丝状蓝藻腔隙的自然转化、蛋白表达和低温保存
2022年2月1日
Phormidium lacuna 是一种从海洋岩石池中分离出来的丝状蓝藻。本文介绍了从天然来源中分离细丝，DNA提取，基因组测序，自然转化，sfGFP表达，冷冻保存和运动性方法。
该协议描述了属于振荡器的丝状蓝藻如何通过自然转化进行转化。它还展示了如何研究不同类型的运动。自然变换是最简单的变换技术，如果它有效的话。
只需要DNA，细胞和生长培养基。到目前为止，没有其他振荡器成员可以通过自然变换来转化。我们希望我们的研究能刺激其他小组尝试其他振荡器。
对于转化，要进行良好，健康的外观培养和良好的DNA制备。对于运动研究，始终使用超声处理培养物。治疗应新鲜。
演示该程序的将是来自我实验室的技术人员Nora Weber。首先将50毫升液体F2培养基接种到两个250毫升烧瓶中，每瓶来自运行培养物的一毫升P.lacuna细丝。在25摄氏度的激越下在白光下培养约五天。
五天后，以10， 000 RPM匀浆100毫升P.lacuna细胞悬浮液三分钟，并在750纳米处测量光密度。然后，以6， 000倍G离心细胞悬浮液15分钟，除去上清液并将沉淀悬浮在800微升剩余液体和额外的F2 +培养基中。取八个F2 + Bacto琼脂平板，每毫升含有120微克卡那霉素，并将10微克DNA移液到每个琼脂平板的中间。
立即移液100微升的细胞悬浮液在DNA的顶部。将琼脂板放在干净的工作台上，不要盖上盖子，以使多余的液体蒸发。关闭盘子，在25摄氏度的白光下培养两天。
两天后，将每个琼脂平板的细丝分配到几个新鲜的F2 + Bacto琼脂平板上，每毫升卡那霉素含有120微克，并带有接种环。在25摄氏度的白光下培养板，并在显微镜下定期检查培养物。14至28天后，识别死亡的褐色细丝，并在显微镜下寻找转化的细丝。
转化后的细丝看起来健康和绿色，与大部分细丝不同。将每个转化后的长丝转移到50毫升的烧瓶中，其中10毫升F2 +培养基，每毫升卡那霉素250微克。在25摄氏度的白光下摇床上培养，观察生长长达四周。
将细丝转移回含有每毫升卡那霉素250微克的琼脂培养基中，并等待细丝生长。然后，再次增加卡那霉素浓度以加速分离。对于GFP表达，用荧光显微镜以40X或63X放大倍率观察单丝，并捕获明场透射图像和荧光图像。
在50 RPM水平搅拌下在白光下在F2培养基中培养P.voida约五天，直到750纳米处的估计光密度变为0.35。将样品储存在四摄氏度。用超声波以最大功率和循环使细丝均质一分钟。
测量750纳米的光密度，并将含有P.lacuna的8毫升介质转移到六厘米的培养皿中。等待几分钟，直到样品达到室温，然后用玻璃纸箔覆盖培养皿。将显微镜载玻片放在带相机的标准显微镜的X-Y台上。
打开显微镜灯，将4X或10X物镜移动到光的路径中。然后，将培养皿放在幻灯片的顶部。通过工作台的 X、Y 和 Z 运动调整单细丝或灯丝束。
观察单丝或束的运动，并使用标准显微镜相机记录运动。确保物镜不接触液体。移液0.5毫升含有P.lacuna的溶液在六厘米培养皿的Bacto琼脂表面上。
让液体进入表面。大约20分钟后，关闭培养皿，并使用4X或10X物镜观察细丝在表面上的运动。使用目测摄像头和微型计算机系统捕捉延时记录。
细丝必须首先通过眼睛聚焦，然后通过眼部摄像头。确保后续图像之间的时间间隔为五秒到一分钟。对微型计算机的Linux脚本进行编程，以控制延时记录。
准备安装五毫米LED的LED支架，从下面到上方照射20毫米正方形的区域。测量和调整 LED 强度。确保整个设置位于黑暗的房间或封闭的黑暗容器中。
将八毫升含有P.lacuna的培养基放入六厘米的培养皿中，用盖子关闭培养皿，并将其放在LED支架上，以使LED位于培养皿的中心。通常在两天后，用智能手机摄像头直接瞄准光处理位置捕获培养皿的图像。使用支架和白色纸张作为背景，以确保每张照片的距离和光线条件相同。
打开ImageJ软件，单击"文件"，"打开"，然后选择文件。然后，单击 Enter。选择笔直按钮，然后按鼠标左键，从培养皿的一端到另一端画一条线。
确保线穿过细丝圆的中心。单击"分析和测量"以查看培养皿的长度。然后，单击"图像J"菜单中的"分析和绘制配置文件"。
估计圆圈外像素强度的平均值和圆圈内像素强度的另一个平均值。将鼠标指向这些值之间的 Y 位置，以估计圆两侧的 X 值。记下这两个值并计算差值。
然后选择直线按钮，并在像素强度的中间最大值处绘制一条线。最后，单击"分析"，然后单击"测量"以获取内细胞圆圈的长度。此处显示了P.lacuna与PAK1转化后插入物的整合和分离。
在转化后一周左右使用外部引物进行的PCR测试通常在电泳凝胶上有两条条带，一条具有野生型条带的大小，另一条较慢的迁移条带表明电阻盒的插入。此处，泳道 1 至 4 表示在分离耐药丝 7 天、11 天、14 天和 17 天后丝的 PCR 产物，泳道 5 表示野生型 PCR 产物。在七天的样品中，插入片段存在于染色体的一小部分中。
该分数增加至17天，其中没有野生型条带可见;也就是说，分离是完全的。该图像代表在内源性藻蓝蛋白β启动子控制下sfGHP表达的载体pMH1。此处显示了 P.lacuna 同源序列、pUC19 载体主链以及具有 sfGFP 和卡那霉素耐药性的插入片段。
在pMH1中，sfGHP基因被置于藻蓝蛋白β基因的三个素数中，因此由内源性cpcβ启动子驱动。此处显示了P.lacuna野生型细丝以及与PAK1，PAK2，PAK3和pMH1转化后的荧光图像。sfGFP的表达由cpc 560启动子，a2813启动子，psbA2S启动子或内源性cpcβ启动子驱动。
这里展示的合并图像显示了Phormidium lacuna的运动性。琼脂表面的运动如图所示。时间间隔为一分钟。
液体介质中的运动在这里介绍。时间间隔为 10 秒。自然变换是一种简单的方法。
只需将质粒DNA与具有同源序列的抗性盒与细胞混合，然后让细胞在含有抗生素的培养基上生长。基因可以被灭活，蛋白质可以被过度表达。这对于任何基础研究和生物技术研究都很重要。
在也建立了自然转化的单细胞蓝藻中，讨论了光合作用或光感受器等的分子研究。
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概述
本研究集中于丝状蓝藻Phormidium lacuna，它是从海洋岩石池中分离出来的。研究探讨了这种生物的自然转化方法和运动性分析，为振藻目内的遗传学研究进展做出了贡献。
关键研究组成部分
研究领域
- 自然转化技术
- 蓝藻运动性研究
- 基因组分析
背景
- 从海洋环境中分离
- 转化在遗传学研究中的重要性
- 对振藻目遗传学的知识有限
使用的方法
- DNA提取和基因组测序
- 蓝藻Phormidium lacuna
- 用于运动性观察的显微镜
主要结果
- 用特定方法成功地对P. lacuna进行了自然转化
- 在显微镜下识别转化的丝状体
- 对运动模式和生长条件的洞察
结论
- 该研究展示了一种成功的转化振藻目成员的方法。
- 这可能为蓝藻的进一步遗传操作和研究铺平道路。
常见问题
Executive Industry Relevance
Establishing natural transformation and protein expression in filamentous cyanobacteria like Phormidium lacuna enables direct genetic manipulation in a previously inaccessible order, supporting advanced functional genomics and synthetic biology. This capability enhances predictive confidence in target validation and accelerates the development of engineered strains for biotechnological applications. The method's reproducibility and scalability position it as a foundational tool for early discovery and translational research in photosynthetic microbial platforms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function through targeted gene inactivation and protein overexpression.
- Supports mechanistic de-risking by allowing precise genetic modifications in a filamentous cyanobacterial system.
- Facilitates functional target validation for metabolic engineering and pathway elucidation.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized workflow for generating and selecting genetically modified filaments using antibiotic resistance markers.
- Enables quantitative assessment of promoter strength via sfGFP expression under different regulatory elements.
- Supports reproducible preparation of engineered strains for downstream screening and phenotypic assays.
Translational & Preclinical Research
- Establishes a platform for studying motility and physiological responses relevant to environmental and industrial applications.
- Enables continuity from genetic modification to phenotypic analysis, supporting translational research in microbial biotechnology.
- Facilitates risk-adjusted advancement of engineered strains for further preclinical evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
This natural transformation protocol integrates into the discovery continuum from early genetic manipulation to functional screening and preclinical assessment of engineered cyanobacteria.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling targeted gene edits and protein expression studies.
- Screening: Delivers reproducible, selectable outputs for evaluating genetic constructs and promoter activity.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence and motility measurements for comparative analysis of engineered strains.
- Translational Research: Bridges genetic engineering with phenotypic validation, supporting biomarker and trait alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable transformation and expression platform for diverse cyanobacterial research and development projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in genetic and phenotypic outcomes for target validation.
- Operational Value: Standardizes transformation and selection processes for filamentous cyanobacteria.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for advancing engineered strains in the R&D pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of microbial platforms for biotechnological innovation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cyanobacterial cultivation, molecular cloning, and fluorescence microscopy.
- Needs access to standard microbiology and molecular biology instrumentation, including PCR and imaging systems.
- Demands cross-team standardization of transformation, selection, and phenotypic analysis protocols.
- Adaptation may be necessary for other filamentous or non-model cyanobacterial species.
- Transformation efficiency and promoter activity may vary depending on strain and construct design.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:05
Natural Transformation and GFP Expression
4:06
Motility of Phormidium lacuna
5:34
Assay for Movement on the Surface
6:27
Assay for Phototaxis
8:32
Results: Natural Transformation: Integration and Segregation of Insert, Vector for sfGFP, sfGFP Expression, and Motility Studies
11:01
Conclusion
