一个 体外 研究线粒体功能障碍的方法：一种胞质杂交模型

细胞质杂交技术仍是目前研究任何新型线粒体DNA突变致病作用以及关联异质性比例与疾病严重程度的前沿方法。该技术可在均一的核背景下进行生化分析，从而排除患者自身核背景的干扰。此技术可用于验证线粒体DNA突变的致病性。

并使其在生物化学水平上研究其影响成为可能。使用两毫升不含钙和镁的1×PBS，将含有成纤维细胞的35毫米培养皿清洗两次。用70%乙醇擦拭培养皿的外表面，并等待乙醇挥发。取下培养皿的盖子以及瓶子的螺旋盖。

将每个无盖培养皿倒置于各250毫升离心瓶底部。缓慢向每个瓶中加入32毫升成核培养基，使培养基流入培养皿并与细胞接触。使用长玻璃巴斯德移液管去除培养皿中的气泡，移液管尖端需在本生灯火焰中弯曲。

用螺旋盖将每个瓶子拧紧，并转移至离心机中。在 37 °C 条件下以 8,000 × g 离心 20 分钟。吸去瓶中的培养基并弃去。将瓶子倒置在先前喷有 70% 乙醇的无菌纱布上，以取出培养皿。

用70%乙醇清洁培养皿及其皿盖的外表面，待乙醇挥发后将培养皿盖好。在继续操作前，使用倒置显微镜检查活细胞的胞质分裂球形成情况。观察由于细胞松弛素诱导细胞核挤出而导致的成纤维细胞极度伸长现象。

向每个35毫米培养皿中加入1,000,143 row zero细胞，用2毫升含5% FBS的培养基重悬。将培养皿置于加湿的二氧化碳培养箱中孵育3小时，使143 row zero细胞在ghosts上贴附。

孵育三小时后，吸去并弃去培养基。用两毫升无血清的DMEM高糖培养基或MEM洗涤贴壁细胞两次，然后吸去并弃去培养基。向细胞中加入500微升聚乙二醇溶液，准确孵育一分钟。

吸弃聚乙二醇溶液，用不含血清的DMEM高糖培养基或MEM洗涤细胞三次，每次两毫升。加入两毫升融合培养基，在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育过夜。

将剩余培养皿中的细胞进行胰蛋白酶消化，计数后接种到一个或多个培养皿中，在添加补充物的培养基中每皿接种50至100个细胞，直至克隆形成。随后继续培养数天。使用体视显微镜，用克隆环或移液器吸头从培养皿中挑取克隆。

尽量避免混合不同的克隆，而是将其分别转移至96孔板中，每孔含有200 µL的添加补充物的培养基。胞质杂交细胞（cybrids）系由携带异质性M2343A2G突变的患者来源的成纤维细胞建立，该突变为最常见的线粒体DNA突变之一，与线粒体肌病、脑病、乳酸酸中毒及中风样发作相关。对可变数目串联重复序列的分析显示，胞质杂交细胞的线粒体DNA与第零代细胞完全一致，证实了患者原有的线粒体DNA已被143B细胞的基因组所取代。

限制性片段长度多态性分析或测序分析可用于检测线粒体DNA突变的存在及其异质性百分比。在实施本方案时，重要的是要验证细胞核和线粒体DNA的正确遗传背景，以及再群体化胞质杂交细胞中线粒体DNA的含量。