蓝藻细胞外囊泡的分离和表征

该协议具有重要意义，因为它不仅展示了从不同规模的培养物中纯化囊泡的方法，权衡，方法之间的差异以及处理现场样品的考虑因素。蓝藻存在独特的囊泡采样和分析挑战。这些技术已经成功地从培养物和环境样品中分离和浓缩了囊泡。

要浓缩少于500毫升的样品，请首先用1型超纯水冲洗15至20毫升超滤离心浓缩器。将浓缩器装入离心机中，并在4摄氏度下以4， 400 x g 的速度旋转。放弃运行并重复该步骤至少两次。

将上清液样品装入水冲洗的浓缩器中，并在相同条件下旋转。重复此步骤，直到样品浓缩至15至30毫升的最终体积。要浓缩超过500毫升的体积，请通过设置手稿中描述的设备来执行切向流过滤。

将蠕动泵连接到进气管路，并在截留管路上放置可调节的夹具。按照手稿中所述对切向流过滤进行消毒，然后用一升1型超纯级水冲洗设备。将小于0.2微米的滤液加入样品储液槽中。

缓慢提高截留管路上的泵速和背压水平，以增加滤液管路的产量。继续运行切向流过滤，并在除去材料时用培养上清液重新填充储液槽。一旦储液槽中的体积达到保持流入进气管路所需的尽可能低的量，就停止浓缩样品，而不会引入气泡。

用夹具关闭流出线。消除截留管路上的背压。通过过滤器再循环浓缩的上清液10分钟，将再循环速率从每分钟20毫升降低到40毫升，以最大限度地提高回收率。

将截留管路移动到干净的容器中，从样品中取出进气管路并收集浓缩的材料。使用移液器回收样品储液槽中的任何剩余材料。通过0.2微米注射器过滤器过滤浓缩的上清液。

如果需要，将最终浓缩物在四摄氏度下储存约三周，然后再进行囊泡纯化。要沉淀浓缩的培养样品，请将其置于干净的超速离心管中，并加入干净的培养基或缓冲液以确保管被填充。离心后，用移液管除去上清液。

用新鲜培养基或洗涤缓冲液（例如1X磷酸盐缓冲盐水）重新洗涤沉淀的材料，并重复离心。用一毫升移液器轻柔移液，将最终沉淀重悬于新鲜培养物中，并将其转移到干净的容器中。为了进行密度梯度超速离心，如手稿中所述制备碘克沙醇储液。

将4X缓冲液的一部分与三份60%碘克沙醇储备液混合，制成45%碘克沙醇溶液。用1X缓冲液稀释45%碘克沙醇，以产生最终碘克沙醇浓度为40，35，30，25，20，15和10%的梯度介质的储备。然后，小心地将等量的所有这些碘克沙醇梯度储液覆盖到超速离心管中，利用整个管体积。

离心后，通过仔细移液或使用馏分收集器，收集0.5毫升的馏分，以获得约4.5毫升梯度。使用分析天平和校准的移液器确定每种馏分的密度，以克/毫升为单位。从试管中取出样品，确定重量并将样品放回试管中。

在新管中用干净的缓冲液稀释单个馏分，然后用干净的培养基或缓冲液洗涤。小心地涂抹五微升的囊泡，让它静置五分钟。通过将网格的边缘触摸到一块干净的滤纸上来取出样品。

将20至50微升的2%醋酸铀酰移出到由塑料薄膜覆盖的平坦表面上。然后将网格漂浮在其顶部两分钟。使用滤纸去除醋酸铀酰，并短暂漂浮在一滴超纯水上进行洗涤。

使用干净的注射器用超纯水填充腔室，并确保没有气泡。单击启动相机'，并可视化指纹周围腔室的最佳区域。将屏幕增益和相机级别滑块滑向最大值，然后降低到最低级别以查看最暗的粒子。

根据需要调整焦点，以确保颗粒在整个视野中大致相等，并继续用超干净的水洗涤，直到腔室清洁。使用一毫升注射器将囊泡样品添加到腔室中，并确认采集设置。从SOP下拉框中选择标准测量，并更改设置以收集至少三个技术重复，每个复制60秒的视频。

按"创建并运行脚本"并按照提示将大约100微升样品推入重复之间的腔室中。通过单击分析并确定颗粒参数，然后打开实验并加载样品文件。选择处理所选文件并等待分析完成。

从蓝藻Synechostis sp. PCC6803中分离和表征细胞外囊泡表明，外膜含有类胡萝卜素，其赋予通过超速离心直接造粒收集的囊泡样品特征性橙色着色。通过透射电子显微镜检查重悬的囊泡沉淀，方法是用乙酸铀酰对样品进行负染色或观察超薄切片。

使用动态光散射和纳米颗粒跟踪分析评估囊泡尺寸分布和浓度。在十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶上分离纯化的Synecycystis sp. PCC6803囊泡并染色为脂多糖。

应在浓缩囊泡样品之前和之后取样，以确保切向流过滤工作并且囊泡被浓缩。然后，您需要使用纳米颗粒跟踪分析来测量两个样品。今后需要努力将这种方法与其他方法（如尺寸排阻色谱或不对称场流分馏）合并，以改善从培养物和环境样品中区分和分离小颗粒的方法。

该技术有助于研究蓝藻囊泡以及这些囊泡在蓝藻生物学中的特定功能作用。