Name: 导管内递送和X射线可视化乙醇烧蚀溶液在小鼠模型中预防和局部治疗乳腺癌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: 了解导管内注射乙醇消融溶液预防乳腺癌的方法，利用小鼠模型实现靶向递送和X射线成像。该技术可精确定位乳腺上皮细胞并减少组织损伤，为乳腺癌预防研究提供新平台。

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本工作部分得到了美国国家癌症研究所授予 LFS 的 R21 CA226579 和 R01 CA258314 基金以及美国国家生物医学成像与生物工程研究所授予 EMS 的 R01 EB029418 基金的支持。我们感谢密歇根州立大学定量健康科学与工程研究所（IQ）成像核心设施提供成像系统和技术支持。我们感谢 Danielle Ferguson 博士对视频内容及图示是否符合动物福利指南进行审阅。

本文所述所有实验均在密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会批准的协议下进行。
1. 长效抗炎治疗
<ol>
	<li>确保接受含有乙醇（EtOH）或其他潜在刺激性物质注射液的小鼠，在注射前2天至注射后7天期间接受抗炎治疗。首选给药方式是通过含有适当浓度卡洛芬（carprofen）的蔗糖素凝胶杯进行口服给药。</li>
	<li>配制所需浓度的卡洛芬溶液。本实验中，将储备液（50 mg/mL）用无菌PBS稀释，配制成2 mg/mL的工作溶液，每只小鼠注射0.5 mL，以达到每杯最终剂量为1 mg。在所需稀释总体积中，用1% v/v无菌蓝色食用染料（BFD）替代部分PBS，以便更清楚地观察药物在蔗糖素凝胶中的混合是否完全。</li>
	<li>按照制造商的建议准备用于添加卡洛芬的凝胶杯。除非另有说明，将杯子置于60 °C水浴中15分钟。取出杯子并擦干，以尽量减少污染的可能性。
	<ol>
		<li>使用70%乙醇（EtOH）或乙醇擦拭巾清洁杯盖表面，并待其干燥。使用注射器将所需体积的卡洛芬溶液穿过杯盖注入。本实验中注入500 µL。用贴纸覆盖注射部位，并剧烈摇晃15秒。</li>
		<li>涡旋混匀杯子15秒，然后在肉眼确认药物完全混合后储存备用。通过观察是否存在深蓝色团块来检查杯子中混合是否均匀。在将杯子转移至冰箱储存前，使其恢复至室温，可储存长达一个月。 
		&#8203;注意：根据需要，这些杯子在加药后也可在室温下储存，但需注意遵循制造商关于药物有效性的指导建议。在贴纸上标注日期有助于记录注射时间，同时避免使用笔或尖锐记号笔刺穿杯盖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用前，用70%乙醇擦拭杯子外表面。揭开盖子，将杯子放入小鼠笼内。每隔一天更换一次杯子，或在杯子空时及时更换。一个杯子可供最多五只小鼠使用1至2天。</li>
</ol>
2. 术前准备
注意：此步骤将在注射前 2-3 天进行。
<ol>
	<li>使用异氟烷蒸发器（2%–3% 异氟烷，1.5 L/min 氧气）对小鼠进行麻醉，并涂抹眼用润滑剂。在整个操作过程中，根据需要通过鼻罩维持 1%–3% 异氟烷麻醉，同时密切监测动物的呼吸频率。</li>
	<li>在鼻罩麻醉期间，向小鼠眼部涂抹眼用润滑剂，随后将小鼠仰卧位固定。使用棉签将非处方脱毛膏涂抹于乳头区域（即待注射的乳腺区域），并用棉签在该区域揉搓 10–30 秒，以快速松动毛发。 
	注意：脱毛膏在动物体表停留时间不应超过必要时长，必须彻底清除，以防皮肤灼伤。</li>
	<li>涂抹脱毛膏 10–30 秒后，用温水浸湿纱布，彻底清除脱毛膏并去除松动的毛发。在最后一次冲洗后，使用干净干燥的纱布擦干前，应至少使用新的纱布对区域进行 2 至 4 次冲洗以确保脱毛膏完全清除。检查脱毛区域，确认乳头清晰可见且易于操作。如有必要，可重复使用脱毛膏处理。</li>
	<li>将小鼠置于加热垫上的独立、洁净且干燥的恢复笼中，使其从麻醉中恢复。观察小鼠直至其完全苏醒，然后将其送回饲养笼。</li>
	<li>小鼠苏醒后，为其提供一杯含卡洛芬（1 mg/杯）的三氯蔗糖凝胶溶液，以预先给予抗炎药物。一杯溶液最多可供五只小鼠使用，持续时间可达 2 天。每日检查溶液杯，根据需要更换，或若未完全消耗，则每隔一天更换一次。</li>
</ol>
3. 导管内注射
注意：此步骤将在术前准备后的2-3天内进行。
<ol>
	<li>根据文献16所述方法，使用磷酸盐缓冲液（PBS）将采购的五氧化二钽（TaOx）粉末配制成333.3 mM的储备液。若粉末未能完全溶解，可轻微加热助溶。</li>
	<li>通过将三份TaOx储备液与七份100%乙醇（EtOH）混合，制备消融成像溶液，最终得到含70% EtOH和100 mM TaOx的溶液。向最终溶液中加入1% v/v蓝色食用染料，以便在注射过程中辅助观察。根据实验需求准备相应体积。 
	注意：腺体对1和5最多可容纳30 µL溶液，而其他各对腺体在9周龄或更老的FVB小鼠中最多可注射50 μL。</li>
	<li>使用异氟烷对小鼠进行麻醉，待其完全麻醉后转移至鼻罩。在将动物仰卧固定前，涂抹眼用润滑剂。如有需要，可用胶带将小鼠固定于体视显微镜下。</li>
	<li>用所需体积的注射液准备注射器。将21–51 µL注射液装入带有34 G针头的50 µL注射器中。额外多装1 µL溶液，以补偿针头从乳头拔出后可能发生的液体泄漏。 
	注意：上述体积适用于本文所述的标准操作。可根据需要注射任意体积，但需注意，若腺体对1和5注射量超过30 μL，或腺体对2–4超过50 μL，则大多数腺体将被过度填充。建议在注射前向针头内多吸入部分注射液，以检测溶液是否能顺畅流出。若需注射多个乳腺，可预先装填多个注射器以节省时间，但不要将溶液长时间留在注射器中。</li>
	<li>使用精细尖头镊子清除覆盖乳头开口的死皮，为注射做准备。</li>
	<li>用镊子轻轻夹住乳头。在可见针头斜面的情况下，借助精细尖头镊子的引导，将针头插入乳头开口，直至斜面完全被乳头组织覆盖。必要时可将乳头拉向针头，而非将针头推入乳头（表1）。</li>
	<li>当针头斜面完全被乳头包围并进入主导管后，以约40 µL/min的稳定速率开始注射溶液。避免注射过快，以防损伤导管树。注射完成后，继续保持针头在乳头内30秒，再在镊子辅助下拔出针头，以防止溶液从乳头溢出（图2）。
	<ol>
		<li>检查注射区域是否存在注射失败的迹象。局部隆起可能提示脂肪垫内注射或局部组织损伤。</li>
		<li>继续注射其余乳腺。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在动物仍处于麻醉状态时，腹腔注射200–250 µL的5%蔗糖溶液（最高达10 mL/kg），以减轻酒精中毒的潜在影响。</li>
</ol>
4. 微型计算机断层扫描成像
<ol>
	<li>注射完所有目标腺体后，迅速将动物转移至微计算机断层扫描（micro-CT）系统，并继续使用系统集成的异氟烷蒸发器维持麻醉状态。可使用胶带固定动物以标准化成像位置。例如，将每只后肢以伸展状态固定，有助于在最终图像中使腿部骨骼远离感兴趣的下部腺体。 
	注意：若谨慎确定了动物可接受的终身辐射剂量上限，并确保累积剂量不超过该限值，则可采用不同的扫描参数对动物进行成像，以实现导管树的可视化。可通过生成透视静态图像或视频而非执行完整扫描，进一步减少辐射暴露（图2）。</li>
	<li>使用透视预览功能，将小鼠置于合适的视野范围内。</li>
	<li>对小鼠导管树进行TaOx成像，以获得良好的分辨率，并可重复进行标准（2分钟）采集扫描。使用以下扫描参数：90 kVp/88 µA；视野（FOV），36 mm；切片数量，512；切片厚度，72 µm；体素分辨率，72 µm3。
	<ol>
		<li>对于需要更高分辨率的动物，可采集更长时间（4或14分钟）的高分辨率扫描图像。此类扫描可作为安乐死前的终末性操作被接受。然而，若计划对同一动物进行纵向重复扫描，则不应采用此类参数，以免引发辐射病。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成成像程序后，将动物从麻醉状态中移出，并转移至加热垫上的独立清洁干燥恢复笼中。观察动物直至其完全苏醒，随后将其送回原饲养笼。对于注射了消融溶液的动物，应持续给予卡洛芬处理至注射后第7天。</li>
	<li>在micro-CT软件（内置系统）中快速生成所扫描图像的初步重建结果，以便直观评估是否存在对比剂泄漏或填充不全（图2），无需进行正式分析。</li>
	<li>如需对扫描图像进行出版或详细分析，可进一步执行正式的图像分析，以实现感兴趣区域的分割（图3）。 
	&#8203;注意：两种方法的主要区别在于，正式重建可仅对导管树进行阈值分割，而快速重建则需对整幅图像进行阈值处理。可利用软件包生成其他测量数据和图像，以最佳方式展示导管树填充的成功程度。</li>
</ol>
5. 图像分析
<ol>
	<li>使用专用软件包对注射后的导管树进行三维重建。为此，需通过进一步的图像处理将乳腺脂肪垫分割出来。
	<ol>
		<li>为了分割包含目标导管树的脂肪垫（与腹腔、股部肌肉和皮肤相比颜色较深的区域），从手动菜单中选择 Spline Trace 选项。每隔两个数据切片（即每第三个切片）描记一次脂肪垫的轮廓。</li>
		<li>从半自动菜单中点击 Propagate Objects 选项，将所有已描记和未描记的切片连接成一个完整的对象。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从半自动菜单中选择 Threshold Volume 选项，输入所需的HU范围（300–3,000 HU 是一个合适的起始范围），然后点击 Threshold Rendition 按钮，生成仅显示导管树内对比剂（TaOx）并去除软组织的三维图像。</li>
	<li>点击 View 按钮并切换至 Rendition as Primary 模式，以仅显示三维重建图像，隐藏周围结构。 
	注意：软件的其他功能支持对三维重建图像进行测量（例如长度、体积等）。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

预防性乳房切除术目前是预防乳腺癌最有效的干预手段，但其存在一些严重的负面影响。我们此前在侵袭性FVB-Tg-C3(1)-TAg乳腺癌小鼠模型的概念验证研究中已证明，使用基于乙醇（EtOH）的溶液对乳腺上皮细胞进行局部消融是一种颇具前景的替代疗法3。通过乳管内（ID）注射该消融溶液，可靶向乳腺癌起源的乳腺上皮细胞，同时将附带损伤降至最低。在消融溶液中添加X射线造影剂有助于更深入评估该溶液在预防方面的有效性，因为我们可以观察每次注射后是否成功填充了每棵导管树（图2B）。注射后立即通过透视成像观察注射腺体，这一操作方式模拟了未来临床实践中用于确认导管树成功填充的流程。实时可视化溶液递送情况，将最有助于判断导管树的各个部分是否均已覆盖。这将有助于在当前操作中或后续会话中决定是否需要追加注射以完成填充。确保消融溶液到达导管树的所有区域至关重要，以保证所有上皮细胞均能被有效清除（图3）。若导管树内残留存活的上皮细胞，则仍存在发生乳腺癌的可能。在乳管内注射中使用造影剂以评估注射效果，这一方法也可适用于其他制剂。表1提供了常见问题的解决方案及实用建议。其他研究已报道了在小鼠中通过乳管内递送病毒颗粒（如AdCre、CRISPR向导RNA）、激素、细胞毒性化合物、siRNA和/或靶向剂的方法3,16,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38，以及在大鼠24,32,39,40,41和兔42,43,44,45,46,47中的递送方案。独立的临床研究报道，每侧乳房最多可成功插管八条导管，用于局部递送化疗药物40,48,49。出于类似原因，在递送其他旨在预防或治疗的溶液时，可视化其完全填充情况也具有重要价值。确认溶液已到达导管树的所有分支及终末部位，将为评估预防或治疗是否成功提供关键信息。
目前我们尚不了解在小鼠33,34或其他动物模型47中存在其他能够达到TaOx纳米颗粒高分辨率水平的导管内成像方法。值得注意的是，TaOx在小鼠乳腺导管树中的表现优于美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于诊断性导管造影的对比剂3,16。随着我们进一步评估导管内消融术预防乳腺癌的能力，通过导管内递送后的成像所提供的附加数据，我们将能更精确地确定肿瘤起源于哪些腺体。例如，可以判断仅部分填充的腺体是否比未注射的腺体更易发生肿瘤形成，从而评估注射不完全对高风险女性所带来安全性和相关担忧的影响。该技术存在一定局限性。这是一种相对复杂的小鼠操作技术，要求操作者具备熟练的操作技巧和丰富的经验，以完成导管的操控和成功插管。每一次注射均为独立事件，因此在一个或多个腺体上注射失败可能会影响结果的解读。由于小鼠乳腺腺体体积较小且乳头较为脆弱，无法采用荧光透视或其他类似的影像引导技术进行实时监测以确定输注停止时机。这种实时影像引导将是临床实施消融溶液局部递送所必需的条件。

乳腺癌是一种常见且可能致命的疾病，目前可用于预防的手段很少1。最有效的干预措施是预防性乳房切除术；然而，由于该手术会带来重大的生活改变，只有高风险人群会选择接受这一手术2。该手术会完全切除乳腺癌发生的起源——乳腺上皮细胞及其周围组织。这可能给个体带来身体、心理和社会方面的压力，因此常常使人们不愿将这种外科手术作为首要的一级干预措施。
我们已证明，将含有70%乙醇（EtOH）的消融溶液直接递送至导管树中，可有效杀灭乳腺上皮细胞，同时对周围组织的损伤有限，并可在小鼠模型中预防乳腺肿瘤的发生3。乙醇在临床上长期被用作局部治疗的消融剂或硬化剂。经皮乙醇注射被用于无法手术切除的肝肿瘤、肾和肾上腺肿瘤以及胰腺囊性肿瘤的消融治疗4,5,6；用于腹腔神经丛化学性毁损以缓解疼痛7；以及用于治疗乳腺假性动脉瘤8。血管内乙醇注射则作为硬化剂，用于消除动静脉畸形（AVM）引起的肿胀和变形，并用于蜘蛛状静脉和静脉曲张的美容治疗9,10,11,12,13。与预防性乳房切除术类似，通过局部递送消融溶液实现预防效果的关键在于能否彻底清除所有可能发展为癌症的乳腺上皮细胞。这需要确认消融物质已成功充满整个导管系统，从而直接接触所有乳腺上皮细胞。目前临床上已有成熟的方法可用于向乳腺组织内注射物质，并通过影像引导下的荧光透视或乳腺导管造影进行可视化观察14,15；因此，在未来有必要开展临床试验评估该方法时，将有可能同时实现药物递送并确认其递送是否成功。
在实验动物中验证这种影像引导方法的可行性，是确立导管内（ID）消融作为乳腺癌预防措施的有效性及临床转化可行性的关键步骤。在本实验室中，我们已建立一种方法，可在每周一次的注射过程中，成功地将含有对比剂的消融溶液注入小鼠全部乳腺导管，以确保动物不会因乙醇（EtOH）过量而死亡（图1，图2，参考文献编号3,16）。该操作将一根34 G针头插入经异氟烷麻醉的小鼠乳头开口处，以注入测试溶液。该方法的一些关键改进包括使用防漏注射器输送液体和气体、增加每棵导管树的注射体积17，以及延长抗炎治疗时间。在ID操作前2天至操作后7天期间，给予5 mg/kg的非甾体抗炎药卡洛芬（carprofen）进行临床前治疗，这一方案与临床用于动静脉畸形（AVM）的硬化治疗方案一致。通常，在全身麻醉后，患者会接受非甾体抗炎药等抗炎药物治疗，持续2天，必要时可延长以减轻局部炎症或疼痛12。在小鼠中，通过腹腔注射5%蔗糖溶液可显著减轻酒精中毒症状。给予该蔗糖溶液后，小鼠可安全接受高达160 μL的70% EtOH注射（最多四棵导管树；血液中乙醇含量约为0.4 g/dL）；动物在ID注射后4小时内完全恢复。当需对小鼠超过四个腺体进行注射和/或使用更高浓度的EtOH时，我们采用分次连续操作，以确保足够的恢复时间。由于女性体内酒精剂量与体重的比例较低，因此酒精中毒的风险较小。根据人类乳腺中导管树的数量14,15（约16棵）以及每棵导管树所需填充体积的估算值18,19，将给予最多32 mL的70% EtOH。这一剂量远低于其他临床操作中使用的50 mL 95% EtOH4,9。静脉注射硫胺素和葡萄糖溶液可进一步减轻EtOH中毒的影响，尤其适用于需要注射较大总体积EtOH和/或对酒精耐受性较低的女性（例如，酒精脱氢酶或醛脱氢酶存在等位基因变异者）。
成像 通过 micro-CT/荧光成像可使我们确认每条导管的成功填充图1, 图2, 图3）。这可以记录下来用于后续分析，或在实验过程中实时评估。 通过 实时荧光成像（如同临床应用中所采用的方法），以限制对动物整体的辐射暴露。为进一步优化该消融方案在实时影像引导递送中的特定性能 体内，我们先前将含碘的FDA批准造影剂与氧化钽（TaOx由Shapiro实验室合成的含)的纳米颗粒3,16TaOx 作为微计算机断层扫描（micro-CT）造影剂，在可视化导管树初始充填过程方面表现出更优的性能（图2, 图3TaOx 可用于&#160;作为参考对照，以更系统和纵向地评估其他基于纳米颗粒的血池对比剂（如含碘、铋或金的对比剂）以及TaO的相容性x 以不同浓度的乙基纤维素作为凝胶剂20,21.

<table><tbody><tr><td>AnalyzeDirect v12.0</td><td>Caliper</td><td>n/a</td><td>用于微计算机断层扫描（micro-CT）图像处理</td></tr><tr><td>Carprieve, Carprofen 50 mg/mL</td><td>Allivet</td><td>50647</td><td>用于抗炎治疗</td></tr><tr><td>伊文思蓝（Evans blue）</td><td>Sigma</td><td>E2129-50G</td><td>用于注射可视化</td></tr><tr><td>热水浴锅</td><td>Toolots</td><td>Yidu_HH-S2</td><td>用于制备卡洛芬（carprofen）药杯</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>n/a</td><td>用于共聚焦图像处理</td></tr><tr><td>MediGel Sucralose Cups</td><td>ClearH2O</td><td>74-02-5022</td><td>用于递送卡洛芬（carprofen）</td></tr><tr><td>Model 1705 RN 注射器，50&amp;mu;L</td><td>Hamilton</td><td>7655-01</td><td>用于导管内注射</td></tr><tr><td>Photoshop 2021</td><td>Adobe</td><td>n/a</td><td>用于图像处理</td></tr><tr><td>Quantum GX2 microCT 成像系统</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS149276</td><td>用于微计算机断层扫描（micro-CT）图像采集</td></tr><tr><td>小 Hub RN 针头，34 规，定制（12&amp;deg; 斜面角度，0.375 英寸，4 型针尖）</td><td>Hamilton</td><td>207434</td><td>用于导管内注射</td></tr><tr><td>Stereo Microscope SZM 系列</td><td>AmScope</td><td>SM-4TPZ-144</td><td>用于导管内注射</td></tr><tr><td>无菌蓝色食用染料</td><td>McCormick</td><td>930641</td><td>用于注射可视化</td></tr><tr><td>无菌磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>ThermoFisher</td><td>14190250</td><td>用于溶液配制</td></tr><tr><td>标签贴纸</td><td>DOT Scientific</td><td>DOTSCI-C50</td><td>用于制备卡洛芬（carprofen）药杯</td></tr><tr><td>蔗糖（Sucrose）</td><td>Calbiochem</td><td>8550-5KG</td><td>用于导管内注射</td></tr><tr><td>注射器</td><td>Fisher</td><td>14-826-79</td><td>用于制备卡洛芬（carprofen）药杯</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>VWR</td><td>10153-834</td><td>用于制备卡洛芬（carprofen）药杯</td></tr><tr><td>加热泵/加热垫</td><td>Braintree Scientific</td><td>HTP-1500 120V; AP-R 26E</td><td>用于导管内注射/术前准备</td></tr></tbody></table>

小鼠模型中基于乙醇的消融溶液的导管内递送及x射线可视化用于乳腺癌的预防与局部治疗

Intraductal Delivery and X-ray Visualization of Ethanol-Based Ablative Solution for Prevention and Local Treatment of Breast Cancer in Mouse Models

乳腺癌是美国女性中最常见的癌症，也是女性癌症相关死亡的第二大原因。对于高风险女性，预防性乳房切除术是最有效的初级预防策略。预防性乳房切除术是一种侵入性较大的外科手术，旨在完全切除乳腺上皮细胞及其周围组织，而乳腺癌正是起源于这些上皮细胞。我们致力于开发一种微创的导管内介入方法，作为预防性乳房切除术的替代方案，以在乳腺上皮细胞恶变前对其进行局部消融。我们及其他研究团队已建立了可在乳腺癌啮齿类动物模型中实现导管内递送并靶向治疗这些上皮细胞的技术。尽管小鼠乳腺仅有一条未发生吻合、直接开口于乳头的导管树，其结构远比人类乳房简单且少弯曲，但化学诱导及基因工程构建的小鼠乳腺癌模型仍为新型预防策略的概念验证研究提供了重要价值。本文描述了一种在小鼠乳腺导管树内进行导管内递送含基于微CT/X射线钽对比剂的乙醇消融液的操作流程，旨在实现乳腺癌初级预防的治疗目标。既往已有研究报道在小鼠模型中递送水溶性试剂（如细胞毒性化合物、siRNA、AdCre）的导管内给药方法。因此，本实验方案重点阐述针对乙醇递送的优化方法学改进及独特的实验考量，以最大限度提高递送效率，并减少乙醇给药引起的局部和全身不良反应，以及 体内 导管树充填的可视化 通过 微计算机断层扫描/荧光透视成像。在注入含对比剂溶液后立即对导管树进行可视化，可确认导管是否完全充填，或识别充填不足、过度充填等失败情况。该方法可用于递送并成像其他消融性化合物，旨在预防肿瘤形成或局部治疗可及的早期肿瘤。 通过 导管树

雌性小鼠有五对乳腺，每对乳腺具有一条单一的导管树，导管开口于乳头孔22在发育中的导管树末端是末端芽（terminal end buds, TEBs），这些增殖性结构可引导乳腺的生长和分支。青春期后，当伸长阶段完成时，TEBs 退化，并在功能和解剖结构上与终末导管或腺泡芽无法区分。23终末导管小叶单位在人体中的功能类似于小鼠的末端芽（TEB），是乳腺癌主要发生部位24,25。我们最多可以注射 50 μL 70% 乙醇溶液，用于灌注9周龄FVB/N、NSG及其他小鼠品系的胸腹部乳腺导管系统图1, 图2, 图3，参见参考文献3,16）。在典型实验中，我们可向最多八个乳腺腺体注射含有70% EtOH和100 mM TaO的消融溶液x 在两次相隔7天的连续ID操作中进行，以允许动物恢复（图2）。在最后一次管内注射后立即通过微型CT对动物进行成像，以评估溶液是否成功递送至整个导管树图2）。根据我们的经验，约60%的动物腹股沟腺乳头适合注射，约40%的动物颈腺乳头适合注射。当条件合适时，我们最多可注射 30 μL 70% 乙醇溶液以灌注整个宫颈和腹股沟乳腺导管树图2）。FVB 和 NSG 品系通常比 C57BL/6J 或遗传背景混合的品系更具有适合注射的乳头。整体染色双重染色法或三维共聚焦显微镜是验证导管树填充程度的良好正交方法（图 3）。这些与组织相关的分析可与后续操作兼容，并可在之后进行 体内 成像。这些正交方法的明显局限性在于需要处死动物以获取和分析组织；然而，在新型消融制剂的优化阶段，它们可提供独立的验证。
<img alt="抗炎治疗过程、示意图、导管内注射、显微CT成像、图像分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63457/63457fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：导管内操作及图像分析的工作流程。 图中突出显示了ID操作的关键步骤。更多细节请参见视频。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63457/63457fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="导管内注射及CT扫描结果；包括透视成像和脂肪垫注射尝试。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63457/63457fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：成功插管并将消融溶液递送至多个乳腺组织。（A）FVB和NSG小鼠品系中乳头的代表性变异情况。长乳头比短乳头更容易插管，而过短或退化的乳头则无法进行插管。一旦完成插管，乳头大小不会影响导管内递送的成功率。（B）对含有蓝色染料的消融溶液进行大体解剖学分析，可提供导管树填充及递送成功的离体（ex vivo）证据。（C,D）实时透视成像及图像采集后的三维显微CT重建提供了递送成功的在体（in vivo）证据。（D）成功向腹部和腹股沟腺体注射，并向四个胸腺中的三个成功注射（腺体#2为脂肪垫注射）。比例尺对应不同放大倍数图像中的1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63457/63457fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="乳腺的三维成像与染色；显微CT、双染、共聚焦显示导管末端膨大体（TEB）和E-钙黏蛋白。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63457/63457fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：体内与离体条件下导管树填充的展示。将70%乙醇/100 mM TaOx纳米颗粒/伊文思蓝溶液通过导管内注射至小鼠腹部乳腺，并立即进行显微CT成像，随后进行整体双染处理。使用图像分析软件对导管树进行三维重建。该溶液完全填充了经胭脂红铝染色的导管树。另一乳腺组织经E-钙黏蛋白（Cdh1）免疫染色，采用苯甲醇:苯甲酸苄酯透明化处理后，按文献26所述方法进行共聚焦显微成像。导管树结构通过图像分析软件重建。共聚焦图像的伪彩渲染（即背景由黑变白，绿色标记信号转为洋红色）通过图像编辑软件的反相功能实现。比例尺在不同放大倍数图像中均对应1 mm。本图改编自参考文献3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63457/63457fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>问题</td>
			<td colspan="2">表现</td>
			<td colspan="3">解决方案</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乳头过短（图 2）</td>
			<td colspan="2">乳头低平，难以抓取</td>
			<td colspan="3">有时可尝试固定乳头周围的皮肤，并用针头对准乳头中心进针。针头可能扎入皮下。缓慢上提时，可发现乳头略微位于针尖上方，从而有空间抓取并将其完全拉至针上。当针头进入皮下时，需特别注意进针角度。若角度不当，容易无意中将药物注入脂肪垫。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>脂肪型乳头</td>
			<td colspan="2">明显大于其他乳头，且可剥离的死皮较少——无需借助放大镜即可清晰识别</td>
			<td colspan="3">此类乳头极易发生脂肪垫注射。进针时需格外注意针头角度。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>脂肪垫注射（图 2）</td>
			<td colspan="2">乳头周围甚至乳头本身出现肿胀——若在注射液中加入染色剂则更易观察</td>
			<td colspan="3">若在注入最初几微升液体时乳头即出现肿胀，应立即拔出针头，重新谨慎调整进针角度后再尝试。重新开始注射并密切观察是否继续肿胀。若肿胀持续，应放弃本次注射。一旦发生脂肪垫注射，后续成功完成乳头注射的可能性极低。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>伤口/结痂</td>
			<td colspan="2">乙醇溶液注射部位出现开放性伤口或结痂</td>
			<td colspan="3">对开放性伤口涂抹三重抗生素软膏，但结痂伤口应保持原状。在结痂处涂抹药膏可能增加动物抓挠并去除结痂的风险。应根据伤口严重程度每1–2天检查一次，直至愈合。即使超出常规给药时间窗，也应继续给予卡洛芬直至伤口完全愈合。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：故障排除与实用建议。

本文描述了一种向小鼠乳腺导管树内注射基于乙醇的消融溶液的方法，用于活体成像及乳腺癌预防。in vivo 成像和乳腺癌预防。直接通过乳头开口注射，可靶向乳腺上皮细胞，同时最大程度减少对周围组织的损伤。

小鼠模型中基于乙醇的消融溶液的导管内递送及X射线可视化用于乳腺癌的预防与局部治疗

乳腺癌是美国女性中最常见的癌症，也是女性因癌症死亡的第二大原因。对于高风险女性，预防性……

乳腺癌是美国女性中最常见的癌症，也是女性因癌症死亡的第二大原因。目前的预防方法有限，且伴随多种不良副作用。因此，亟需新的初级预防干预措施。我们开发了一种将基于乙醇的消融溶液经导管递送至小鼠乳腺上皮的方法，用于乳腺癌的预防。直接向乳头开口注射可靶向导管树内衬的上皮细胞，同时最大限度减少对周围组织的损伤。该方法可利用氧化钽纳米颗粒作为高分辨率对比剂，实现同步活体成像。该技术可调整用于其他X射线对比剂，以及不同化学或热消融溶液的多种预防性治疗。该图像引导的乳腺癌预防方法的第一步是通过使用实验室制备的含蔗糖素凝胶杯口服给予卡洛芬，从而实施长期抗炎治疗。我们使用脱毛膏去除乳头周围区域的毛发，以准备动物。然后在体视显微镜的辅助下进行乳腺导管内注射，以便最佳地定位并观察乳头开口，便于针头插入。注射溶液后，通过微型CT或荧光透视成像来评估注射效果。微型CT扫描数据可进行处理，以生成注射后乳腺导管树的三维重建图像，用于进一步分析导管填充情况及其他相关指标。首先，配制所需浓度的卡洛芬溶液。我们配制浓度为每毫升含2 mg的溶液，每杯注射0.5 mL，以达到每杯1 mg的终剂量。可在混合物中加入无菌食用染料，以便更好地确认药物已充分混入杯中的蔗糖素。接下来，将杯子置于60摄氏度的水浴中15分钟。取出杯子并擦干，以尽量减少污染的可能性。使用70%乙醇或乙醇擦拭巾清洁杯盖表面，并静置晾干。使用注射器通过杯盖注入所需剂量的卡洛芬溶液。在此情况下，为达到理想效果，需要注入 500 µL。用贴纸盖住针孔，将杯子摇晃 15 秒，然后再涡旋振荡 15 秒。通过观察是否存在深蓝色团块来检查杯子中溶液是否混合均匀。杯子可冷藏保存长达一个月。应在导管内操作前两到三天开始准备动物。首先使用异氟烷对动物进行麻醉。将麻醉后的小鼠转移至持续输送异氟烷的鼻罩。在鼻罩处为小鼠涂抹眼用润滑剂，然后将小鼠仰卧位固定。使用棉签将脱毛膏涂抹于计划注射的乳腺区域。在动物所需区域的皮肤上上下擦拭涂抹器，以帮助毛发更快松脱。为避免灼伤皮肤，应尽可能缩短脱毛膏在小鼠身上的停留时间。涂抹10至30秒后，使用浸有温水的纱布彻底清除脱毛膏。使用两到四次清洗，确保完全清除后，再用干净的纱布擦干皮肤。检查脱毛区域，确认乳头视野清晰且易于接触。如有必要，重复脱毛操作。将小鼠放入装有加热垫的清洁恢复笼中，使其从麻醉状态中恢复。小鼠恢复后，在其饲养笼中给予一片卡洛芬。接下来，再次使用异氟烷麻醉动物，待其完全麻醉后，将小鼠转移至鼻罩。在将动物仰卧放置以进行注射前，需涂抹眼用润滑剂。可将靠近将要注射的乳腺部位的腿部用胶带固定，以方便操作，但此步骤并非必需。准备注射器时，应抽取所需注射液体的体积外加一微升，以防拔出针头时液体溢出造成剂量不足。在注射前，可注入额外体积的溶液以检测针头是否通畅，确保溶液能够顺利流出。如果需要注射多个乳腺，可预先准备多个注射器以节省时间（如有条件）。若溶液静置后容易发生堵塞，则应注意不要过早完成预填充。如有必要，可使用尖头镊子清除乳头表面可见的死皮。如果死皮未堵塞乳头开口且不易牵拉脱落，则无需完全清除。若死皮与活体皮肤紧密粘连，强行去除有时可能导致乳头损伤和肿胀。在可见针头斜面的情况下，借助尖头镊子的引导，将针头插入乳头开口处。根据乳头的长度和坚挺程度，在引导针头进入时可能无法始终夹持乳头。有时需要通过针头调整乳头的位置，使镊子能够将乳头向上拉过针头，而不是将针头向下引入乳头内。当针尖斜面完全被乳头包围并进入主乳管后，开始缓慢注入溶液。理想速率为每分钟约 40 µL。避免注射速度过快，以防对导管树造成可能的损伤。注射完成后，使用镊子辅助，等待30秒后再将针头从乳头中取出，以尽量减少乳头处的液体渗漏。检查注射区域，观察是否存在注射失败的任何迹象。隆起的外观可能提示脂肪垫注射或该区域受到创伤。如果注射液含有染料，或您正在仔细观察注射部位是否出现隆起（如此处所示），通常可以观察到正在向脂肪垫内注射。以类似方式继续注射实验所需的其余乳腺，记录注射体积及任何渗漏情况。由于手部摆放不便或呼吸干扰等问题，小鼠的某些区域可能较难进行注射。例如，惯用右手的操作者在注射小鼠右上方的腺体时可能会遇到最大困难，如图所示。这些腺体因靠近肺部而活动较多，且动物身体会阻碍手腕在台面上稳定支撑，导致难以找到合适的手部操作位置。如果鼻锥允许，有些人可能会发现重新调整小鼠位置更为方便。注射含乙醇溶液时，必须注意避免全身性酒精中毒。这需要了解单次实验中可注射的乙醇最大量，并在操作过程中通过腹腔注射含蔗糖溶液以抵消其影响。导管内操作后，可将动物置于清洁笼具中的加热垫上恢复，或直接转移至微型CT系统进行导管树填充成像。任何成像操作后均应使小鼠恢复。将注射后的动物转移至微型CT系统后，需继续给予异氟烷以维持成像期间的麻醉状态。通过将待成像部位附近的腿部用胶带固定，有助于标准化成像位置。例如，将后肢以伸展姿势固定，可避免腿部骨骼遮挡注射腺体的视野；同样，将前肢向上伸展并固定，也有助于观察上部腺体。我们还发现，在小鼠腹部进行跨腹贴扎有助于减少下部腺体的呼吸伪影。可视化导管树存在多种可接受的扫描参数。应始终注意确保这些扫描所产生的辐射剂量不超过特定品系小鼠的辐射限值。通过观察透视成像并记录递送是否成功，而非采用更长曝光时间获取图像，可显著降低辐射剂量。如果仅需获取较短的两分钟标准扫描图像，我们标准的扫描参数适用于重复成像。在实施安乐死前作为终末性操作，可接受最高分辨率、最长达14分钟的扫描。这些较长的扫描时间在纵向研究中不可接受，因为可能导致动物出现辐射病。该动物的第四和第九对腺体被注射了含有100毫摩尔氧化钽造影剂的乙醇溶液。当前的采集是对已注射的下部腺体进行的14分钟高分辨率扫描。动物的透视成像使我们能够观察到造影剂在注射液中突出显示的导管树结构。我们使用的微型CT系统内置软件，可快速生成图像以评估注射效果，而无需进行正式分析。该功能配有简单的对比度滑块，可实现合理的信噪比降低。这些图像的局限性在于对整幅图像应用了相同的信号阈值，这会导致明显不属于导管树的强信号（如饮食中的铁）保留在图像中。通过使用更复杂的分析软件对感兴趣区域进行分割，可以获得更理想的图像。 为了获得最佳的单一导管树成像效果，我们建议将乳腺脂肪垫分割出来以进行进一步的图像处理。该过程需要在整个动物切片的完整厚度范围内逐层勾画脂肪垫的边界。我们发现，每隔三个切片进行一次轮廓勾画，并将对象进行传播，即可充分完整地捕捉到导管的全部结构。这一过程可能具有主观性，需要遵循实验室的描迹标准，以确保所有分析扫描图像的人员获得相似的结果。熟悉解剖结构有助于判断应包含哪些区域。在完成描迹传递后，可对重建图像进行阈值设定，限定在特定范围内，仅显示乳腺组织内的对比信息。这应该是导管树内的溶液以及其紧邻区域的任何泄漏情况。对于含五氧化二钽的溶液，通常300至3,000 HU的范围效果较好。此处可从多个角度查看一个完全处理后的示例。根据动物在微型CT中的摆放方向，可能需要在分析软件中重新调整DICOM文件的方向，以使解剖结构呈现直观的定位，即动物头部位于图像上方。如果每次未以相似方式旋转图像，则可能难以判断所观察的是哪一侧腺体。在完成导管树的重建后，可进一步进行体积或长度等测量。通过本方法成功递送的验证不仅可以通过此处所述的三维显微CT重建图像来证明，还可以通过双重染色的整体组织标本进行验证，其中注射的伊文思蓝与胭脂红明矾染色的完整导管树相互重叠。三维共聚焦显微镜可清晰显示经E-钙黏蛋白染色的透明化腺体中导管树的结构。不同品系之间以及小鼠个体之间的差异，以及乳头解剖结构的差异，可能导致腺体注射难度有所不同。这是一个理想的乳头示例，其高度较高，便于抓握和注射。相比之下，较低平的乳头（如此处所示）可能更难以成功插管。这些差异可能导致注射成功且无创伤或隆起（如图所示），也可能导致注射失败，表现为脂肪垫注射部位出现隆起的外观。在乳腺癌预防方面，目前主要采用两种策略。第一种是密切观察，不进行实质性的干预措施。采取这一策略的个体将定期接受监测，以检查乳腺组织中是否出现可能提示癌症形成的肿块。疾病检测将促使治疗的实施。预防性乳房切除术是一种更为侵入性的手术，可清除乳腺癌可能发生的全部上皮细胞以及周围的间质组织。该手术可能带来严重的不良副作用，因此极少被选择作为低或中等疾病风险个体的预防性措施。我们的方法是通过将消融溶液直接注射到乳腺导管树中，实现局部上皮消融。该方法可减少附带损伤，对于疾病风险不严重的个体而言，可能更具吸引力。注射后立即进行成像时加入对比剂，也使得该技术易于向临床转化。

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了解导管内注射乙醇消融溶液预防乳腺癌的方法，利用小鼠模型实现靶向递送和X射线成像。该技术可精确定位乳腺上皮细胞并减少组织损伤，为乳腺癌预防研究提供新平台。

小鼠模型中基于乙醇的消融溶液的导管内递送及X射线可视化用于乳腺癌的预防与局部治疗

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