Name: 丝状蓝藻腔隙的自然转化、蛋白表达和低温保存 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: 学习丝状蓝藻Phormidium lacuna的自然转化方法，用于振荡藻目遗传学研究。本实验展示DNA转化、运动性观察及GFP表达技术，为蓝藻基因功能研究提供基础。

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本工作由卡尔斯鲁厄理工学院资助。

1. 从自然环境中分离
注意：可分离绿藻、硅藻、丝状蓝藻及其他微藻。该方案可用于在实验室条件下培养的岩池中任何微藻物种的分离。属于颤藻目（Oscillatoriales）的丝状蓝藻可通过其运动性和丝状形态轻松识别。该物种可通过基因组测序或16S rRNA测序在半纯状态下进行鉴定。
<ol>
	<li>将来自海洋潮池（即岩质海岸上的凹坑）的液态海水样品转移至50 mL三角瓶中。对每个三角瓶，记录自然来源的准确位置或坐标。若有可能，通过50 µm滤网过滤样品内容物，以减少浮游动物的量。将样品在4 °C下保存，直至可进行继代培养。</li>
	<li>将1 mL培养物转移至含有f/2培养基中3%细菌琼脂的10 cm培养皿中22,23（参见材料表）。准备最多20个平板。在50 µmol m-2 s-1的白光下培养。 
	注意：可采用更高的光照强度进行培养。P. lacuna可耐受高达400 µmol m-2 s-1的光照强度，但其他物种可能对光更敏感。</li>
	<li>一周后，在无菌条件下使用双目显微镜和无菌镊子将目标细胞转移至新鲜的琼脂平板上。将旧的琼脂平板在4 °C下保存，直至新平板上的细胞出现并生长。</li>
	<li>每周重复此转移步骤，以消除污染。用肉眼检测严重污染，并使用400倍放大倍率的显微镜进行额外的污染检查。</li>
	<li>若样品似乎无污染，则在琼脂平板上检测细菌或真菌污染。用接种环取部分培养物转移至LB24琼脂平板（直径10 cm），将平板置于室温下，并在1–3天内观察污染物的生长情况。</li>
	<li>若获得无菌的丝状蓝藻物种，则可用于进一步的培养工作。将P. lacuna在液体培养基或细菌琼脂平板上培养。液体培养时使用250 mL三角瓶，内含50 mL f/2培养基或f/2+培养基。</li>
</ol>
2. DNA 提取
注意：本方法改编自 25&#160;26
<ol>
	<li>准备两个含有50 mL f/2培养基的锥形瓶，每个锥形瓶接种约1 mL P. lacuna 来自其他培养物的丝状体。将培养物置于白光（50）下，以50 rpm转速振荡（水平旋转）培养7天或更长时间 &#181;mol m-2&#160;s-1) 在 25 &#176;C.</li>
	<li>用超声波处理培养物（参见 材料清单) 全能量处理 2 分钟。在 750 nm 处测量 OD 值，确保其约为 0.5。若 OD 值过低，则继续培养菌液。</li>
	<li>以 5,000 × g 离心收集丝状体 &#215; g，20 分钟离心。移除上清液。将带有残留液体的丝状体转移至法国压滤器的加压室中27将法国压滤器的压力设定为 20,000 psi 并进行细胞提取。 
	注意：法国压榨机将裂解所有细胞并释放DNA；强烈的剪切力会产生1,500 bp的DNA片段。</li>
	<li>将样品在 10,000 × g 条件下离心 10 分钟 &#215; g 并移除上清液。</li>
	<li>加入400 &#181;L 裂解缓冲液（4 M 尿素，0.1 M Tris/Cl，pH 7.4）和 50 &#181;加入 10 mg/mL 蛋白酶 K 溶液至沉淀中。将样品加热至 55 ℃ &#176;在 550 rpm 条件下振荡孵育 60 分钟。</li>
	<li>加入1 mL DNA提取缓冲液（3% CTAB，1.4 M NaCl，10 mM EDTA，0.1 M Tris/Cl，1% Sarkosyl，0.1 M DTT，pH 8），在55°C下孵育60分钟 &#176;C 和 550 rpm。将溶液转移至离心管中，加入两倍体积的氯仿/异戊醇（24/1）。</li>
	<li>振荡后，在9,000 × g条件下离心样品5分钟 &#215; g. 将上层水相转移至反应小管中，加入1 mL预冷的乙醇和50 &#181;3 M 醋酸钠溶液，体积为 L</li>
	<li>涡旋样品并置于 -20 &#176;C，1 小时或更长时间。</li>
	<li>离心5分钟，10,000 × g &#215; g (4 &#176;C）并弃去上清液。用70%乙醇洗涤沉淀。</li>
	<li>再次离心样品。移去上清液，并将沉淀物过夜干燥。用无核酸酶的水溶解DNA。测定DNA的光谱，以检查OD 260 nm/OD 280 nm比值是否&#160;介于 1.6 和 1.9 之间。</li>
	<li>在琼脂糖凝胶电泳中分析DNA片段的大小28.</li>
	<li>通过下一代测序对基因组DNA进行300个循环的测序，采用双端测序模式，读长为150个碱基（参见 材料清单).</li>
	<li>使用合适的计算机程序进行组装；参见所提供的示例 材料表.</li>
	<li>将草图基因组提交至RAST服务器进行注释。 
	&#8203;注意：上传DNA序列可在几分钟内获得完整注释。</li>
</ol>
3. 天然转化与GFP表达
注意：转化基于在 E. coli 中扩增的质粒载体；可使用 pGEM-T 或 pUC19 作为骨架载体。许多实验室已建立克隆技术；另请参见标准方案28 以及关于 P. lacuna 转化载体的文章15,29。sfGFP 表达所用载体的示例见结果代表部分。四种尚未发表载体的详细信息见补充文件1。
<ol>
	<li>所有步骤均需在无菌实验室条件（超净台、无菌玻璃器皿）下使用无菌材料进行。</li>
	<li>在两个250 mL的锥形瓶中，各接种1 mL的f/2液体培养基，共两份，每份50 mL P. lacuna 来自正在培养的丝状体。在白光（50 &#181;mol m-2 s-1）在25℃、振荡（水平旋转，50 rpm）条件下培养约5天 &#176;C.</li>
	<li>准备约200 &#181;使用中量提取试剂盒（midi prep kit）提取转化载体 DNA 的 g 材料表按照制造商说明书操作。</li>
	<li>将100 mL样品均质化 P. lacuna 细胞悬液（参见 材料清单) 在10,000 rpm下离心3分钟。测定750 nm处的OD值（目标值 = 0.35）。</li>
	<li>将细胞悬液在6,000 × g下离心15分钟 &#215; g. 去除上清液，将沉淀重悬于 800 &#181;L（包括残留液体和丝状体的总体积）剩余液体及额外f/2+ 培养基</li>
	<li>取八份 f/2+ 含 120 的 Bacto-琼脂平板（直径 10 cm） &#181;g/mL 卡那霉素。用移液器加入 10 &#181;将 DNA 的 g 加入每个琼脂平板的中央。立即用移液器加入 100 &#181;将细胞悬液各1 L加入每个琼脂平板中央（置于DNA上方）。</li>
	<li>将无盖的琼脂平板置于超净工作台中，使多余液体挥发。随后盖上平板，在25℃白光条件下培养。 &#176;C下培养2天。</li>
	<li>用接种环将每个f/2琼脂平板上的丝状体分散到多个新鲜的f/2琼脂平板上+ 含 120 的 Bacto-琼脂平板 &#181;g/mL 卡那霉素。在25℃白光条件下培养平板 &#176;C，并定期在显微镜下检查培养物。</li>
	<li>在显微镜下观察7-28天后，鉴定存活的转化菌丝。寻找健康、呈绿色的菌丝（图2）与其他丝状体不同。如果能够识别出这些绿色丝状体，则继续下一步；否则，将培养皿再保留7天。</li>
	<li>使用镊子将这些已鉴定的活体丝状体转移至50 mL液体f/2培养基中+ 含250的培养基 &#181;g/mL 卡那霉素。在25℃白光下培养 &#176;在摇床（水平旋转，50 rpm）上培养，观察生长情况长达四周。</li>
	<li>将丝状体转移回含有250的琼脂培养基中 &#181;g/mL 卡那霉素，并等待丝状体生长。数天后，将单根丝状体转移至含有更高浓度卡那霉素的新鲜琼脂平板上，例如 500 &#181;g/mL。保留原始平板。</li>
	<li>确保在液体培养或琼脂培养基中，以高浓度卡那霉素维持丝状体的增殖。再次提高卡那霉素浓度以加速分离。 
	注意：转化后 P. lacuna 可在高达 10,000 的条件下生长 &#181;g/mL 卡那霉素。其他物种可能无法耐受如此高的浓度。</li>
	<li>如果抗性细胞在平板上生长并广泛分布，可检测插入片段在基因组中的整合情况 P. lacuna 通过使用外侧引物和内侧引物进行PCR扩增。
	<ol>
		<li>使用为插入片段克隆设计的引物作为内侧引物。</li>
		<li>在设计外侧引物时，选择位于基因组上拟插入位点的5'端和3'端的序列 P. lacuna 但在插入片段之外。&#160;</li>
		<li>PCR 反应中使用内侧引物和外侧引物。使用抗性菌株和野生型菌株。&#160; 
		注：内侧引物表明插入片段存在；外侧引物表明插入片段位于正确位点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每个PCR反应中，直接取约10 mg的丝状体放入PCR管中，按照标准操作程序进行PCR反应。24若未获得产物，可调整退火温度，并用水清洗菌丝。 
	注意：PCR 可使用多种不同的聚合酶。标准聚合酶（如 Taq 聚合酶）的错误率高于具有校对功能的聚合酶，但后者价格更高。本分析型 PCR 无需使用具有校对功能的聚合酶。然而，若使用标准聚合酶未能获得 PCR 产物，则应尝试使用具有校对功能的聚合酶。</li>
	<li>在琼脂糖凝胶电泳中分析抗性菌株的PCR产物24.
	<ol>
		<li>将条带位置与标记物进行比较，并比较野生型和转化子。使用内部 和 外侧引物，观察转化子是否比野生型出现更大的条带（由于抗性盒的插入），或转化子出现两条条带：一条与野生型条带大小相同，另一条更大。后一种情况表明分离不完全，需继续在高浓度卡那霉素条件下培养。 
		注：有关PCR和电泳的更多细节，请参见15,24 或其他标准文献。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于GFP表达：使用荧光显微镜观察单根丝状体（参见 材料表在物镜放大倍数为40x或63x的条件下，采集明场透射图像和荧光图像。GFP检测使用以下设置：激发光波长为470 nm带通滤光片，发射光波长为525 nm带通滤光片，分光镜波长为495 nm，初始曝光时间为500 ms。</li>
	<li>调整曝光时间以获得清晰的荧光信号，避免信号饱和。尽量对所有样品使用相同的设置。</li>
	<li>由于野生型丝状体也会发出荧光，因此需使用与上述相同的设置拍摄背景荧光图像。 
	&#8203;注意：表达GFP的菌株必须具有更高的信号；否则，即表示未表达GFP。</li>
	<li>根据荧光图像的曝光时间和像素强度，计算并比较不同丝状体的GFP含量。</li>
</ol>
4. 冷冻保存
注意：P. lacuna 和单细胞蓝细菌 Synechocystis sp. PCC 6803 被使用。本方法对 P. lacuna 的效果更佳。
<ol>
	<li>培养 P. lacuna 或 集胞藻属sp PCC 6803 在 10 mL f/2 培养基中培养至少 10 天+ 或 BG-11 培养基，在白光（50 &#181;mol m-2 s-1) 在 25 &#176;C，振荡培养（水平旋转，50 rpm）。</li>
	<li>匀浆处理 P. lacuna 培养（参见 材料表) 在10,000 rpm下离心3分钟，或使用超声波设备（参见 材料表) 2分钟，全能量处理。测定任一培养物在750 nm处的OD值，以确认其数值在1至7之间。</li>
	<li>通过离心在 6,000 × g 条件下收集细胞 &#215; g 15 分钟后，去除上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于800 &#181;f/2 升+ 或 BG-11 培养基（终体积），转移至 2 mL 冻存管中。加入 800 &#181;加入1体积50%甘油溶液至细胞悬液中。盖紧小瓶，通过反复倒置混匀。</li>
	<li>将冻存管转移至液氮中，并存放在-80℃超低温冰箱的冻存盒内 &#176;C 冷冻箱。记录盒子在冷冻箱中的位置以及样品在盒子内的坐标。</li>
	<li>为回收细胞，取出冻存管并在室温下解冻内容物。将内容物转移至2 mL离心管中。</li>
	<li>将样品洗涤两次。对于1st 洗涤，6,000离心 &#215; g 5 分钟。移除上清液，将沉淀重悬于 2 mL f/2 培养基中+ 或 BG-11 培养基。对于 2nd 洗涤，于6,000离心后重新离心 &#215; g 5 分钟后，去除上清液，将沉淀重悬于 2 mL f/2 培养基中+ 或 BG-11 培养基。</li>
	<li>为检验这些准备用于培养的细胞的完整性，将菌体沉淀转移至9 mL培养基中，并在白光（50 &#181;mol m-2 s-1在振荡（55 rpm）条件下培养，比较培养物在第一天和一周后的OD 750 nm值。</li>
</ol>
5. Phormidium lacuna 的运动性
注意：将描述三种不同的检测方法。所有情况下均使用同一种培养物。
<ol>
	<li>在f/2培养基中，于白光（50 µmol m-2 s-1）条件下以水平振荡（50 rpm）培养P. lacuna约5天，直至估计OD 750 nm达到0.35。将样品储存于4 °C，待用。</li>
	<li>以10,000 rpm均质化丝状体（见材料表）3分钟，或以超声（见材料表）在最大功率和1个循环下处理1分钟。测定OD 750 nm。若OD值高于0.35，则用f/2培养基稀释该组分。将此溶液用于步骤5.3、5.4和5.5中的运动性检测。</li>
	<li>液体培养基中的运动性检测
	<ol>
		<li>为直接观察运动性，将8 mL含有P. lacuna的培养基（来自步骤5.2）转移至6 cm培养皿中。静置数分钟，使样品达到室温。用玻璃纸膜覆盖培养皿。</li>
		<li>将显微镜载玻片置于配备相机的标准显微镜的x-y载物台上。打开显微镜光源。理想情况下，始终使用相同的电学和光学照明设置。将4倍或10倍物镜移入光路中。</li>
		<li>将培养皿置于载玻片上方。通过载物台的x、y和z方向移动，调整单根丝状体或丝状体束的位置。 
		注：由于三维排列，仅部分相关区域可处于焦平面内。玻璃纸膜可实现无限制的焦距调节。</li>
		<li>观察单根丝状体或束的运动。确保物镜不接触液体。使用标准显微镜相机记录丝状体的运动（见补充视频S1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>表面运动性检测
	<ol>
		<li>为观察丝状体在琼脂表面的运动性，准备含f/2细菌琼脂的6 cm培养皿。确保琼脂高度足够，使物镜可接近琼脂表面。或者，制备约3 mm厚的琼脂层，并透过琼脂记录丝状体（将培养皿倒置或使用倒置显微镜）。</li>
		<li>用移液器将0.5 mL含有P. lacuna的溶液（来自步骤5.2）滴加至6 cm培养皿的细菌琼脂表面。让液体渗入表面。盖上培养皿，使用4倍或10倍物镜观察丝状体在表面的运动。</li>
		<li>确保在整个记录过程及后续记录中使用相同的显微镜电学和光学设置。</li>
		<li>使用目镜相机和微型计算机系统采集延时图像。确保连续图像之间的时间间隔为5秒至1分钟。编程微型计算机的Linux脚本以控制延时记录。示例脚本见补充文件2，示例视频见补充视频S2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>趋光性检测
	<ol>
		<li>进行趋光性实验时，制备发光二极管（LED）支架（此处使用3D打印机打印），将选定的5 mm LED安装于其中，以便从下方至上方照射20 mm2的区域（图3）。如需，可并行使用多个LED支架，每个LED通过电阻和电位器连接至可调电源。根据实验需要测量并调节LED光强。确保整个装置处于暗室或封闭的暗容器中。</li>
		<li>将8 mL含有P. lacuna的培养基（来自步骤5.2）加入6 cm培养皿中。调节LED光强。盖上培养皿盖，将其置于LED支架上，使LED位于培养皿中心。</li>
		<li>经过所需时间（通常为2天）后，使用智能手机相机直接对准光照处理位置拍摄培养皿图像。使用白色LED面板照射样品。使用相机的手动设置；避免光线反射；始终调整以确保相机镜头与样品之间的距离一致。确保曝光设置可获得适合后续使用ImageJ分析的图像。</li>
		<li>使用ImageJ软件量化丝状体中央圆圈的直径。
		<ol>
			<li>打开ImageJ，点击文件 | 打开，选择目标文件，点击回车。</li>
			<li>选择直线按钮（带直线图标）。按住鼠标左键，从培养皿一端画线至对侧，确保直线穿过丝状体圆圈的中心。</li>
			<li>按键盘上的Ctrl-K，或点击ImageJ菜单中的分析 | 绘制剖面图。查看显示像素强度随距离变化的x-y窗口——即培养皿的一维剖面图。确保最低像素强度略高于0，最高值低于255。</li>
			<li>估算圆圈外像素强度的平均值和圆圈内像素强度的平均值。在y轴上这两个值之间的位置，通过鼠标指向估算圆圈两侧的x值。记录这两个值并计算其差值。</li>
			<li>将鼠标指向右侧y轴位置，获取最大x值。记录该值e，其代表培养皿的直径。若该直径为5 cm，则计算中央丝状体圆圈的直径为d/e × 5 cm。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无任何利益冲突。

尽管许多蓝藻菌株可从培养保藏中心获得32,33,34,35,36，由于这些物种适应了特定的环境特性，因此对从野外分离新的蓝细菌仍存在需求。 P. lacuna 从岩池中采集，适应盐浓度和温度的变化30该物种的菌株于2008年、2009年和2010年的野外考察中被发现。通过本文所述方法，已分离出5株 P. lacuna 被分离出来，其中4株为无菌株。该菌株 P. lacuna HE10JO 被细菌永久污染 大西洋海杆菌，一种通过rRNA和基因组测序鉴定的海洋细菌。尽管采用了机械分离、不同温度下培养、抗生素处理或化学处理等多种方法，该细菌仍无法与蓝藻分离。尽管存在污染， P. lacuna</...

蓝细菌是利用光合作用作为能量来源的原核生物1,2。目前，越来越多的研究聚焦于蓝细菌物种。多种蓝细菌可通过DNA进行转化3，在这些物种中可实现基因敲除或过表达。然而，转化技术仅限于少数物种4,5,6,7,8,9,10,11，且在来自培养保藏或野外分离的菌株中建立转化体系可能较为困难8。丝状物种Phormidium lacuna的菌株（图1）分离自海洋潮池，在这些环境中，盐浓度或温度等条件会随时间波动。这类丝状蓝细菌可作为其所属的颤藻目（Oscillatoriales）的模式生物12。
在测试电穿孔法进行基因转移的实验中13,14&#160;，发现P. lacuna可通过自然转化实现转化15。在此过程中，某些细胞能够自然摄取外源DNA。与其他转化方法16,17相比，自然转化的优势在于无需额外工具，从而避免了操作流程的复杂化。例如，电穿孔需要使用合适的比色杯、完好的导线以及精确的电压选择。P. lacuna目前是唯一可进行自然转化的颤藻目成员。由于原始方案基于电穿孔流程，仍包含若干可能不必要的洗涤步骤。本研究测试了多种简化策略，最终形成了本文所呈现的转化方案。
基因组序列对于基于基因敲除或过表达的进一步分子研究至关重要。尽管利用下一代测序仪可在较短时间内获得基因组序列，但DNA的提取可能较为困难，且依赖于物种特性。针对P. lacuna，测试了多种提取方案，最终建立了一种改良的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法，该方法可获得纯度良好、产量稳定的DNA，满足实验室后续工作的需要。利用该方案已成功完成五个菌株的基因组测序。下一步的自然转化目标是建立P. lacuna中的蛋白表达体系。
本方案中用作标记蛋白的 sfGFP 可通过任何荧光显微镜进行检测。P. lacuna 中测试的所有启动子均可用于驱动 sfGFP 表达。随着转化获得的菌株数量不断增加，亟需建立一种菌种保藏方法。目前，该方法已广泛应用于大肠杆菌（Escherichia coli）及多种其他细菌18。标准方案通常制备甘油菌液，经液氮处理后于 -80 °C 保存。该方法步骤较少，对于已确立该方法的物种而言可靠性高。然而，标准方案不适用于 P. lacuna，因为在部分情况下无法复苏活细胞。但在解冻后去除甘油，所有试验中的细胞均得以存活。本文还提供了对 P. lacuna 运动性进行分析的简便方法，这些方法可与基因敲除诱变相结合，用于研究 IV 型菌毛或光感受蛋白的功能。这些检测方法不同于单细胞蓝细菌的检测方法19,20,21，也可为其他颤藻类群的研究提供参考。

<table><tbody><tr><td>Autoclave 3870 ELV</td><td>Tuttnauer</td><td>3870 ELV</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 琼脂</td><td>OttoNorwald</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>BG-11 淡水培养基溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3061</td><td></td></tr><tr><td>BG-11 培养基</td><td>默克</td><td>73816-250ML</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>默克</td><td>10043-35-3</td><td>H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Carl Roth</td><td>10035-04-8</td><td>CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 2 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>细胞培养瓶 Cellstar，带滤膜螺旋盖，无菌，250 mL</td><td>格赖纳</td><td>658190</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶 Cellstar，带滤膜螺旋盖，无菌，50 mL</td><td>Greiner</td><td>601975</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge LYNX 4000</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75006580</td><td>和转子</td></tr><tr><td>Centrifuge microstar 17</td><td>VWR International</td><td>N/A</td><td>最高可达 13,000 rpm</td></tr><tr><td>十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）</td><td>PanReac AppliChem</td><td>57-09-0</td><td>C&lt;sub&gt;19&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;42&lt;/sub&gt;BrN</td></tr><tr><td>氯仿 : 异戊醇 24 : 1</td><td>PanReac AppliChem</td><td>&lt;br/&gt; A1935</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化钴(II)</td><td>默克</td><td>7791-13-1</td><td>CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 6 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>五水合硫酸铜(II)</td><td>默克</td><td>7758-99-8</td><td>&amp;nbsp;CuSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;middot; 5 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>D(+)-生物素</td><td>卡尔·罗斯</td><td>58-85-5</td><td>&amp;nbsp;蓝细菌是基础研究和生物技术项目中的研究重点，这些项目利用太阳能进行生物质生产。Phormidium lacuna 是一种新近分离的丝状蓝细菌。本文描述了如何从海洋潮池中分离新的丝状蓝细菌，以及如何从丝状体中提取 DNA 并进行基因组测序。尽管许多单细胞蓝细菌已建立遗传转化方法，但丝状蓝细菌的转化报道较少。本文介绍了一种简化的方法，用于实现 P. lacuna 的自然转化。P. lacuna 是目前唯一建立自然转化体系的颤藻目（Oscillatoriales）成员。本文还展示了如何利用自然转化表达超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）。内源性 cpcB 启动子的表达强度约为 Synechocystis sp. PCC6803 中 cpc560、A2813 或 psbA2 启动子的 5 倍。此外，本文建立了 P. lacuna 和 Synechocystis sp. PCC6803 的冷冻保存方法，并描述了在液体培养基以及琼脂和塑料表面评估其运动能力的方法。&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;16&lt;/sub&gt;N2O&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;S</td></tr><tr><td>DNA标准分子量1 kb</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232</td><td></td></tr><tr><td>DNA分子量标准 100 bp</td><td>New England Biolabs</td><td>N3231</td><td></td></tr><tr><td>电动移液器助力 AccuJet®-Pro S</td><td>Brand GmbH</td><td>26360</td><td>用于移取 1–25 mL 液体</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td>C&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物</td><td>Carl Roth</td><td>6381-92-6</td><td>EDTA-Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 2 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>荧光显微镜 ApoTome</td><td>蔡司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜 Axio Imager 2</td><td>蔡司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>French压力细胞破碎仪</td><td>American Instrument Company</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统 Safe Image</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mupid-One/-exu 电泳系统</td><td>高级</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃器皿，不同类型</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>卡尔·罗斯</td><td>56-81-5</td><td>C&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>六水合三氯化铁</td><td>默克</td><td>10025-77-1</td><td>&amp;nbsp;FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; &amp;middot; 6 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>卡尔·罗斯</td><td>25389-94-0</td><td>C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;36&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt; &amp;middot; H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>月桂酰肌氨酸钠（Sarcosyl）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>137-16-6</td><td>聚球藻&lt;sub&gt;15&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;28&lt;/sub&gt;无&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; &amp;middot; Na</td></tr><tr><td>LB肉汤（Lennox）</td><td>卡尔·罗斯特</td><td>X964.4</td><td></td></tr><tr><td>光源，荧光灯管 L18W/954 日光</td><td>OSRAM</td><td></td><td>蓝藻培养</td></tr><tr><td>光源，LED 面板 XL 6500K 140 W</td><td>绽放之星</td><td>N/A</td><td>蓝细菌的培养，最高可达 1,000 &amp;micro;mol m&lt;sup&gt;-2&lt;/sup&gt; s&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Carl Roth</td><td>7791-18-6</td><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 6 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>四水合氯化锰(II)</td><td>塞尔瓦</td><td>13446-34-9</td><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 4 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>显微镜 DM750</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midi prep 质粒提取试剂盒 NucleoBond Xtra Midi 试剂盒</td><td>Macherey-NAGEL GmbH &amp;amp; Co. KG</td><td>REF740410.50</td><td></td></tr><tr><td>微型计算机 Raspberry Pi 4 +</td><td>Conrad Electronics</td><td>2138863-YD</td><td>用于延时记录</td></tr><tr><td>EC3 眼科相机</td><td>Leica</td><td></td><td>用于长达 30 秒的连续记录</td></tr><tr><td>Ocular camera MikrOkular 全高清</td><td>Bresser</td><td></td><td>用于延时记录，连接至树莓派微型计算机</td></tr><tr><td>培养皿 聚苯乙烯，100 mm × 20 mm</td><td>默克</td><td>P5606-400EA</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 聚苯乙烯，60 mm × 15 mm</td><td>默克</td><td>P5481-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000 分光光度计</td><td>Peqlab Biotechnologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光度计 Uvikon XS</td><td>Goebel Instrumentelle Analytik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetman 100-1,000 &amp;micro;L</td><td>Gilson</td><td>SKU: FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman 10-100 &amp;micro;L</td><td>Gilson</td><td>SKU: FA10004M</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 无菌塑料移液管</td><td>Greiner</td><td>607107</td><td></td></tr><tr><td>塑料管，无菌，15 mL</td><td>格赖纳</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>无菌塑料管，50 mL</td><td>格赖纳</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>溴化钾</td><td>Carl Roth</td><td>7758-02-3</td><td>KBr</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>卡尔·罗斯</td><td>7447-40-7</td><td>KCl</td></tr><tr><td>电源供应器 Statron 3252-1</td><td>Statron Ger&amp;auml;tetechnik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电源供应器 Voltcraft PPS 16005</td><td>Conrad Electronics</td><td></td><td>用于LED</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Promega</td><td>MC500C</td><td>来自 Maxwell 16 miRNA 组织试剂盒 AS1470</td></tr><tr><td>Q5聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>测序试剂盒 NextSeq 500/550 v2.5</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>测序系统 NextSeq 550 SY-415-1002</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker Unimax 2010</td><td>Heidolph Instruments</td><td></td><td>用于培养</td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>卡尔·罗斯</td><td>127-09-3</td><td>NaCH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;COO</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>卡尔·罗斯</td><td>7647-14-5</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>一水合二氢磷酸钠</td><td>Carl Roth</td><td>10049-21-5</td><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;middot; H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>氟化钠</td><td>Carl Roth</td><td>7681-49-4</td><td>NaF</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>卡尔·罗斯</td><td>144-55-8</td><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>二水合钼酸钠</td><td>塞尔瓦</td><td>10102-40-6</td><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;middot; 2 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>硝酸钠</td><td>默克</td><td>7631-99-4</td><td>NaNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>硫酸钠</td><td>卡尔·罗特</td><td>7757-82-6</td><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>六水合氯化锶</td><td>卡尔·罗特</td><td>10025-70-4</td><td>SrCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 6 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>盐酸硫胺</td><td>默克</td><td>67-03-8</td><td>聚球藻&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;17&lt;/sub&gt;ClN&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OS &amp;middot; HCl</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth</td><td>77-86-1</td><td>蓝细菌是基础研究和生物技术项目中的研究重点，这些项目利用太阳能进行生物质生产。Phormidium lacuna 是一种新分离的丝状蓝细菌。本文描述了如何从海洋潮池中分离新的丝状蓝细菌，以及如何从丝状体中提取DNA并进行基因组测序。尽管转化技术已在许多单细胞蓝细菌中建立，但在丝状蓝细菌中报道较少。本文介绍了一种简化的方法，用于实现 P. lacuna 的自然转化。P. lacuna 是目前唯一建立自然转化体系的颤藻目（Oscillatoriales）成员。本文还展示了如何利用自然转化表达超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）。实验表明，内源性 cpcB 启动子的表达强度约为 Synechocystis sp. PCC6803 中 cpc560、A2813 或 psbA2 启动子的5倍。此外，本文建立了 P. lacuna 和 Synechocystis sp. PCC6803 的冷冻保存方法，并描述了在液体培养基以及琼脂和塑料表面评估其运动能力的方法。&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;无&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>超声波设备UP100H配MS3探头</td><td>Hielscher 超声波技术</td><td>UP100H</td><td></td></tr><tr><td>Ultraturrax Silent Crusher M</td><td>Heidolph Instruments</td><td></td><td>匀浆器</td></tr><tr><td>尿素</td><td>卡尔·罗斯</td><td>57-13-6</td><td>CH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>维生素B&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>68-19-9</td><td>C&lt;sub&gt;63&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;88&lt;/sub&gt;CoN&lt;sub&gt;14&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;14&lt;/sub&gt;P</td></tr><tr><td>维生素溶液</td><td></td><td></td><td>0.3 &amp;micro;M 盐酸硫胺素，2.1 nM 生物素，0.37 nM 氰钴胺</td></tr><tr><td>蒸馏水器，水处理</td><td>威立雅水处理技术</td><td>ELGA_21001</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸锌</td><td>Sigma</td><td>7446-20-0</td><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;middot; 7 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件，URL&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于DNA组装的gatb-minia程序</td><td>https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline</td><td>基于 Linux，利用短 DNA 读长构建大型 scaffold</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>图像处理软件（像素强度、圆圈直径）</td><td></td></tr><tr><td>RAST 注释服务器</td><td>https://rast.nmpdr.org</td><td>输入：基因组DNA序列，检测开放阅读框，列出蛋白质序列及其功能</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>人工海水</td><td>0.41 M NaCl，53 mM MgCl&lt;sub&gt;2,&lt;/sub&gt;28 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，10 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; ，9 mM&amp;nbsp; KCl，2.4 mM NaHCO₃&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;，0.84 mM KBr，0.49 mM H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 90 &amp;micro;M SrCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 72 &amp;micro;M NaF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f/2 液体培养基</td><td>人工海水，0.1 %（v/v）微量元素溶液，0.05 %（v/v）维生素溶液，0.88 mM NaNO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 36 &amp;micro;M NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f/2&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 液体培养基</td><td>f/2培养基，其中NaNO₃浓度提高10倍&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 和 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; （0.88 mM NaNO₃）&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 36 &amp;micro;M NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f/2&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;-琼脂</td><td>3 %（w/v）细菌琼脂，人工海水，0.1 %（v/v）微量元素溶液，0.05 %（v/v）维生素溶液，8.8 mM NaNO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，0.36 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f/2-琼脂</td><td>3 %（w/v）细菌琼脂，人工海水，0.1 %（v/v）微量元素溶液，0.05 %（v/v）维生素溶液，0.88 mM NaNO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 36 &amp;micro;M NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量元素溶液</td><td>0.36 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 12 &amp;micro;M Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA，39 nM CuSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，26 nM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; ，77 nM ZnSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，42 nM CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 0.91 &amp;micro;M MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>维生素溶液</td><td>0.3 &amp;micro;M 硫胺素盐酸盐，2.1 nM 生物素，0.37 nM 氰钴胺</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

丝状蓝细菌phormidium lacuna的自然转化、蛋白表达与低温保存

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

蓝藻是基础研究和生物技术项目的重点，这些项目利用太阳能进行生物量生产。Phormidium lacuna 是一种新分离的丝状蓝藻。本文描述了如何从海洋潮池岩石中分离新的丝状蓝藻，以及如何从丝状体中提取DNA并进行基因组测序。尽管许多单细胞蓝藻物种的转化技术已建立，但丝状蓝藻的转化报道较少。本文介绍了一种简化的小 P. lacuna 天然转化方法。P. lacuna 是目前唯一已建立天然转化的颤藻目成员。本文还展示了如何利用天然转化表达超级折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）。内源的 cpcB 启动子诱导的表达强度比来自集胞藻 Synechocystis sp. PCC6803 的 cpc560、A2813 或 psbA2 启动子强约5倍。此外，本文建立了 P. lacuna 和集胞藻 Synechocystis sp. CPP 6803 的低温保存方法，并描述了在液体培养基以及琼脂和塑料表面评估其运动能力的方法。

按照上述方法，5 种不同菌株的 P. lacuna 从潮池中分离并进行测序（图1 和 表1）。除个别外，所有培养物在约1年传代培养后均保持无菌 P. lacuna HE10JO。该菌株仍被污染有 Marivirga atlantica，一种海洋细菌。在随后的赫尔戈兰岛考察中，从岩池中分离出其他丝状蓝细菌，这些蓝细菌不同于 P. lacuna 并且需要进行表征.
测试了多种DNA提取与纯化方法 P. lacuna最佳结果采用上述优化的CTAB方法获得，DNA得率为310 ± 50 µg/mL，OD260 nm/OD280 nm为1.7 ± 0.03，OD260 nm/OD230 nm为0.78 ± 0.04（n = 17）。基因组测序结果显示，所有菌株的DNA均存在轻微差异，符合预期（表1). 核心蛋白序列的最大差异为0.04%（表 2...

Phormidium lacuna 是一种从海洋潮池中分离得到的丝状蓝细菌。本文介绍了从自然环境中分离丝状体、DNA 提取、基因组测序、自然转化、sfGFP 表达、冷冻保存以及运动性检测方法。

丝状蓝细菌Phormidium lacuna的自然转化、蛋白表达与低温保存

蓝细菌是基础研究和生物技术项目的重点，这些项目利用太阳能进行生物量生产。Phormidium lacuna 是一种新分离的丝状蓝细菌。本文描述了如何从海洋潮池中分离新的丝状蓝细菌，以及如何从丝状体中提取DNA并进行基因组测序。尽管转化技术已在许多单细胞物种中建立，但在丝状蓝细菌中报道较少。本文介绍了一种简化的方法，用于实现 P. lacuna 的自然转化。P. lacuna 是目前唯一建立自然转化体系的颤藻目成员。本文还展示了如何利用自然转化表达超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）。内源性 cpcB 启动子的表达强度约为集胞藻 PCC6803 的 cpc560、A2813 或 psbA2 启动子的5倍。此外，建立了 P. lacuna 和集胞藻 PCC6803 的冷冻保存方法，并描述了在液体培养基以及琼脂和塑料表面评估其运动能力的方法。

本方案描述了如何通过自然转化对属于颤藻目（oscillatoriales）的丝状蓝细菌进行转化。同时展示了如何研究不同类型的运动方式。如果可行，自然转化是最简单的转化技术。仅需DNA、细胞和培养基。迄今为止，其他颤藻目成员均未能通过自然转化进行转化。我们希望本研究能够激励其他研究团队尝试其他颤藻种类。进行转化时，需制备生长良好且状态健康的菌液以及高质量的DNA。对于运动性研究，应始终使用经超声处理的菌液，且处理须为新鲜制备。演示该实验步骤的是我实验室的技术员 Nora Weber。首先，从正在培养的 P. lacuna 菌丝中取 1 毫升，分别接种到两个装有 50 毫升液体 F2 培养基的 250 毫升锥形瓶中。在 25 摄氏度下，于白光条件下振荡培养约五天。五天后，将 100 毫升 P. lacuna 细胞悬液在 10,000 转/分钟下均质化 3 分钟，并在 750 纳米处测定光密度。然后，在 6,000 × g 下离心细胞悬液 15 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 800 微升剩余液体及额外的 F2+ 培养基中。取八块含有 120 微克/毫升卡那霉素的 F2+ Bacto 琼脂平板，用移液器将 10 微克 DNA 加入每块琼脂平板中央。立即将100微升细胞悬液加到DNA上方。将无盖的琼脂平板置于超净工作台上，使多余液体蒸发。盖上平板，在25°C白光条件下培养两天。两天后，用接种环将每个琼脂平板上的丝状体分配到多个含 120 微克/毫升卡那霉素的新鲜 F2+Bacto 琼脂平板上。将平板置于 25 摄氏度的白光下培养，并定期在显微镜下检查培养物。14 至 28 天后，识别已死亡的棕褐色丝状体，并在显微镜下寻找转化后的丝状体。转化后的丝状体呈现健康绿色，与大量未转化的丝状体不同。将每根单独的转化丝状体转移至含有10毫升添加250微克/毫升卡那霉素的F2+培养基的50毫升锥形瓶中。在25摄氏度、白光条件下于摇床培养，并观察长达四周的生长情况。将丝状体转移回含有 250 微克/毫升卡那霉素的琼脂培养基中，等待丝状体生长。然后再次提高卡那霉素浓度以加速分离过程。对于 GFP 表达，使用荧光显微镜在 40X 或 63X 放大倍数下观察单根丝状体，并采集明场透射图像和荧光图像。在白色光下，将 P.lacuna 接种于 F2 培养基中，以 50 RPM 的水平振荡培养约五天，直至在 750 纳米处的估计光密度达到 0.35。将样品储存在 4 摄氏度。以最大功率和 1 的占空比，用超声波处理丝状体一分钟，使其均质化。在750纳米处测量光密度，并将含有P.lacuna的八毫升培养基转移至一个六厘米的培养皿中。等待数分钟，直至样品达到室温，然后用玻璃纸覆盖培养皿。将显微镜载玻片放置在配有相机的标准显微镜的X-Y载物台上。打开显微镜光源，将4X或10X物镜移入光路中。然后，将培养皿放置在载玻片上方。通过载物台的X、Y和Z方向移动，调整单根丝状体或丝状体束的位置。观察单根丝状体或丝状体束的运动，并使用标准显微镜相机记录其运动。确保物镜不接触液体。用移液器将0.5毫升含有P.lacuna的溶液滴加到六厘米培养皿的Bacto琼脂表面。让液体进入表面。约20分钟后，盖上培养皿，使用4倍或10倍物镜观察表面丝状体的运动。使用目镜相机和微型计算机系统采集延时录像。必须先通过肉眼对丝状体进行聚焦，然后通过目镜相机进行聚焦。确保后续图像之间的时间间隔为五秒至一分钟。对微型计算机的 Linux 脚本进行编程，以控制延时摄影的记录过程。准备LED支架，将5毫米LED安装在支架上，以便从下方到上方照射20毫米见方的区域。测量并调节LED的光照强度。确保整个装置置于暗室或封闭的暗盒中。将含有 P.lacuna 的八毫升培养基放入六厘米的培养皿中，盖上皿盖，并将其置于 LED 支架上，使 LED 位于培养皿的中心。通常两天后，使用智能手机摄像头直接对准光照处理位置拍摄培养皿的图像。使用支架并以白纸作为背景，以确保每次拍摄时距离和光照条件一致。打开 ImageJ 软件，点击文件，打开，然后选择文件。接着，点击回车。选择直线按钮，按住鼠标左键，从培养皿的一端画线至另一端。确保直线穿过丝状体圆圈的中心。点击“分析”和“测量”以查看培养皿的长度。然后，在 ImageJ 菜单中点击“分析”和“绘制轮廓”。估算圆外像素强度的平均值，以及圆内像素强度的另一个平均值。将鼠标指针置于这两个值之间的 Y 位置，以估算圆两侧的 X 值。记录这两个数值并计算其差值。然后选择直线工具，并在像素强度的半最大值处画一条线。最后，点击分析，然后点击测量，以获得内层细胞圆的长度。此处展示了P.lacuna与PAK1转化后插入片段的整合与分离。转化后约一周使用外侧引物进行 PCR 检测，电泳凝胶上通常出现两条条带，一条为野生型大小的条带，另一条迁移较慢的条带表明抗性盒的插入。此处，泳道 1 至 4 分别代表转化后第 7 天、第 11 天、第 14 天和第 17 天丝状体的 PCR 产物，泳道 5 代表野生型的 PCR 产物。在第 7 天的样本中，插入片段仅存在于少量染色体中。该比例持续增加至第17天，此时已无法观察到野生型条带，即分离已完全。此图像所示为在内源性藻蓝蛋白β启动子控制下表达sfGFP的pMH1载体。图中显示了P. lacuna的同源序列、pUC19载体骨架，以及包含sfGFP和卡那霉素抗性基因的插入片段。在 pMH1 中，sfGFP 基因位于藻蓝蛋白 β 基因的 3' 端；因此，其表达由内源性 cpc beta 启动子驱动。此处展示了 P. lacuna 野生型菌丝以及经 PAK1、PAK2、PAK3 和 pMH1 转化后的荧光图像。sfGFP 的表达由 cpc560 启动子、a2813 启动子、psbA2S 启动子或内源性 cpc beta 启动子驱动。此处展示的合并图像显示了席藻属拉昆亚种（Phormidium lacuna）的运动能力。图像展示了其在琼脂表面的移动情况，时间间隔为一分钟。此处展示了在液体培养基中的运动情况。时间间隔为10秒。自然转化是一种简单的方法。只需将质粒DNA与含有同源序列的抗性盒一起加入细胞中，然后让细胞在含抗生素的培养基上生长即可。基因可被失活，蛋白质可被过表达。这对于任何基础研究和生物技术研究都具有重要意义。在已建立自然转化的单细胞蓝藻中，已开展了关于光合作用或光感受器等分子研究。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

丝状蓝藻腔隙的自然转化、蛋白表达和低温保存

来源：Weber, N. et. al., 丝状蓝细菌Phormidium lacuna的自然转化、蛋白质表达与低温保存。J. Vis. Exp.

使用聚焦光照进行丝状蓝细菌趋光性实验

来源：Weber, N., 等，丝状蓝细菌Phormidium lacuna的自然转化、蛋白表达与低温保存。J. Vis. Exp.

丝状蓝细菌Phormidium lacuna中的自然转化与GFP表达

来源：Weber, N., 等，丝状蓝细菌Phormidium lacuna的自然转化、蛋白表达与低温保存。J. Vis. Exp. (2022)本视频演示了通过将丝状培养物匀浆以制备均匀悬浮液、在显微镜载玻片上准备培养皿检测装置以及观察丝状物运动，来评估Phormidium...

Phormidium lacuna 丝状体中的滑行运动

合成生物学可通过共翻译插入非经典氨基酸，实现具有前所未有特性的蛋白质的工程化。本文介绍了如何通过选择性压力整合（SPI）在E.

通过非天然氨基酸的选择性压力整合及质谱与荧光蛋白分析技术构建“金色”荧光蛋白

本方案描述了如何可视化蓝细菌中瞬时的DNA压缩过程。采用同步培养、荧光显微镜监测、快速冷冻以及高压冷冻电子断层扫描技术。本文介绍了这些方法的操作流程，并讨论了其未来的应用与发展方向。...

利用高压冷冻电镜断层扫描技术观察蓝细菌中的DNA压缩现象

本方案描述了利用冷冻电子显微镜测定离子通道结构的技术，包括用于在哺乳动物细胞中高效表达基因且操作简便、毒性最低的杆状病毒系统，蛋白质提取、纯化及质量检测，样品载网的制备与筛选，以及数据收集与处理。...

人源脂质敏感型阳离子通道TRPC3的表达与纯化及其通过单颗粒冷冻电镜进行结构解析

本文介绍了一种实验方案，用于：i）利用CyanoGate模块化克隆工具包构建一种可自我复制的载体；ii）通过接合转移将该载体导入蓝细菌宿主；以及iii）使用酶标仪或流式细胞术对转基因蓝细菌菌株进行表征分析。...

利用CyanoGate模块化克隆工具包通过接合进行蓝细菌的遗传改造

细菌细胞成像是一种新兴的系统生物学方法，旨在解析调控大型大分子机器功能的静态与动态过程。本文通过整合定量活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术，用于研究Legionella pneumophila...

应用活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析时空动态特征的 嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统

本方案描述了自下而上构建可合成RNA和蛋白质的人工细胞的方法、材料、设备及步骤。人工细胞的内部水相包含S30细菌裂解液，该裂解液通过水包油乳液转移法被封装于脂质双层（即稳定的脂质体）内。...

利用无细胞细菌提取物、脂质体和乳剂转移制备蛋白质合成型人工细胞

我们介绍一种简单且易于实现的方法，用于在XY平面上观察丝状蓝细菌。该方法采用低熔点琼脂糖基质，可实现对参与分裂过程的蛋白质进行垂直方向的成像。因此，该技术可适用于任何丝状生物体以及多种不同类型的蛋白质。...

丝状蓝细菌延时显微镜分析的垂直固定方法

学习丝状蓝藻Phormidium lacuna的自然转化方法，用于振荡藻目遗传学研究。本实验展示DNA转化、运动性观察及GFP表达技术，为蓝藻基因功能研究提供基础。

丝状蓝细菌Phormidium lacuna的自然转化、蛋白表达与低温保存

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