使用定量流式细胞术分析荧光标记蛋白与人工磷脂微囊泡的相互作用

利用这种定量流式细胞术方法，研究人员可以计算外源膜相互作用的动力学和平衡特性，并估算在PPH膜位点上导入的蛋白质数量。该方法的优点在于试剂和设备简单且易于获取。此方法仅适用于基础研究。

该方案旨在研究血液凝固过程中的蛋白质-脂质相互作用，也可应用于其他领域，以表征蛋白质与各种脂质膜之间的相互作用。该方法可用于定量评估不同类型细胞及配体的配体结合动力学。开始动力学结合实验时，将磷脂囊泡用Tyrode缓冲液稀释至浓度为1 µM，总体积为250 µL。

然后将荧光标记的凝血因子X（FX FD）与磷脂囊泡按1:1比例混合，使FX FD终浓度为500纳摩尔，总体积为500微升。立即取500微升混合悬液注入流式细胞仪。设置流速，在激发波长488纳米、发射滤光片585纳米、通道FL2带宽42的条件下进行检测。

接下来，在激发波长为633纳米、发射滤光片波长为660纳米（带宽20纳米）的FL4通道中测定平均荧光强度。当结合达到饱和时，迅速用Tyrode缓冲液将样品稀释20倍，并持续监测解离过程，直至荧光恢复至基线水平或达到平台期。在平衡结合实验中，将5微摩尔的人工磷脂囊泡与浓度范围为0至1000纳米的FX FD在Tyrode缓冲液中孵育20分钟。

孵育后，用Tyrode缓冲液将每个样品稀释20倍，终体积为200 µL，然后在30秒内通过流式细胞术分析稀释后的样品。数据分析时，从流式细胞仪数据采集软件中选择文件，点击“导出”和“FSC文件”选项卡，将实验数据以FSC格式导出至流式细胞仪分析软件中进行分析。

完成后，通过在计算机上选择FCS文件并将其拖动到细胞仪软件的工作区中来打开文件。为了圈选微囊泡，通过脂溶性染料DIC 16（3）的荧光信号确定微囊泡所在的区域。然后在工作表中使用“plot”按钮，以SSC为横坐标、FL2（DIC 16）为纵坐标，在对数坐标下生成点图。

然后选择矩形门控按钮绘制门控区域。为了分析动力学实验，使用囊泡区域随时间变化的荧光坐标创建点图。接下来，将荧光随时间变化的数据以 CSV 格式导出；操作步骤为：选择样本，右键点击“导出”选项卡，随后在参数中选择 FL4 时间，选择保存目录后，选择 CSV 格式并点击“导出”选项卡。

转移后，在统计软件中打开 CSV 文件，计算每约 1000 个事件的简单移动平均荧光强度和时间，基于指数依赖关系假设，拟合单次移动平均荧光强度随时间变化的曲线，并利用该曲线的值通过方程计算动力学结合常数。然后，按照前述方法使用相应方程计算动力学解离常数。为分析平衡结合实验的数据，需确定在每种选定 FX FD 浓度下囊泡区域中 FX FD 的平均荧光强度，随后在单一位点结合假设下，拟合结合因子荧光强度随添加因子浓度变化的依赖关系。

使用至少三次独立重复实验的数据，通过方程计算平均结合参数。接下来，通过将凝胶过滤后的血小板与钙离子螯合剂 IANA 4A 23,187 在含有 2.5 毫摩尔氯化钙的条件下于室温孵育 10 分钟，制备校准微球。向激活的血小板中加入不同浓度的 FX FD，并用终体积百分比为 2% 的甲醛孵育血小板。

孵育一小时后，加入三倍摩尔浓度的甘氨酸和5% BSA，在室温下继续孵育30分钟以终止反应。随后通过在400 × g条件下离心5分钟，去除未反应的染料。弃去上清液，将沉淀物重悬于含有0.5% BSA的Tyrode缓冲液中。

接下来，使用分光荧光计和流式细胞仪分别测量各样品中校准微球的荧光水平。借助细胞计数器确定每个样品中的微球数量。利用分光荧光计将各微球样品的荧光强度转换为可溶性荧光染料的浓度，并根据分光荧光计分子的数量重新计算荧光染料的浓度。

针对每个样本，绘制流式细胞仪中微球平均荧光强度与荧光分子数量之间的依赖关系图。然后依次使用分析拟合中的拟合线性选项，通过线性比例关系对依赖性进行近似。根据所得方程中的近似结果，计算平均荧光强度到结合位点数的转换因子。

随后计算每个目标囊泡的表观结合位点数量。代表性分析显示了人工磷脂囊泡的设门结果，这些囊泡大小为一微米，内含疏水性荧光染料Dye I C 16；设门依据是含有相同尺寸但不含荧光染料的人工脂质囊泡的样本。在第一阶段，通过连续采集样品来分析蛋白质与囊泡的结合动力学。

采用流式细胞术分析所获得的数据。在混合溶液并用Tyrode缓冲液稀释后，应尽快开始流式细胞术检测。该方法可结合表面等离子共振技术，用于研究引入的膜相互作用，后者具有高灵敏度和良好的时间分辨率，且无需引入递送步骤。此方法的主要优势在于其易获得性和操作简便性。