基于浴铜灵的比色法测定组织非血红素铁含量

本文提供了一种测定动物组织中非血红素铁含量的实验方案。该方法采用一种简单且成熟的比色法，可在大多数实验室中轻松实施。基于浴铜灵的比色法无需复杂操作技能或昂贵仪器，且可适配于微孔板形式，以提高样品通量并降低成本。

本方案适用于检测多种铁过载或铁代谢异常实验动物模型中组织铁水平的变化。首先使用手术刀切取10至100克的组织样本，并将其置于一小片Parafilm上，用分析天平准确称重。

使用塑料镊子将组织样本放入24孔板中。在65摄氏度的标准培养箱中干燥48小时。或者，使用镊子将组织样本放入无铁的聚四氟乙烯杯中，并在实验室微波消解炉中进行干燥。

将每块干燥的组织置于分析天平上的一小块对苯二甲醛上，准确称重。将每块干燥的组织转移至一个1.5毫升微量离心管中。向管中加入一滴酸混合液，并盖紧管盖。

除不加入组织外，其余步骤相同，制备酸空白对照。将试管在65摄氏度下孵育20小时以消化组织。冷却至室温后，使用配有塑料吸头的微量移液器，将500微升澄清的酸性提取液转移至新的1.5毫升微量离心管中。

将显色反应直接加入平底96孔透明未处理聚苯乙烯微孔板中。室温孵育15分钟。使用酶标仪在535纳米波长下，以去离子水为参比，测定样品的吸光度。

此处展示了基于比色杯和96孔微孔板的比色法测定非血红素铁的实验方法。图中显示了来自六只六个月大雄性黑鼠的55个组织样本（包括肝脏、脾脏、心脏、肺和骨髓）中，比色杯法与微孔板法测定的非血红素铁水平之间的相关性。两种方法之间高度相关，表明基于微孔板的方法是传统比色杯法的有效替代方案。

最后，采用基于微孔板的方法对来自相同组织的样本进行酸消化后，测定非血红素铁含量，消化液为盐酸与三氯乙酸的混合液或单独盐酸。高相关性表明三氯乙酸可从酸消化步骤中省略。代表性图像显示了通过基于浴铜灵的比色法测定的雄性C57BL/6野生型小鼠及雄性Hepcidin基因敲除小鼠（C57BL/6遗传背景）肝脏、脾脏、心脏和胰腺中的非血红素铁水平。

铁调素的破坏会导致类似血色病的铁沉积表型，表现为严重的肝脏、胰腺和心脏铁蓄积以及脾脏铁耗竭。此处展示了实验性铁调节后幼年雌性欧洲海鲈的肝脏非血红素铁水平。经铁处理的动物其肝脏铁水平显著升高。

而贫血仅导致肝脏铁储存量轻度降低。代表性图像显示了使用基于浴铜灵的比色法测定的1月龄果蝇中的非血红素铁水平。结果显示每20只果蝇为一组的非血红素铁含量，或每只果蝇的估计铁含量。

以每只果蝇平均重量为0.64毫克计算。在进行此操作时，请务必彻底清洁所有玻璃器皿，并避免金属制实验材料与任何试剂或溶液接触，以防污染。