Name: 小鼠脑实质小动脉内皮的分离及功能分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 学习从小鼠脑实质小动脉分离完整内皮管的方法，用于研究脑血流调节机制。该技术结合荧光成像和电生理测量，可分析细胞内钙信号和膜电位变化，为理解脑血管生理与病理提供新见解。

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本研究获得了美国国立卫生研究院（R00AG047198）基金的资助 &amp;#38; R56AG062169 资助 EJB；R00HL140106 资助 PWP）以及阿尔茨海默病协会（AZRGD-21-805835 资助 PWP）。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院或阿尔茨海默病协会的官方观点。

实验人员应确保动物的指定使用及相关实验方案已获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并依照美国国家研究委员会（National Research Council）的规定执行 &#34;实验动物护理和使用的指南&#34; (8th 版本，2011）及ARRIVE指南。洛马林达大学和亚利桑那大学的动物照护与使用委员会（IACUC）已批准本手稿中用于C57BL/6N和 3xTg-AD 小鼠（雄性和雌性；年龄范围：2-30 个月）。参见 图1 作为从小鼠脑实质微动脉中 freshly 分离 arteriolar 内皮管并进行检测的概述。
1. 材料与仪器
注意：本实验方案所需的所有试剂和材料请参见材料表。此外，可根据需要查阅各供应商提供的说明书和网站信息。解剖操作台和实验装置的示意图此前已有报道13。
<ol>
	<li>灌流室
	<ol>
		<li>将带有玻璃盖玻片的灌流室固定在由阳极氧化铝制成的平台上，并将该平台连同灌流室一起固定在铝制显微镜载物台上。</li>
		<li>在铝制显微镜载物台平台的两端各安装一个持针显微操作器。 
		注意：如有需要，可使用可移动载物台装置连同灌流室单元，将已固定的分离内皮管从一台显微镜设备转移至另一台显微镜设备进行实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显微镜
	<ol>
		<li>使用体视显微镜（放大倍数范围为5倍至50倍）和光纤光源进行解剖操作。</li>
		<li>分离内皮管时，使用配备相差或微分干涉对比（DIC）物镜（10倍、20倍和40倍）以及铝制载物台的倒置显微镜系统。</li>
		<li>在用于从部分消化的血管中分离内皮管的设备旁，准备好微注射泵控制器。</li>
		<li>在防震台上搭建实验装置，配置倒置显微镜（物镜：4倍、10倍、20倍、40倍和60倍）和手动铝制载物台。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞内Vm记录设备
	<ol>
		<li>将电位计连接至匹配的前置放大器。对于需要电流注入的实验方案，使用函数发生器和刺激器等附件。</li>
		<li>将放大器输出端连接至数据采集系统、示波器和可听基线监测器。将参比浴电极（Ag/AgCl小球）固定在灌流室出口附近。</li>
		<li>组装包含荧光系统接口、高强度弧光灯及电源、高速切换器、光电倍增管（或PMT）和相机在内的光度测量系统，用于检测内皮细胞内的[Ca2+]i。</li>
		<li>组装配备管路加热器的温度控制器，以在整个实验过程中升高并维持生理温度（37 °C）。</li>
		<li>组装多通道平台，并连接带有管路流量控制阀的阀控制器，以调控向灌流室内固定的内皮管输送溶液的过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微移液管与尖锐电极 
	&#8203;注意：实验人员需要使用电子玻璃拉制仪和微电极抛光仪来制备 triturate 用移液管和固定用移液管。
	<ol>
		<li>为将内皮管从部分消化的小动脉段中分离出来，使用硼硅酸盐玻璃毛细管制备经热抛光的 triturate 移液管（尖端内径：30–50 µm）。</li>
		<li>为在灌流室中固定内皮管，使用薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管制备具有钝化球形末端的热抛光固定移液管（外径：50–70 µm）。</li>
		<li>为记录内皮细胞的Vm，仅使用玻璃拉制仪制备尖锐电极，其尖端电阻约为150 ± 30 MΩ。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 溶液与药物
<ol>
	<li>生理盐溶液（PSS）
	<ol>
		<li>使用 140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10 mM N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES）和 10 mM 葡萄糖配制至少 1 L 的 PSS。</li>
		<li>配制不含 CaCl2 的必要溶液（无 Ca2+ PSS），用于脑小动脉的解剖和内皮管的分离。 
		注意：所有溶液均需使用超纯去离子 H2O 配制，并经 0.22 µm 滤膜过滤。确保最终溶液 pH 为 7.4，渗透压在 290 至 300 mOsm 之间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>牛血清白蛋白（BSA，10%）
	<ol>
		<li>将 1 g 冻干 BSA 粉末溶于 10 mL 无 Ca2+ PSS 的烧杯中。盖上烧杯，缓慢搅拌至少 2 小时，使 BSA 完全溶解。</li>
		<li>使用 10 mL 注射器和 0.22 µm 滤膜过滤溶液，并分装成 1 mL 等份，于 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖溶液
	<ol>
		<li>将 500 µL BSA（10%）加入 49.5 mL 无 Ca2+ PSS 中，总体积为 50 mL。</li>
		<li>将溶液转移至培养皿中，用于小动脉解剖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离溶液
	<ol>
		<li>向 49.5 mL 无 Ca2+ PSS 中加入 5 µL CaCl2&#160;溶液（1 M）和 500 µL BSA（10%），总体积为 50 mL。室温孵育至少 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酶溶液
	<ol>
		<li>配制 1 mL 消化液，含 100 µg/mL 木瓜蛋白酶、170 µg/mL 二硫赤藓糖醇、250 µg/mL 胶原酶（H 型混合物）和 40 µg/mL 弹性蛋白酶。 
		注意：酶活性可能存在差异，但成功实验方案通常需要以下酶活性：木瓜蛋白酶 ≥ 10 单位/mg，胶原酶 ≥ 1 单位/mg，弹性蛋白酶 ≥ 5 单位/mg。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fura-2 和药理学试剂
	<ol>
		<li>将 Fura-2 AM 储存液配制成二甲基亚砜（DMSO；1 mM）。取 5 µL 储存液加入 495 µL PSS 中，配制 500 µL 工作浓度（10 µM）用于负载。</li>
		<li>根据需要，用 PSS 或 DMSO 配制至少 50 mL 的药理学试剂工作浓度溶液&#160;。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>导电溶液
	<ol>
		<li>通过将 KCl 溶于去离子 H2O 中配制 2 M KCl 溶液（50 mL H2O 中加入 7.455 g KCl）。在填充尖锐电极前，使用 0.22 µm 滤膜过滤该溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光细胞器示踪剂和抗体
	<ol>
		<li>根据制造商说明，用适当的生理盐溶液配制质膜或细胞器（如细胞核、内质网）示踪剂。</li>
		<li>根据制造商说明，在适当的生理盐溶液中配制一抗和二抗。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 小鼠脑部小动脉的解剖与分离
注意：所有这些解剖操作均需使用体视显微镜和锋利的显微解剖工具（例如尖头镊子、Vannas型解剖剪刀）对样本进行放大（最高可达50倍）。
<ol>
	<li>小鼠脑组织的分离
	<ol>
		<li>使用异氟烷吸入（3%，持续2-3分钟）麻醉标准实验小鼠（例如 C57BL/6、3xTg-AD；2-30月龄，雄性或雌性），随后依据IACUC批准的方法立即使用锋利剪刀或断头器进行断头。将小鼠头部置于含有冷（4 °C）解剖液的培养皿（直径10 cm，深度1.5 cm）中。</li>
		<li>在体视显微镜下操作，去除颅骨表面的皮肤和毛发，并用冷解剖液冲洗掉多余的血液。使用标准解剖剪（例如，24 mm刀片）的尖端，从枕骨开始沿颅骨向上至鼻骨处做一剪切。用粗头镊子沿切口小心打开颅骨，分离结缔组织（脑膜），以完整保留包含大脑动脉环（Circle of Willis）的脑组织。</li>
		<li>将分离出的脑组织置于烧杯或培养皿中的冷解剖液中清洗，以去除表面残留的血液。将脑组织腹面朝上放置于盛有冷解剖液的培养腔中，用于实质小动脉的分离（图2A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实质小动脉的分离 
	注意：本方案选择源自大脑中动脉（MCAs）并嵌入脑实质内的小动脉进行操作。小动脉的分离方法参照先前描述11，并进行了修改。
	<ol>
		<li>使用钢针（直径：0.2 mm，长度：11至12 mm）将分离的脑组织固定在含有冷解剖液的培养皿中，该培养皿底部涂有含炭粉的硅聚合物涂层（深度 ≥ 50 cm）。</li>
		<li>使用锋利且对齐的解剖剪，在大脑中动脉（MCA）周围切割一块脑组织矩形区域（长度：5 mm，宽度：3 mm）（图2B），确保组织片段的上部位于大脑动脉环（Circle of Willis）分支点之后。如有需要，可从脑的另一侧半球再切取另一块脑组织矩形区域，以获取更多小动脉。</li>
		<li>将分离的脑组织片段用钢针（直径：0.1 mm，长度：13至14 mm）固定于培养皿中，使大脑中动脉（MCA）朝上（远离大脑动脉环方向）。用小镊子在钢针附近做浅表切口，小心剥离软脑膜（pia），从一端轻轻向另一端剥离（图2C）。如需获取更多小动脉，可对另一组织片段进行相同操作以去除软脑膜。小心地用钢针将带有源自MCA分支的实质小动脉的软脑膜固定于培养皿中，并进行实质小动脉的解剖（图2D），确保小动脉不受损伤。 
		注意：若小动脉无法随软脑膜轻易从脑实质中拉出，可使用精细镊子从大脑动脉环分支点处开始向脑组织内部挖掘。找到小动脉后，小心松解其周围组织（图2E），并轻柔地夹住小动脉上端将其从脑实质中拉出（图2F）。从一块脑组织矩形区域中可分离出多条小动脉（长度：约1.5-2 mm）。</li>
		<li>确保小动脉清洁、无附着组织，并剪除任何残留的远端分支（图3A）。将此清洁且完整的小动脉用于后续酶消化处理。如需制备内皮管，也可将每条小动脉切成两段（长度：0.75-1 mm）分别进行酶消化处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 实质小动脉的消化及血管内皮管的制备
<ol>
	<li>设备与移液器的准备 
	注意：此前已有文献描述过从脑组织中分离动脉内皮管的方法13,18。本实验方案进行了改进，适用于分离脑实质（颅内）小动脉的内皮层。可将多个小动脉或小动脉片段合并用于酶消化。
	<ol>
		<li>组装用于制备内皮管的吹打装置13，该装置包括一个铝制平台，其上固定有灌流室和显微操作器。配备带有物镜（5x–60x）的显微镜，并连接相机至计算机显示器。在平台及样本旁固定带有泵控制器的微量注射器。</li>
		<li>将矿物油反向填充至吹打移液管中，并将其安装在微量注射器活塞上方。使用带泵控制器的微量注射器，将解离液经矿物油上方吸入吹打移液管中（约130 nL），注意避免移液管中产生气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小动脉段的部分消化
	<ol>
		<li>将完整的小动脉段放入含1 mL解离液的10 mL玻璃试管中，解离液包含100 µg/mL木瓜蛋白酶、170 µg/mL二硫赤藓醇、250 µg/mL胶原酶和40 µg/mL弹性蛋白酶。将小动脉段在34 °C下孵育10–12分钟。</li>
		<li>消化完成后，用3–4 mL室温的新鲜解离液替换酶溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小动脉内皮管的分离 
	注意：在完成消化并更换酶溶液后，将一个或多个部分消化的小动脉段转移至连接于移动平台的灌流室内的解离液中。在100x至200x放大倍数下观察，选择一个部分消化但未破裂的血管段，并在显微镜下聚焦该段。
	<ol>
		<li>将连接微量注射器的吹打移液管置入灌流室的解离液中，并靠近消化后血管段的一端。在泵控制器上设定1–3 nL/s范围内的流速，以实现轻柔吹打。</li>
		<li>在保持100x至200x放大倍数的同时，将小动脉段吸入移液管，然后推出，以解离外膜和血管平滑肌细胞（图3B）。持续吹打血管段，直至所有平滑肌细胞均被解离，仅剩完整的内皮细胞形成一根&#34;管状结构&#34;。 
		注意：若吹打过程中需要，可小心使用尖头镊子从内皮管上移除外膜及内弹性膜。通常仅需几次吹打循环即可获得完整的内皮管。</li>
		<li>使用显微操作器，借助硼硅酸盐玻璃固定移液管，将内皮管的两端固定在灌流室内的玻璃盖玻片上（图3C,D）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定小动脉内皮管
	<ol>
		<li>用灌流液（含2 mM CaCl2的PSS）替换解离液，同时确保将非内皮成分彻底冲洗出灌流室。</li>
		<li>将固定好的内皮管随移动平台转移至专用于持续灌流及细胞内记录或荧光成像的显微镜系统。</li>
		<li>实验过程中持续灌注PSS。通过在线流量控制阀手动设定流速（5–7 mL/min），保持层流状态，并使进液流速与真空吸引程度相匹配。在采集背景数据或进行染料加载前，至少让PSS持续灌流灌流室5分钟以上，以充分灌流内皮管。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 利用小动脉内皮管检测细胞生理学特性
注意：分离并固定的微动脉内皮管可用于细胞内钙离子浓度[Ca2+]i动态和膜电位Vm的记录，分别采用光度测定法和锐电极电生理技术，如先前研究所示13（图4）。根据实验需求，可单独或同时测量[Ca2+]i和Vm13（图4）。然而，微动脉内皮管比动脉内皮更为脆弱，实验时间不应超过1小时。
<ol>
	<li>[Ca²⁺]浓度测定2+]i
	<ol>
		<li>打开设备及 [Ca2+]i 在保持5-7 mL/min灌流速度的同时进行记录。</li>
		<li>将内皮管加载 Ca2+ 用Fura-2 AM染料在室温下孵育30分钟。用灌流溶液洗涤细胞20-30分钟，同时逐渐将浴槽温度升至37 °C。整个实验过程中维持温度为37 °C。</li>
		<li>使用光度测定软件手动调整成像窗口，以聚焦约20个内皮细胞（图4A）。在无光条件下，打开荧光界面的光电倍增管（PMT），并开始采集[Ca2+]i 通过在510 nm处采集荧光发射信号的同时，交替激发Fura-2（≥10 Hz）于340 nm和380 nm波长下，获得[Ca2+]i 建立后，根据实验目的施加药理学试剂（如嘌呤能受体激动剂）（图4B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>V的测量m&#8203;
	<ol>
		<li>开启 V 设备及软件m 记录信号并设置数据采集速率（≥10 Hz），同时以5–7 mL/min的流速持续灌流。逐步将浴槽温度升至37 °C，并在整个实验过程中维持该温度。</li>
		<li>使用硼硅酸盐玻璃毛细管拉制尖锐电极，用2 M KCl溶液反向灌注，并将其固定在连接于电位计的电极夹持器中，电极夹持器由显微操作器固定，其中银丝表面涂有氯化物。</li>
		<li>在4倍物镜下观察，使用显微操作仪将尖锐电极的尖端小心地移至灌流 chamber 内微动脉内皮管中某个细胞的正上方，进入流动的PSS中。</li>
		<li>逐渐增加放大倍数至400倍，并根据需要重新调整电极尖端的位置。</li>
		<li>使用显微操作器，将尖锐电极的尖端轻柔地插入内皮管的一个细胞中，开始记录Vm 使用静电计（图 4A).</li>
		<li>一旦内皮细胞静息电位m 稳定（−30 至 −40 mV）后，根据实验目的施加所需的药理学试剂（图4C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 细胞成像
注意：固定在移动平台腔室中的内皮管也可用于在活体和固定条件下通过标准荧光或共聚焦显微镜进行显微成像19。针对受体和离子通道的不同抗体的免疫组织化学染色也可按先前所述方法进行20。
<ol>
	<li>在 37 °C 条件下，将内皮管与细胞膜或目标细胞器（如细胞核、内质网）的荧光示踪剂孵育 15–30 分钟。</li>
	<li>用新鲜的灌流 PSS 洗涤细胞，并在显微镜下于相应染料的激发波长处对活细胞进行成像（图 4D，E）。 
	注意：可在此管状模型上使用感兴趣的抗体进行免疫组织化学染色。</li>
</ol>

<ol><li>Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+in+capillaries+are+contractile+in+vivo%2C+but+arterioles+mediate+functional+hyperemia+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).</li>
<li>Longden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+K%2B-sensing+initiates+retrograde+hyperpolarization+to+increase+local+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).</li>
<li>Kelleher, R. J., Soiza, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+endothelial+dysfunction+in+the+development+of+Alzheimer%27s+disease%3A+Is+Alzheimer%27s+a+vascular+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Cardiovascular+Disease%22%5BJournal%5D)">Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder.</a> American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).</li>
<li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Alzheimer%27s+disease+progressively+alters+sex-dependent+KCa+and+sex-independent+KIR+channel+function+in+cerebrovascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimers+Disease%22%5BJournal%5D)">Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium.</a> Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).</li>
<li>Pires, P. W., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+TRPA1+channels+in+the+cerebral+endothelium+following+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke.</a> elife. 7, 35316(2018).</li>
<li>Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP2+improves+cerebral+blood+flow+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Function%22%5BJournal%5D)">PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Function. 2 (2), (2021).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologically+reversible+zonation-dependent+endothelial+cell+transcriptomic+changes+with+neurodegenerative+disease+associations+in+the+aged+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain.</a> Nature Communications. 11 (1), 4413(2020).</li>
<li>Peters, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta+disrupts+unitary+calcium+entry+through+endothelial+NMDA+receptors+in+mouse+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).</li>
<li>De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cerebral+arteries+and+parenchymal+arterioles+with+aging%3A+Role+of+rho+kinase+2+and+impact+of+genetic+background%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background.</a> Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).</li>
<li>Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HB-EGF+depolarizes+hippocampal+arterioles+to+restore+myogenic+tone+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389(2020).</li>
<li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cannulation+of+cerebral+parenchymal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835(2016).</li>
<li>Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+pressurized+hippocampal+capillary-parenchymal+arteriole+preparation+for+functional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676(2019).</li>
<li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurements+of+intracellular+calcium+and+membrane+potential+in+freshly+isolated+and+intact+mouse+cerebral+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832(2019).</li>
<li>Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+alters+cerebrovascular+endothelial+GPCR+and+K%2B+channel+function%3A+Divergent+role+of+biological+sex%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology%2C+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex.</a> Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).</li>
<li>Behringer, E. J., Hakim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interaction+among+KCa+and+TRP+channels+for+cardiovascular+physiology%3A+Modern+perspectives+on+aging+and+chronic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380(2019).</li>
<li>Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelial+intermediate+conductance+KCa+channels+in+cerebral+EDHF-mediated+dilations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).</li>
<li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+SKCa+and+IKCa+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li>
<li>Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+dynamics+of+isolated+cerebral+and+skeletal+muscle+endothelial+tubes%3A+Differential+roles+of+G-protein-coupled+receptors+and+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research+and+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels.</a> Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391(2018).</li>
<li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl-beta-cyclodextrin+restores+KIR+channel+function+in+brain+endothelium+of+female+Alzheimer%27s+disease+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimers+Disease+Reports%22%5BJournal%5D)">Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice.</a> Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).</li>
<li>Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+impairs+electrical+conduction+along+endothelium+of+resistance+arteries+through+enhanced+Ca2%2B-activated+K%2B+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).</li>
<li>Attems, J., Jellinger, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+overlap+between+vascular+disease+and+Alzheimer%27s+disease--lessons+from+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology.</a> BMC Medicine. 12, 206(2014).</li>
<li>Fisher, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+arterial+lesions+underlying+lacunes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The arterial lesions underlying lacunes.</a> Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).</li>
<li>Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+electrical+signaling+in+arterial+endothelial+tubes%3A+New+insights+into+cellular+physiology+and+cardiovascular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function.</a> Microcirculation. 24 (3), (2017).</li>
<li>Dunn, K. M., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+signaling+in+the+brain+and+the+pathological+consequences+of+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).</li>
<li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries%3A+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).</li>
<li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+and+IKCa+Channels%2C+myogenic+tone%2C+and+vasodilator+responses+in+middle+cerebral+arteries+and+parenchymal+arterioles%3A+effect+of+ischemia+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion.</a> Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).</li>
<li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signal+profiles+in+vascular+endothelium+from+Cdh5-GCaMP8+and+Cx40-GCaMP2+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice.</a> Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).</li>
<li>Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+genetically+encoded+voltage+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators.</a> Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).</li>
<li>Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unitary+TRPV3+channel+Ca2%2B+influx+events+elicit+endothelium-dependent+dilation+of+cerebral+parenchymal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).</li>
<li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+electrical+conduction+along+endothelial+tubes+of+resistance+arteries+through+Ca2%2B-activated+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels.</a> Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).</li>
<li>Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+conduction+along+endothelial+cell+tubes+from+mouse+feed+arteries%3A+confounding+actions+of+glycyrrhetinic+acid+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives.</a> British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).</li>
<li>Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+basement+membrane+in+the+healthy+and+pathological+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+of+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain.</a> Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).</li>
<li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> elife. 9, 51413(2020).</li>
<li>Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+is+associated+with+changes+to+the+biomechanical+properties+of+the+posterior+cerebral+artery+and+parenchymal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).</li>
<li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+endothelial+cells+are+exquisite+sensors+of+age-related+circulatory+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues.</a> Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

越来越多的证据表明，脑血管疾病、衰老和阿尔茨海默病之间存在密切关联，是当前痴呆症研究的热点话题4,8,14,21因此，显然对脑血管网络的研究将在健康领域产生广泛影响，同时需要在各种条件下持续进行深入探索&#160;疾病。作为脑灌注中血管阻力的重要位点，实质小动脉在心血管疾病（CVD）病因学及发展中的普遍重要性已被强调了50多年。22.
然而，直到最近出现离体（ex vivo）研究方法，例如分离并加压的实质小动脉11和CaPA12制备技术，用于研究完整的实质小动脉及其组成细胞类型的科学检测工具才得到充分发展。脑血管生理学领域还将受益于同型细胞研究模型（平滑肌细胞、周细胞和...

实质小动脉直接向全脑输送必需的氧气和营养物质1。这些具有高度血管活性的小动脉在与毛细血管连接的同时，会响应由毛细血管离子通道启动的逆行信号，这些通道可感知特定神经区域的代谢信号2。尽管脑实质历来是研究的主要焦点，但目前研究发现，内皮功能障碍在阐明多种脑血管疾病（如缺血性卒中、阿尔茨海默病）相关病理机制中发挥着重要作用，而这些疾病是痴呆的潜在基础3,4,5,6。内皮细胞对于脑组织的灌注至关重要，其功能与不同血管节段在遗传、结构和功能上的异质性密切相关7。由于软脑膜动脉相对较大、节段性血管阻力较高，并在向下方大脑皮层分配血流方面起关键作用，因此已被广泛研究8,9。因此，深入理解小动脉内皮的作用机制，有望促进对健康与疾病状态下脑血流调节机制的认识，并推动新型治疗方案的开发。
越来越多的证据表明，研究实质小动脉与不同信号通路及疾病之间的关系具有重要意义8,10。然而，目前这一研究方法仅局限于使用完整的加压小动脉11 和/或毛细血管-实质小动脉（CaPA）制备物12。由于技术上的困难，尚无研究对 freshly isolated（新鲜分离）、不含其他细胞类型及混杂因素的原代脑实质小动脉内皮细胞进行检测。本文在先前报道的软脑膜动脉内皮分离技术13 基础上加以改进，实现了对脑实质小动脉内皮（直径：~25 µm，长度：~250 µm）的可靠且可重复的分离。该技术有助于在细胞个体取向及其细胞网络中，实现对电耦合和化学耦合细胞的最佳分辨率观察。
重点关注的通路包括细胞内 Ca2+ ([Ca2+]i)信号传导及膜电位（Vm)14,15—对血管舒张至关重要16—使血液进入毛细血管，向活跃的实质细胞输送氧气和营养物质17这些制备方法可用于对离子通道（包括Ca）进行实时电生理记录2+-通透的，瞬时受体电位（TRP）和K+ 在接近生理条件下，对内皮细胞管内的细胞器进行通道分析和/或荧光成像。该技术适用于研究内皮细胞调控脑实质血流输送所涉及的生理细胞机制的科研人员。总体而言，该技术将有助于研究人员更深入地理解嵌入脑实质的小动脉中内皮信号通路的基本机制及其网络通信功能&#160;解决与脑血管生理学和病理学相关的问题。

<table><tbody><tr><td>放大器</td><td>Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔</td><td>Axoclamp 2B &amp;和 Axoclamp 900A</td><td></td></tr><tr><td>可听基线监测器</td><td>Ampol US LLC，佛罗里达州萨拉索塔，美国</td><td>&amp;nbsp;BM-A-TM</td><td></td></tr><tr><td>浴槽冷却器（Isotemp 500LCU）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13874647</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管（Pinning）</td><td>Warner Instruments</td><td>G150T-6</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管（尖端电极）</td><td>Warner Instruments</td><td>GC100F-10</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管（机械吹打）</td><td>美国佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司（World Precision Instruments, WPI）</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA：牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2：氯化钙</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶（H型混合物）</td><td>Sigma</td><td>C8051</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 (2.4&amp;nbsp;&amp;times;&amp;nbsp;5.0&amp;nbsp;厘米</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>数据采集数字化仪</td><td>Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔</td><td>Digidata 1550A</td><td></td></tr><tr><td>解剖皿（带活性炭硅胶底的玻璃培养皿）</td><td>美国佛蒙特州圣奥尔本斯市 Living Systems Instrumentation 公司</td><td>DD-90-S-BLK</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma</td><td>D8255</td><td></td></tr><tr><td>DMSO：二甲基亚砜</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>弹性蛋白酶（猪胰腺）</td><td>Sigma</td><td>E7885</td><td></td></tr><tr><td>内质网示踪剂（ER-Tracker Red，BODIPY TR 格列本脲）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>E34250</td><td></td></tr><tr><td>光纤光源</td><td>&amp;nbsp;德国美因茨，肖特公司 &amp;& KL200，蔡司</td><td>Fostec 8375</td><td></td></tr><tr><td>流量控制阀</td><td>Warner Instruments</td><td>&amp;nbsp;FR-50</td><td></td></tr><tr><td>荧光系统接口，ARC灯 &amp;放大器和电源、超速开关和光电倍增管</td><td>Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔</td><td>IonOptix 系统</td><td></td></tr><tr><td>镊子（细尖，锋利）</td><td>FST</td><td>Dumont #5 &amp;amp; Dumont #55</td><td></td></tr><tr><td>函数发生器</td><td>EZ Digital，韩国首尔</td><td>FG-8002</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM 染料</td><td>美国加利福尼亚州卡尔斯巴德，Invitrogen</td><td>F14185</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HCl：盐酸</td><td>赛默飞世尔科技公司（美国宾夕法尼亚州匹兹堡）</td><td>A466250</td><td></td></tr><tr><td>前置放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>HS-2A &amp;amp; HS-9A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES：（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>在线溶液加热器</td><td>Warner Instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>KCl：氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2：氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Narishige，美国纽约州东草地</td><td>&amp;nbsp;MF-900</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>锡斯基尤</td><td>&amp;nbsp;MX10</td><td></td></tr><tr><td>数字微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instruments，诺瓦托，加利福尼亚州，美国</td><td>P-97 或 P-1000</td><td></td></tr><tr><td>显微镜（Nikon 倒置）</td><td>尼康仪器公司，美国纽约州梅尔维尔</td><td>Ts2</td><td></td></tr><tr><td>显微镜（Nikon 倒置）</td><td>尼康仪器公司</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>显微镜物镜</td><td>尼康仪器公司</td><td>20倍（S-Fluor）和40倍（Plan Fluor）</td><td></td></tr><tr><td>显微镜平台（阳极氧化铝；直径，7.8&amp;nbsp;cm</td><td>Warner Instruments</td><td>PM6 或 PH6</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载物台（铝制）</td><td>美国俄勒冈州格兰茨帕斯，西斯基尤</td><td>8090P</td><td></td></tr><tr><td>显微注射泵控制器</td><td>美国佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司（World Precision Instruments, WPI）</td><td>SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>MTA：2-甲基硫代腺苷二磷酸三钠盐</td><td>Tocris</td><td>1624</td><td></td></tr><tr><td>NaCl：氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaOH：氢氧化钠</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>核染料（NucBlue Live ReadyProbes 试剂；Hoechst 33342）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>示波器</td><td>Tektronix，美国俄勒冈州比弗顿</td><td>&amp;nbsp;TDS 2024B</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>P4762</td><td></td></tr><tr><td>相差物镜</td><td>尼康仪器公司</td><td>&amp;nbsp;(Ph1 DL；10X &amp;& 20X)</td><td></td></tr><tr><td>细胞膜染料（CellMask Deep Red）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C10046</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglas 灌流室</td><td>美国康涅狄格州卡姆登，华纳仪器公司</td><td>RC-27</td><td></td></tr><tr><td>剪刀（3 mm &amp;和 7 mm 刀片）</td><td>Fine Science Tools（或 FST），美国加利福尼亚州福斯特城</td><td>Moria MC52 &amp;amp; 15000-00</td><td></td></tr><tr><td>剪刀（Vannas 型；9.5&amp;nbsp;毫米 &amp;和 3&amp;nbsp;毫米刀片</td><td>World Precision Instruments</td><td>555640S, 14364</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>蔡司，纽约，美国</td><td>Stemi 2000 &amp;amp; 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器（0.22 &amp;micro;m)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>722-2520</td><td></td></tr><tr><td>双通道温度控制器</td><td>华纳仪器</td><td>TC-344B 或 C</td><td></td></tr><tr><td>阀门控制系统</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6</td><td></td></tr><tr><td>减振台</td><td>美国马萨诸塞州皮博迪，技术制造公司</td><td>&amp;nbsp;微重力</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠脑实质微动脉内皮细胞的分离与功能分析

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

脑血流由血管阻力动脉及下游的实质小动脉输送。从动脉到小动脉，血管直径逐渐减小，血流的稳态血管阻力随之增加，最终小动脉将血液输送至毛细血管。由于小动脉体积较小且位于脑实质内，相较于表面的软脑膜动脉，其研究相对较少，研究结果的可重复性也较低。然而，小动脉内皮细胞的结构与功能对于慢性退行性疾病的生理机制和病因至关重要，亟需深入研究。特别是，新兴证据表明，内皮功能受损先于并加剧认知障碍和痴呆的发生。
在实质微循环中，内皮细胞K+通道功能是最强效的刺激因素，可精细调控血管舒张的传播，从而促进神经元活动区域的血流量增加。本文介绍了一种优化的方法，用于从小鼠脑实质小动脉中新鲜分离出完整且电耦合的内皮&#34;管状结构&#34;（直径约25 µm）。在生理条件（37 °C，pH 7.4）下固定小动脉内皮管状结构，有助于明确涵盖K+通道功能及其调控机制的实验变量，包括细胞内Ca2+动态变化、膜电位改变以及膜脂质调控。与大动脉内皮相比，该技术的显著优势在于能够更清晰地分辨细胞及细胞器（如线粒体）的形态尺寸，从而拓展了该技术的应用价值。终生维持健康的脑灌注依赖于实质小动脉中强大的内皮功能，直接将血流与脑内精确解剖区域的神经元和胶质细胞活动的能量供应相联系。因此，预期该方法将显著推动关于健康与疾病状态下脑血管生理学及神经科学领域的整体认知。

该方案的演示如图所示 图1 伴小动脉解剖及内皮细胞管分离步骤 图2 和 图3，分别。在此，通过测量[Ca2+]i 和 Vm 使用Fura-2光度法和锋电位电极电生理学图4A) 在给予药理学试剂［2-甲基硫代二磷酸腺苷（MTA），一种强效的嘌呤能受体（P2YR）激动剂］后 37 °C. 加入MTA后（1 µM），[Ca2+]i 迅速增加（图4B）伴随超极化（图 4C）。这些测量结果反映了G蛋白偶联受体的激活状态q-蛋白偶联受体（P2YRs），随后激活小电导和中电导Ca2+激活的 K+ 通道（SKCa</...

本文展示了从小鼠脑实质小动脉中大量制备完整脑微血管内皮&#34;管状结构&#34;的方法，用于研究脑血流调节机制。此外，我们还阐述了该内皮细胞研究模型在荧光成像和电生理学检测中的实验优势，可应用于关键细胞信号通路的分析，包括细胞内[Ca2+]浓度变化和膜电位变化。

脑血流由血管阻力动脉及下游的实质小动脉输送。血流的稳态血管阻力……

该方法将有助于更深入地理解脑实质小动脉内皮的功能，这种功能直接将脑内血流与全脑神经元和胶质细胞活动的能量供应联系起来。与小动脉内皮相比，该技术的一个显著优势在于能够更清晰地分辨单个脑内皮细胞及其各自细胞器的形态学特征，以及钙信号和电信号的传递。最初，脑内皮的分离与观察将极具挑战性。然而，通过大量练习并保持耐心和专注，是有可能熟练掌握这一技术的。将分离出的大脑置于含有冷解剖液的烧杯或培养皿中进行清洗，以去除大脑表面残留的血液。将腹侧朝上的大脑放入盛有冷解剖液的容器中，以分离脑实质小动脉。为了分离实质小动脉，将离体脑组织置于含有深度超过50厘米的炭粉浸润硅胶聚合物涂层的培养皿中，在冷解剖液内用钢针固定。使用锋利且对齐的解剖剪，在大脑中动脉（MCA）周围从两侧半球切割出矩形脑组织，确保组织片段的上部已越过大脑动脉环（circle of Willis）的分支点。用钢针将脑组织固定于培养皿中，使大脑中动脉（MCA）朝上。在针钉附近小心地做一个浅切口，用小镊子去除软脑膜，从一端轻轻剥离至另一端。将带有源自大脑中动脉分支的脑实质小动脉的分离软脑膜小心地用针钉固定于培养皿中，并仔细解剖脑实质小动脉。剪除任何残留的远端分支，确保小动脉干净，无任何附着组织。使用此清洁完整的微动脉进行酶消化。或者，根据需要可将每根微动脉切成两段，用于酶消化以制备内皮管。对于微动脉段的部分消化，将完整的微动脉段放入含有木瓜蛋白酶、二硫赤藓醇、胶原酶和弹性蛋白酶的10毫升玻璃管中的1毫升解离溶液内。将小动脉节段在34摄氏度下孵育10至12分钟。为分离小动脉内皮管，将连接微型注射器的吹打移液管置于腔室中的解离溶液内，并靠近消化后的血管节段一端。在泵控制器上设定每秒1至3纳升的流速，进行轻柔吹打。在保持100倍至200倍放大倍数的同时，将小动脉节段吸入移液管中，然后注入溶液以分离外膜和血管平滑肌细胞。反复吹打血管节段，直至所有平滑肌细胞均被分离，仅剩内皮细胞保持完整的管状结构。使用显微操作器，用硼硅酸盐玻璃固定移液管将内皮管的两端固定在腔室内的玻璃盖玻片上。为测量内皮细胞膜电位，在使用4倍物镜观察时，通过显微操作器小心地将尖锐电极尖端置于小动脉内皮管某一细胞正上方的流动生理盐溶液中。逐渐将放大倍数增加至400倍，并根据需要重新调整电极尖端的位置。使用显微操作器，将锐利电极的尖端轻轻插入内皮管的一个细胞中，并使用电位计开始记录膜电位（VM）。当内皮细胞静息膜电位稳定在负30至负40毫伏时，根据实验目的施加所需的药理学试剂。在37摄氏度条件下，用细胞膜或目标细胞器的荧光示踪剂孵育内皮管15至30分钟。用新鲜的灌流生理盐溶液洗涤细胞，并在显微镜下以相应染料的激发波长对活细胞进行成像。通过在37摄氏度条件下检测药理学试剂MTA（一种强效嘌呤能受体激动剂）刺激下细胞内钙离子浓度和膜电位的变化，评估内皮功能。加入一微摩尔 MTA 后，细胞内钙离子浓度迅速升高，同时伴随膜电位超极化。此外，将完整的内皮细胞在 37 摄氏度下与荧光示踪剂共同孵育，以观察细胞形态。活体内皮细胞成像显示细胞膜和细胞核的共染色。细胞膜与内质网荧光染料共同染色，使得靠近细胞膜的内质网区域在重叠处呈现橙色。实验人员在解剖和分离过程中应格外小心，避免损伤微动脉，因为受损的微动脉必然无法获得完整的内皮管结构。在完成该操作后，细胞可用于固定后的免疫组织化学染色（使用荧光抗体），或对细胞器及膜脂质进行活细胞染色。该技术将产生新的信息，有助于从生理学基本层面理解脑血流的机制，并为选择性地向病理状态转变提供治疗依据。

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小鼠脑实质小动脉内皮的分离及功能分析

本视频展示了从小鼠大脑中分离构成血脑屏障（BBB）的完整血管，以及神经元和胶质细胞的方法。所分离的血管可用于建立体外模型，以研究其在维持大脑稳态中的作用。...

分离小鼠脑血管：从小鼠脑组织样本中分离完整血管的实验方案

本视频展示了一种从小鼠脑实质中分离血管内皮管的方法。通过酶消化与机械解离相结合，该方法可获得完整保留内皮细胞的血管管状结构。...

从小鼠脑实质微动脉制备脑血管内皮管

来源：Hakim, M. A. 等，小鼠脑实质微动脉内皮的分离与功能分析。J. Vis. Exp.

小鼠微动脉内皮中钙动力学与膜电位变化的分析

脑微血管内皮细胞（BMEC）通过特定的连接蛋白相互连接，形成高度调控的屏障，将血液与中枢神经系统（CNS）分隔开来，即所谓的血脑屏障（BBB）。本方案所述的原代小鼠脑微血管内皮细胞的分离，可实现对BBB进行深入的体外研究。...

分离原代小鼠脑微血管内皮细胞

我们描述了一种用于纯化小鼠脑血管组分的实验方案。分离出的脑血管包括由紧密连接连接的内皮细胞，以及被连续基底膜、周细胞、血管平滑肌细胞和血管周围星形胶质细胞膜包绕的结构。...

小鼠脑血管的纯化

本文描述了一种简单且可重复的小鼠脑内小动脉（包括实质小动脉、穿支小动脉和毛细血管前小动脉的一类血管）分离方案，可用于压力肌图分析、免疫荧光、生物化学及分子生物学研究。...

脑实质小动脉的分离与套管插管

来自人脑组织的分离脑毛细血管可作为临床前模型，用于研究生理和病理生理条件下血脑屏障的功能。本文中，我们介绍了一种从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管的优化方案。...

从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管

本文描述了一种从大鼠视网膜分离小动脉的简便方案，可用于电生理学、钙成像和压力肌动图研究。...

视网膜小动脉的分离用于 离体 细胞生理学研究

本文演示了以下实验方案：（1）新鲜分离完整的大脑微血管内皮“管状结构”；（2）在内皮依赖性超极化过程中，同步测量内皮细胞的钙离子浓度和膜电位。此外，这些方法允许将内皮细胞的钙信号和电学信号作为独立或交互的实验变量进行药理学调控。...

同时测量新鲜分离且完整的小鼠脑血管内皮细胞内的钙离子浓度和膜电位

本文详细介绍了如何从小鼠脑组织中分离海马动脉小动脉和毛细血管，以及如何对其进行加压，以用于压力肌图、免疫荧光、生物化学和分子生物学研究。...

离体加压海马毛细血管-实质小动脉制备用于功能研究

学习从小鼠脑实质小动脉分离完整内皮管的方法，用于研究脑血流调节机制。该技术结合荧光成像和电生理测量，可分析细胞内钙信号和膜电位变化，为理解脑血管生理与病理提供新见解。

小鼠脑实质微动脉内皮细胞的分离与功能分析

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