数据中碎片的淌度谱图可作为特定聚糖的“指纹”特征，并可用于分子网络分析策略，以在结构上合理的方式对糖组学数据集进行组织。
本实验方案的目标是描述如何从样品制备到离子淌度维度的碰撞截面（CCS）校准，获得可重复的质谱谱图，从而生成IMS/IMS数据。以一种代表性糖链为例，本方案将展示如何在环形离子淌度质谱仪（Cyclic IMS）上构建IMS/IMS控制序列，如何利用该控制序列将离子到达时间转换为漂移时间（即实际施加于离子的分离时间），以及如何从原始数据中提取相关的淌度信息。本方案旨在清晰阐明IMS/IMS实验中的关键步骤，帮助初次使用环形离子淌度质谱仪的研究人员顺利完成简单且可重复的数据采集。

以阿拉伯木聚糖五糖 XA2XX 为例说明本实验方案。该化合物可商业获得，但仅以与另一种阿拉伯木聚糖五糖 XA3XX 的混合物形式提供（纯的 XA3XX 也可商业获得）。XA2XX 和 XA3XX 的结构见补充图 S1。由于商业混合物中 XA2XX 与 XA3XX 的比例约为 50:50，因此配制浓度为 20 µg/mL 的混合物溶液，以在 50:50 MeOH/H2O + 500 µM LiCl 体系中使 XA2XX 的浓度达到约 10 µg/mL。
首先，采用高分辨质谱对 XA2XX + XA3XX 混合物进行质谱分析。由于这两种化合物为同分异构体，仅在 [M+Li]+m/z 685.24 处观察到一个单一质谱峰。通过四极杆选择该质谱峰，并调整选择窗口以去除 -1 Da...

离子淌度质谱法（IMS）是质谱技术在生物分子表征方面的一种有益补充，尤其因为它对同分异构现象具有敏感性。本方案描述了一种串联离子淌度（IMS/IMS）实验，可实现对特定分子的选择性分离，并生成其碎片的淌度谱图。

准确表征化学结构对于理解其潜在的生物学机制和功能特性至关重要。质谱...

本方案描述了如何记录分子在质谱仪中活化后所产生的碎片的离子淌度谱图，并用于区分异构体结构。该方案可将糖类根据其某些关键结构特征分为11类，从而提供其他方法难以获得的信息。该方法可用于构建分子网络，此类网络具有高度通用性，适用于多种分子家族，如在多个研究领域中具有重要意义的代谢物或药物。该方法充分利用了离子淌度谱学中的一个新概念，在质谱法单独无法区分两种结构的情况下尤为有用。实验要求熟练掌握质谱技术和离子淌度技术。然而，只要严格遵循每一步操作，实验者应能成功实施该方法。本实验操作将由我实验室的博士生 Simon Ollivier 进行演示。首先，在 Tune 页面中设置单次通过的 IMS 序列，将仪器置于 Mobility 模式，然后打开 Cyclic Sequence Control 窗口。在该新窗口的 Cyclic Functions 选项卡中选择 Advanced 模式，点击 Add Bundle，然后选择 Single/Multipass。等待一系列迁移事件出现在同一窗口的“序列”选项卡中。调整该序列，使所有校准离子在环形离子迁移谱赛道上仅完成一次循环。请勿更改注入时间或射出与采集时间，但将分离时间降低至一毫秒。如果校准混合物中的某些离子未落在显示的到达时间窗口内，可通过在ADC设置选项卡中增加每个时间通道的推扫次数，来调整离子迁移谱（IMS）与正交加速飞行时间（TOF）分析器推扫器之间的同步。在循环序列控制窗口中，若要记录两分钟的采集数据，请点击“采集”（Acquire）以打开采集设置弹窗，输入文件名、描述信息和采集时长（分钟），然后点击保存。从质谱调谐（MS Tune）页面将仪器切换至TOF模式，以检查信号的稳定性。对样品进行一分钟的全扫描质谱采集，以用于检查同位素分布模式及潜在污染物的存在情况。在主调谐页面的四极杆/质谱轮廓选项卡中，将仪器设置为MS/MS模式。在MS/MS质量字段中选择目标铁离子的质量，以便在四极杆中进行离子隔离。在处理数据时，记录一分钟的采集以检查前体离子的隔离情况。为了基于淌度选择目标异构体，请在循环序列控制窗口中将仪器切换至淌度模式，从循环功能选项卡中选择添加序列包，然后选择切片。等待一系列复杂的淌度事件出现在序列选项卡中。将弹出和采集事件置于第一次分离事件之后，然后单击运行。实时观察初始分离的结果。通过在序列中调整该事件的时间值，延长第一次分离事件的持续时间，以实现多次分离，直至离子迁移谱峰的分辨率令人满意为止。记录一分钟的采集数据作为参考。单击“暂停”，将“弹出并采集”事件置于“弹出”、“弹出至预存储”以及“保持并弹出”事件下方。调整各事件的持续时间，使目标峰位于“弹出至预存储”区域，而其他任何离子则处于“弹出”或“保持并弹出”区域。将弹出和采集事件置于序列末端，位于从预存区重新注入和第二次分离事件的下方。单击运行以显示选定的细胞群，并检查分离效果的质量。记录一分钟的采集数据作为参考。在“序列”选项卡中，查看用户自定义事件时间旁的一列，找到所有事件时间的累计总和。记录“从预存储重新进样”事件所在行的绝对时间（Time Abs），用于进行CCS校准。将紧接“弹出并采集”之前的“分离”事件持续时间设置为一毫秒。在“从预存储重新注入”行中，勾选“启用激活”复选框，并使用内置控件优化碎裂效果。若使用内置控件无法获得满意的碎裂效果，则取消勾选“启用激活”复选框，转而手动优化重新注入电压，提高预阵列梯度，并降低阵列偏置电压，直至结果满意为止。在“采集”弹出窗口中，为记录两分钟的采集数据，请勾选“保留漂移时间”选项，以生成仅包含到达时间、标记为 _dt.raw 的文件。对阿拉伯木聚糖五糖混合物进行质谱分析后，谱图显示同位素分布模式，在质荷比（M/Z）685.24 处出现单一峰，表明这两种化合物具有异构体性质。五糖的加合物通过环形离子迁移谱（IMS）池分离，得到三个具有不同到达时间的峰。纯 XA3XX 在 83 毫秒和 90 毫秒处显示出峰，而 XA2XX 在 94 毫秒处出现峰。在第一级 IMS 分离后，属于 XA3XX 的离子被剔除，选择 94 毫秒处的峰进行 IMS-IMS 分析。在未活化的情况下将离子重新注入后，进行了三遍分离，在 199 毫秒处获得了 XA2XX 的峰。利用到达时间与质荷比维度对生成的离子迁移谱-离子迁移谱-质谱（IMS-IMS MS）数据进行去卷积，得到离子迁移谱-离子迁移谱谱图。将相对强度高于0.2%的峰导出用于碰撞截面（CCS）校准，从而获得经质心化和CCS校准的离子迁移谱-离子迁移谱谱图。必须始终检查前体离子的分离情况，否则谱图可能来源于目标化合物与杂质的混合物。我们此前曾利用IMS-IMS谱图构建网络并对化合物进行分类，但该技术也可用于与数据库比对以鉴定化合物。该方法非常新颖，但我们预计其在糖组学以及任何需要应对异构体分子的分析场景中都将极具应用价值。

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