切片胚胎鸡听觉脑干以评估音调拓扑梯度与微环路

该方法可获取包含更宽频率区域梯度的鸡听觉脑干活体切片。这些切片适用于具有更长拓扑频率轴的电生理学和解剖学实验。该技术将有助于理解听觉脑干中微环路的发育过程。

尽管解剖结构特指鸡，但其他鸟类物种（如鹌鹑和鸣禽）具有相似的解剖结构。首先，用70%乙醇对鸡蛋进行消毒，并在38摄氏度和50%湿度条件下孵育。接下来，调节人工脑脊液（ACSF）的通气速率，使其pH值维持在7.2至7.4之间，渗透压保持在300至310毫渗摩尔/升。

然后将五克琼脂糖与100毫升脱氧人工脑脊液（dACSF）混合。使用水浴或微波炉彻底溶解琼脂糖，直至溶液开始冒泡。将融化的琼脂糖倒入培养皿中，厚度约为五毫米，并在室温下静置使其凝固。

凝固后，密封培养皿并置于 4°C 保存。在解剖时，将琼脂糖切成小立方块使用。首先，用 70% 乙醇清洁解剖区域。

将支撑用或倾斜的琼脂糖块粘附到振动切片机托盘上。将鸡蛋置于明亮光源下，找到鸡蛋较大端或较圆一侧的气室，然后在气室上方敲裂蛋壳，暴露膜囊。在膜囊上做一轻柔切口，以露出喙部。

用手术刀轻轻将颈部和头部从蛋中拉出。断头后，用预冷的 dACSF 清洗头部。在预冷的 dACSF 中固定头部，并进行头尾方向的切口。

从两眼后方中间开始切口，沿取材颈部的长度方向进行。分离皮肤以暴露颅骨。从眼后正中位置向侧方切割颅骨。

两侧半球均重复此操作。将刀片置于眼睛后方，快速切割，切下颅骨的前部。然后将头部浸入盛有冷ACSF的培养皿中。

使用小型剪刀，在颅骨尾侧区域进行从正中向侧方的切口，以分离脑组织而不造成损伤。轻柔地暴露脑干和小脑。将整个颅骨的背侧区域向外牵开。

用精细的画笔轻轻刷洗，去除脑干并暴露出来。使用弯头镊子清除脑干上的结缔组织和血管。剪断脑干与小脑之间的脑脚，并小心移除血管，以分离脑干与小脑。

修剪脑干上多余的血管。首先，将振动切片机的刀片沿水平轴放置。对于冠状切片，将脑干的头侧粘附在切片托盘上，使头尾轴保持垂直。

对于矢状切片，保持外侧-内侧轴垂直。对于水平切片，将腹侧朝下粘附，使背侧-腹侧轴保持垂直。为了获得精确角度的矢状-水平面，将脑干的腹侧粘附，使腹侧-背侧轴在斜面琼脂糖块的斜边上保持垂直。

将琼脂糖块的对侧表面粘附至切片托盘上，并保持头尾轴与刀片边缘平行。作为振动切片的替代方法，将分离的脑干浸入盛有4%低熔点琼脂糖的35 mm × 10 mm培养皿中，琼脂糖温度为40摄氏度。待琼脂糖凝固后，使用锋利的剃刀片切割成方块状的琼脂糖块。

将琼脂糖块的头侧粘附固定，使脑干的头尾轴保持垂直。连续切取冠状切片，直至观察到NM区域。使用锋利的刀片将琼脂糖块从胶上取下。

用细针将 0.5 µL 亚甲蓝染料轻轻滴加到 NM 上，以标记细胞核。将此组织块重新安装到切片托盘上，用于制备矢状面或水平面切片。根据染色区域确定细胞核位置，并对脑干进行切片。

切片后，将连续收集的200至300微米厚切片放入含有ACSF的切片孵育室中，在室温下平衡一小时。取自E19至E21鸡胚的脑干冠状切片代表了听觉脑干核团从最低到最高特征频率区域的相对等频率区。传入的听觉神经纤维及NM轴突的分支清晰可见。

还观察到角状核。在喙部切片中，上橄榄核位于冠状切片的腹外侧区域。在矢状切片中，当听觉神经纤维进入神经元簇时，可识别出NM以及核层状核（nucleus laminaris，NL）。

在头侧外侧区域识别出上橄榄核。沿头尾轴观察到丘脑下核（NM）和丘脑外侧核（NL）的低特征频率和高特征频率听觉区域。最内侧的切片显示了同侧和对侧的轴突簇以及听觉区域的终点。

在水平切片中，NM 和 NL 位于中线附近，神经元沿外侧-内侧轴分布。从水平面以锐角切割的脑干组织切片显示出听觉脑干核团呈大范围对角线分布。放大图像显示听觉核团的拓扑频率轴沿头侧内侧至尾侧外侧轴分布。

确保整个过程在持续用碳氧混合气体饱和的冰冻dACSF中进行。本方案适用于研究发育中脑干微环路的解剖学和生物物理特性，特别是主要听觉核团之间关系的研究人员。