使用定量流式细胞术分析荧光标记蛋白与人工磷脂微泡的相互作用
2022年4月6日
在这里，我们描述了一组表征蛋白质与细胞膜或微囊泡相互作用的方法。
使用这种数量流式细胞术方法，研究人员可以计算引入膜相互作用的动力学和平衡习惯，并估计PPH膜上位点引入的蛋白质数量。这种方法的优点是试剂和设备的简单性和可用性。这种方法专门用于基础研究。
该协议旨在研究血液计算中的蛋白质脂质相互作用，并可用于其他领域来表征蛋白质与各种脂质膜的相互作用。该方法可用于评估配体结合动力学对各种细胞和配体类型的影响。通过将Tyrode缓冲液中的磷脂囊泡稀释至一微摩尔的浓度和250微升的总体积来开始动力学结合实验。
然后将荧光标记的凝血因子X或FX FD和浓度为500纳摩尔的磷脂囊泡以一比一的比例混合，得到总体积为500微升。立即将500微升的混合悬浮液注入流式细胞仪中。在激发波长为488纳米的流速和585纳米的发射滤光片下，通道FL 2的宽度为42。
接下来测量通道FL 4中的平均荧光，激发波长为633纳米，发射滤光片为660纳米，宽度为20。当达到结合饱和度时，用Tyrode缓冲液快速稀释样品20倍，并监测解离，直到达到基线荧光或平台。对于平衡结合实验，在Tyrode的缓冲液中孵育五个微摩尔人造磷脂囊泡，其FX FD浓度从0到1000纳摩尔不等，持续20分钟。
孵育后，用Tyrode缓冲液将每个样品稀释20倍至200微升的最终体积，然后在30秒内通过流式细胞术分析稀释的样品。要分析数据，请将FSC格式的实验从细胞仪数据采集软件导出到细胞仪软件进行数据分析。通过选择文件，然后单击导出和 FSC 文件选项卡。
完成后，通过选择计算机上的文件并将文件拖到程序的工作空间中，将FCS文件打开到细胞仪软件中。对于微囊泡的门控，通过亲脂性染料的荧光识别微泡的区域，DIC 16三。然后使用工作表中的绘图按钮从对数坐标中的FL两个D I C 16创建点图SSC。
然后选择矩形门按钮以绘制浇口区域。为了分析动力学实验，使用囊泡区域随时间变化的荧光坐标创建点图。接下来，以CSV格式导出荧光随时间变化的数据;通过选择样品并右键单击导出选项卡，然后选择FL四次参数，选择要保存的目录，然后单击选择CSV格式并点击导出选项卡。
转移后，在统计软件中打开CSV文件，计算每1000个事件的简单移动平均荧光和时间近似于指数依赖性假设下单个移动平均荧光对时间的依赖性图，并使用该值使用方程计算动能关联常数。然后使用前面描述的方程计算动能解离常数。为了分析平衡结合测定的日期，确定FX FD在囊泡区域中对于每个选定浓度的FX FD的平均荧光，然后在假设单位点结合时从添加因子的浓度近似结合因子荧光的依赖性。
至少使用三个独立重复的方程式计算平均结合参数。通过在室温下在2.5毫摩尔氯化钙存在下，将凝胶过滤的IANA 4A血小板孵育23、1807，以制备校准的磁珠。活化的血小板是否加入各种浓度的FX FD，并用2体积百分比的甲醛孵育血小板。
一小时后，通过在室温下用三摩尔甘氨酸和5%BSA孵育血小板30分钟来停止反应。然后从未反应的染料中纯化混合物，以400倍G离心5分钟。在将颗粒重悬于含有0.5%BSA的Tyrode缓冲液中之前，除去上过氧化物。
接下来，使用分光荧光计测量每个样品中校准微球的荧光水平，然后使用流式细胞仪。在细胞计数器的帮助下确定每个样品中的磁珠数量。使用分光荧光计将每个相应磁珠样品的荧光强度转换为可溶性荧光染料的浓度，并重新计算分光荧光计分子数的荧光染料浓度。
创建流式细胞仪中微球平均荧光对每个样品的荧光团分子数量的依赖图。然后使用分析拟合和拟合线性选项卡按顺序按线比例近似依赖关系。根据等式中的近似值，计算平均荧光到结合位点的转换因子。
然后计算每个感兴趣囊泡的结合位点的表观数量。代表性分析显示，将装有亲脂性荧光染料I C 16的尺寸为一微米的人工磷脂质囊泡的门控，该门基于含有相同尺寸的人工脂质囊泡的样品设置，而没有荧光染料。通过连续收集样品，在第一阶段分析蛋白质与囊泡结合的动力学。
使用流式细胞术分析获得的数据。流式细胞术测量应在混合溶液并用Tyrode缓冲液稀释后尽快开始。该方法可辅以表面等离子体共振，用于研究膜相互作用，其高度敏感，具有良好的临时分辨率，不需要引入递送。
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概述
本文描述了表征蛋白质与细胞膜和微泡的相互作用的方法。重点是一种流式细胞术技术，该技术允许研究人员评估结合动力学。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 细胞生物学
- 蛋白质-脂质相互作用
背景
- 理解蛋白质与膜的相互作用对于各种生物过程至关重要。
- 流式细胞术提供了一种定量方法来研究这些相互作用。
- 该方法适用于多个领域的基础研究。
- 它是专门为研究血液中的蛋白质-脂质相互作用而开发的。
研究目的
- 表征蛋白质与脂质膜的相互作用。
- 估算与特定膜位点相互作用的蛋白质数量。
- 为研究人员提供一种简单易用的方法。
使用的方法
- 流式细胞术用于定量蛋白质-膜相互作用。
- 在Tyrode's缓冲液中稀释磷脂小泡。
- 评估配体结合动力学。
- 实验使用一微摩尔浓度。
主要结果
- 该方法允许计算动力学和平衡常数。
- 它简化了研究蛋白质相互作用的过程。
- 研究人员可以估算膜位点带入的蛋白质数量。
- 该方法适用于各种脂质膜。
结论
- 这种流式细胞术方法对于研究蛋白质-脂质相互作用是有效的。
- 它为基础研究应用提供了一个直接的协议。
- 该技术可以适用于不同类型的细胞和配体。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative flow cytometry of fluorescent-labeled proteins binding to artificial phospholipid microvesicles enables precise measurement of protein-membrane interactions, a critical step in early discovery and target validation. This approach provides kinetic and equilibrium binding data, supporting predictive confidence in membrane-associated targets and facilitating risk-adjusted portfolio decisions. Its accessibility and reproducibility make it a valuable capability for biopharma R&D teams focused on mechanistic de-risking and assay development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of protein-lipid binding kinetics and affinities.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying membrane interaction pathways.
- Provides functional target validation data for membrane-associated proteins.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and triage decisions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated artificial vesicle systems for downstream screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative binding measurements.
- Enables scalability and platform reuse for diverse ligand and membrane types.
- Supports reliable evaluation of compound effects on protein-membrane interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems where membrane interactions drive biological outcomes.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of membrane-targeted agents.
- Enables risk-adjusted advancement by quantifying binding site occupancy and kinetics.
- Supports translational biomarker development for membrane-associated processes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly for membrane-associated targets.
- Discovery Biology: Quantifies protein-membrane binding kinetics and site occupancy to clarify biological mechanisms.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible vesicle systems with quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Generates kinetic and equilibrium constants, enabling direct comparison of binding conditions and ligands.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by modeling disease-relevant membrane interactions.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, standardized workflow for membrane interaction studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in membrane-targeted discovery.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable quantitative assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust binding data early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of membrane-associated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and quantitative data analysis.
- Needs access to calibrated flow cytometers and fluorescent labeling reagents.
- Demands cross-team standardization for gating, calibration, and data interpretation.
- Adaptable to various artificial and natural membrane systems with appropriate controls.
- Limited to basic research applications; not validated for clinical or regulatory use.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:58
Kinetic Binding Experiments
2:13
Equilibrium Binding Experiments
2:45
Analysis of Flow Cytometry Data
5:13
Converting Fluorescence Intensity to the Mean Number of Binding Sites
7:05
Results: Specific Binding of Fluorescent-Labeled Coagulation Factor X or fX to Artificial Phospholipid Vesicles
7:42
Conclusion
