Name: 大鼠星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养及其在肌萎缩侧索硬化症研究中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 学习大鼠星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养方法，用于肌萎缩侧索硬化症研究中的钙信号成像分析。该技术可揭示神经炎症条件下细胞行为的详细生物物理特征。

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本工作得到塞尔维亚共和国教育部科学技术发展合同编号451-03-9/2021-14/200178、FENS-NENS教育与培训集群项目&#34;神经炎症中的胶质细胞三方课程&#34;以及欧盟“地平线2020”计划MSCA RISE资助号#778405的支持。我们感谢Marija Adžić和Mina Perić提供免疫组织化学图像，以及Danijela Bataveljić在论文撰写过程中提供的帮助。

所有实验均依照欧盟关于科学实验用途动物保护的指令，并经贝尔格莱德大学生物学院伦理委员会批准（批准编号 EK-BF-2016/08）后进行。关于患者样本（用于IgG检测的血清），其采集已获得患者知情同意，符合《世界医学协会伦理准则》（赫尔辛基宣言）中涉及人类实验的规定。该方案已获塞尔维亚临床中心伦理委员会批准（编号 850/6）。
1. 原代细胞培养的制备
<ol>
	<li>脑组织分离 
	注意：分离操作应在冰上进行，并使用预冷的溶液。
	<ol>
		<li>使用出生后1-3天的新生幼鼠进行原代新生儿细胞培养33。 
		注意：本研究所用的是Sprague Dawley hSOD1G93A 转基因大鼠和非转基因大鼠。用于基因分型时，取大鼠尾部组织用于后续DNA提取和PCR分析。</li>
		<li>用70%乙醇喷洒幼鼠头部，然后使用剪刀迅速剪断头部。</li>
		<li>使用小角度剪刀切开皮肤以暴露颅骨。从枕骨大孔（foramen magnum）向眼眶方向剪开颅骨，再做一条垂直于前切口的正中切口。取出脑组织并置于含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。 
		注意：在处理不同幼鼠之间需清洁工具，以防止转基因与非转基因幼鼠之间的交叉污染。大脑皮层与其他脑区的分离应在体视显微镜下完成。</li>
		<li>用镊子尖端撕开左右半球之间的连接组织，然后用弯头镊子轻轻从中心向侧方推动，将两个半球分开。</li>
		<li>用直头和弯头镊子小心撕除软脑膜。</li>
		<li>用弯头镊子夹取并移除海马体。海马体可丢弃或用于其他细胞培养制备。 
		注意：后续步骤应在超净工作台内进行，以确保无菌条件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织匀浆与细胞解离
	<ol>
		<li>将一个皮层组织转移至含有3 mL预冷PBS的15 mL离心管中。用1 mL枪头反复吹打10-15次，直至形成均匀的悬浮液。 
		注意：此过程中应特别注意避免产生气泡。</li>
		<li>在500 × g 条件下离心5分钟。弃去上清液，用移液枪将沉淀重悬于3 mL预冷PBS中，再次吹打混匀后重复离心步骤。 
		注意：自此步骤起所使用的所有溶液均应预热至37 °C。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀重悬于2 mL完全杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，该培养基含有10%胎牛血清（FBS）及抗生素（青霉素和链霉素）。将匀浆液转移至2 mL离心管中。</li>
		<li>将匀浆液依次通过21 G和23 G针头各三次，以获得单细胞悬液。 
		注意：此过程中应特别注意避免产生气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将一个皮层组织制备所得的细胞悬液加入到直径60 mm的培养皿或T25培养瓶中（培养表面经多肽包被处理，以促进贴壁细胞生长），其中含有3 mL完全DMEM培养基。轻轻晃动培养皿，使细胞悬液均匀分布。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、含5% CO2/95%空气的湿润化培养箱中培养。</li>
	<li>在分离后48小时更换培养基，并此后每3天更换一次培养基。</li>
	<li>为促进星形胶质细胞生长，当细胞融合度达到70%-80%时，用预热的PBS洗涤细胞，以去除松散贴附的胶质细胞及培养基中残留的FBS。
	<ol>
		<li>加入1 mL预热的胰蛋白酶溶液（0.25%胰蛋白酶，0.02% EDTA溶于PBS中，经无菌过滤）消化底层的星形胶质细胞。</li>
		<li>将培养皿置于37 °C培养箱中孵育2-5分钟。</li>
		<li>在显微镜下观察细胞，当细胞开始脱落时，加入4 mL完全DMEM培养基终止消化。</li>
		<li>收集细胞悬液并转移至15 mL离心管中，在500 × g 条件下离心5分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL完全培养基中，使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
		<li>以104 个细胞/cm2 的密度将细胞重新接种至5 mL新鲜完全DMEM培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每3天更换一次培养基。为减少其他类型胶质细胞的存在，在星形胶质细胞融合度达到50%后，每次更换培养基前均用完全DMEM洗涤细胞。
	<ol>
		<li>用1 mL移液枪头吸取上清液，并轻柔地将液体反复吹打至细胞层表面数次，确保整个细胞层表面均被覆盖。此洗涤步骤完成后，收集含有脱落细胞的液体并转移至15 mL离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当细胞融合度达到80%时（通常在14天左右），重复步骤1.6中所述的胰酶消化及星形胶质细胞收集过程。</li>
	<li>将5 × 103 个星形胶质细胞接种于经多聚-L-赖氨酸（50 µg/mL）包被的7 mm圆形玻璃盖玻片上。接种48小时后可用于实验。</li>
	<li>为促进小胶质细胞生长，在完成步骤1.7后，继续培养胶质细胞直至形成致密单层34。当小胶质细胞出现在星形胶质细胞层上方时（约10-15天后，其形态特征为体积较小、呈椭圆形且突起较短），将培养皿置于摇床上以220 rpm振荡2小时。</li>
	<li>小胶质细胞的分散与接种
	<ol>
		<li>用1 mL移液枪头吸取上清液，轻柔地反复吹打细胞层数次，以轻度洗涤已脱落和松散贴附的细胞。确保在整个洗涤过程中覆盖整个细胞层表面，收集含有脱落细胞的培养基并转移至15 mL离心管中。</li>
		<li>在500 × g 条件下离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL培养基中。</li>
		<li>将细胞悬液通过21 G针头吹打，以获得单细胞悬液。 
		注意：大多数已发表的方法使用胰蛋白酶或木瓜蛋白酶进行组织解离；然而，使用21 G针头可避免细胞过度消化，实现更温和的解离效果。</li>
		<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。将5 × 103 个小胶质细胞接种于经多聚-L-赖氨酸（50 µg/mL）包被的7 mm圆形玻璃盖玻片上。接种48小时后可用于实验。 
		&#8203;注意：通过振摇法难以获得完全纯化的小胶质细胞培养物，因为少突胶质前体细胞和星形胶质细胞仍可能以不同程度存在，具体比例取决于操作者的经验。用于评估胶质细胞培养物中不同细胞群比例的免疫细胞化学检测方法已在其他文献中描述35。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 免疫细胞化学
<ol>
	<li>用 PBS 清洗载玻片上的细胞，每次 1 分钟，共 2 次。</li>
	<li>在室温下用 4% 多聚甲醛固定细胞 20 分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在含有 10% 正常驴血清（NDS）/1% 牛血清白蛋白（BSA）/0.1% Triton X-100 的封闭液中孵育 45 分钟，室温。
	<ol>
		<li>每 10 mm 直径的载玻片加入 50 µL 封闭液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将一抗用含 1% NDS/1% BSA/0.1% TritonX-100 的溶液按以下比例稀释：小鼠抗 GFAP 抗体 1:300，山羊抗 Iba1 抗体 1:500。在 +4 °C 下与细胞共孵育过夜。</li>
	<li>用 PBS 冲洗 3 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>加入偶联荧光染料的二抗孵育：驴抗小鼠二抗（激发波长 488 nm [1:200]）或驴抗山羊二抗（激发波长 647 nm [1:200]）。室温避光孵育 2 小时。</li>
	<li>用 PBS 洗涤 7 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>用 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，1:4,000）在室温下孵育细胞 10 分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤 5 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>用封片液将载玻片封固在显微镜载片上；每张载玻片使用一滴封片液。 
	注意：抗体稀释比例可能因生产商不同而有所差异。使用者需根据自身实验条件确定最佳稀释比例。</li>
</ol>
3. 时间序列视频成像
注意：含有荧光染料的溶液应避免直接光照。在开始成像实验前，请确保开启灌流时玻璃盖玻片不会发生移动。
<ol>
	<li>溶液与细胞的准备
	<ol>
		<li>配制用于成像的细胞外液（ECS）：140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl2、2 mM MgCl2、10 mM D-葡萄糖和10 mM HEPES。调节pH至7.4。确保渗透压为280–300 mOsm/kg，并配制无Ca2+的ECS：140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM MgCl2、10 mM D-葡萄糖、10 mM HEPES和0.1 mM EGTA。</li>
		<li>配制测试溶液：将100 µM ATP溶于ECS中，1 µM Thg溶于无Ca2+的ECS中，以及0.1 mg/mL ALS IgG溶于ECS8中。</li>
		<li>将一片盖玻片转移至含有ECS的培养皿中，以洗去完全培养基DMEM。通过将1 mM Fluo-4 AM储备液用ECS稀释至终浓度为5 µM Fluo-4 AM，配制染料负载溶液。
		<ol>
			<li>将带有细胞的盖玻片置于染料负载溶液中，在室温避光条件下孵育30分钟，随后用ECS洗涤细胞20分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>如果细胞染料负载不足（即基础荧光水平过低—&#60;相机动态范围的5%，曝光时间大于400 ms），可将负载时间延长至37 °C下45分钟至1小时。或者，在用ECS稀释前，先将Fluo-4 AM储备液与等体积的20%（w/v）去垢剂（Pluronic）DMSO溶液混合，使最终Pluronic浓度约为0.02%。 
		注：本研究中的实验示例使用了先前所述方法从肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者血清中分离的人IgG4,5,11。每次实验均使用单个患者的IgG样本进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>视频成像 
	注：&#160;在本方案中，视频成像系统结合了氙短弧灯、多色仪系统以及配备水、甘油和油浸物镜的倒置落射荧光显微镜。时间序列成像使用数字相机系统完成。
	<ol>
		<li>在实验开始前15分钟开启成像装置各组件，使系统达到工作温度。</li>
		<li>将盖玻片放入记录室，加入1 mL工作溶液（ECS或无Ca2+的ECS）。</li>
		<li>为选择正确的成像程序，打开成像软件，在采集面板中选择适用于Fluo-4 AM的滤光片组合，其激发波长为480 nm，二向色镜为505 nm，发射波长为535 nm。</li>
		<li>选择视野时应注意在整个实验过程中保持细胞数量一致。适当调节曝光时间和探测器增益，确保信号不饱和。选择伪彩模式进行采集。更详细的说明请参考制造商提供的操作手册。</li>
		<li>将采样率调整为1 Hz（每秒1帧）。</li>
		<li>开始成像，采集3–5分钟的基础荧光水平以确定基线（F0）。确保工作溶液持续流动。</li>
		<li>停止工作溶液流动，切换至测试溶液并维持所需时间（参见图2和图3中的时间条）。每次使用测试溶液之间，用持续流动的工作溶液洗涤细胞3–5分钟。</li>
		<li>通过在溶液表面设置持续吸力，保持记录室内的溶液体积约为1 mL（见图2E）。 
		&#8203;注：为将处理直接施加于成像细胞，采用定制递送系统，该系统由玻璃移液管（内径0.8 mm）构成，放置于细胞上方约1 mm、距离约350 µm处，呈45°角，并与包含夹管阀和电子阀控制器的溶液交换系统联用（见图2E）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>定义一个与单个细胞相对应的兴趣区域（ROI）。
	<ol>
		<li>选择信号强度最高的帧（即施加ATP后的图像），使用多边形工具（Polygonal Tool）圈选一个细胞。对所获取视野中的所有细胞重复此操作。使用圆形工具（Circle Tool）在背景区域选择五个ROI。</li>
		<li>为测量每个时间帧中单个细胞及背景的平均信号强度，选中所有ROI，并在ImageJ的ROI管理器（ROI Manager）中使用多重复测量（Multi Measure）命令，或在商业软件中使用等效命令（参见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将ROI的平均信号强度值导出为电子表格。</li>
	<li>对五个背景ROI取平均值，并从同一时间点采集的帧中每个ROI的平均强度中减去该帧对应的平均背景值。</li>
	<li>为将获得的数据归一化至基线信号，使用公式（1）： 
	ΔF/F0 = (F - F0)/F0&#160; &#160;（1） 
	其中F为背景扣除后各时间帧的信号强度，F0为基线Fluo-4荧光强度。 
	注：本研究使用了自行编写的代码。</li>
	<li>为分析钙活动，需确定多个参数4：钙峰的幅度（ΔF/F0）、钙瞬变的积分变化（时间积分，响应记录下的曲线下面积）（ΔF/F0 × s）、达峰时间（从刺激开始到钙瞬变达到最大值的时间）（s）、上升时间（从刺激开始到ΔF/F0达到最大幅度50%-80%所需的时间）（s）、半峰宽（瞬变在半最大幅度处的全宽）（s）、若响应呈重复性，则计算其频率（Hz）。</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文介绍了一种快速且高效的原代细胞培养方法 &#34;在预算方面&#34; 研究细胞（病理）生理学不同方面的工具，例如大鼠hSOD1中的肌萎缩侧索硬化症（ALS）G93A 模型。因此，该技术适用于在单细胞水平上开展研究，并可将结果外推至更高组织层次（如组织切片或活体动物）进行进一步探究。然而，细胞培养作为一种技术手段也存在一些注意事项。最关键的是，脑组织的分离及细胞解离必须在冰上操作，并尽可能缩短从组织分离到后续制备各步骤的总时间。污染是始终存在的障碍，可通过使用充分灭菌的器械并在层流罩内谨慎操作组织解离步骤来有效避免。37接种细胞时，细胞密度的控制也至关重要。若接种的细胞数量低于所需密度，将无法支持细胞在培养皿中的生长与增殖；反之，若细胞密度过高，则细胞间会因争夺培养基中的营养物质而产生竞争，从而导致更多的细胞死亡。因此，在接种前对解离后的细胞进行计数是十分必要的，尤其是在尚未积累关于起始组织量与解离体积之间恰当比例的足够经验之前。
GFAP 是一种广泛使用的星形胶质细胞标志物，常用于评估细胞培养的纯度<sup...

细胞培养技术在健康与疾病状态下的细胞神经生理学多个领域推动了众多进展。特别是从实验动物的神经组织中新分离出的原代细胞培养，可使实验人员在不同的生化培养基和生理条件下深入研究多种细胞的行为。结合使用不同的荧光生理指示剂（如对Ca2+敏感的染料）和延时视频显微镜技术，能够实时更清晰地揭示细胞的生物物理和生化过程。
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种破坏性的神经退行性疾病，影响上运动神经元和下运动神经元1。该疾病在家族性类型中具有复杂的发病机制，但大多数为散发型（占病例的90%）2。已知非细胞自主性机制参与了ALS的病理生理过程，这主要归因于胶质细胞的重要作用3。ALS也被明确定义为一种神经炎症性疾病，涉及体液和细胞炎症因子的参与。
免疫球蛋白G（IgG）被广泛用作肌萎缩侧索硬化症（ALS）及其他神经退行性疾病的分子标志物。研究该标志物的血清水平可提示疾病中神经炎症的存在及阶段4,5,6，而其在脑脊液中的出现则可能提示血脑屏障的破坏7。此外，IgG还被发现在ALS患者脊髓运动神经元中形成沉积物7。然而，该方法在IgG水平与疾病阶段及特征之间的相关性方面仍显示出一定的不一致性6。
从肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者血清中分离的IgG（ALS IgG）可诱导正常星形胶质细胞产生钙反应8，并引起神经元释放谷氨酸，提示其具有兴奋毒性作用——这是ALS病理的典型特征9。然而，针对携带人类SOD1突变基因多拷贝的hSOD1G93A ALS大鼠模型的研究10表明，在培养的神经胶质细胞11、组织12,13,14或活体动物13中均存在多种氧化应激标志物。值得注意的是，与非转基因同窝对照动物来源的星形胶质细胞相比，源自ALS大鼠模型的星形胶质细胞在过氧化氢诱导下更易发生氧化应激11。
在培养条件下，ALS IgG 对小胶质细胞的影响不甚明显。具体而言，仅在施加11份ALS患者IgG样本中的4份后，BV-2小胶质细胞系才显示出氧化应激荧光标记物信号的升高15。众所周知，小胶质细胞参与多种神经炎症性疾病，在ALS的非细胞自主性机制中加剧氧化应激，并促进疾病晚期的进展16,17。然而，针对ALS IgG的研究数据表明，相较于星形胶质细胞，这些细胞对ALS炎症相关的体液因子反应性可能较低。已有多个研究利用ALS小鼠模型的原代星形胶质细胞开展实验，不仅取自幼鼠，也取自出现症状的动物，且分离部位既包括脑组织也包括脊髓18,19,20,21。对于原代培养的小胶质细胞而言，类似研究也已开展，但其研究程度不及星形胶质细胞，且多数来源于胚胎期的脑区组织22,23,24。
我们采用钙离子（Ca²⁺）的时间推移视频成像2+ 在培养细胞中，主要通过该方法追踪细胞内这种离子的瞬时变化，以此作为兴奋性毒性的生理标志物。因此，通过对这些瞬时变化的生物物理特征（如幅度、瞬时曲线下面积、上升时间、频率）进行表征，研究者可以从多种神经退行性疾病的细胞模型中获得实验性诊断参数。该技术因而为定量评估免疫球蛋白G（IgG）作为疾病生物标志物提供了优势。目前已有大量文献报道了IgG和Ca2+ 在ALS的诱导过程中，大多数研究是通过将患者IgG注射到实验动物体内来诱导ALS的25,26,27,28,29，随后显示出细胞内Ca2+ 升高及IgG沉积。一系列研究探讨了肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者IgG对运动突触的影响 体外30,31,32在上述背景下，本文介绍的技术将重点放在胶质细胞上，强调其在肌萎缩侧索硬化症非细胞自主性机制中的重要作用，并量化其对IgG作为神经炎症体液因子的潜在兴奋性毒性反应。该方法可进一步应用于其他体液因子（如全血清、脑脊液或细胞因子）在不同细胞培养系统及一般炎症细胞模型中的检测。
本文介绍了如何从 Sprague Dawley 大鼠的皮层中分离培养胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养物，并进一步利用这些细胞通过患者血清来源的 IgG 研究肌萎缩侧索硬化症（ALS）的病理生理机制。文中详细描述了细胞染料加载的实验方案（图1）以及在时间推移视频成像实验中记录 Ca2+ 动态变化的方法。视频记录示例将展示胶质细胞对 ALS IgG 的反应，并与三磷酸腺苷（ATP）的作用进行比较，后者可激活嘌呤能膜受体。本文首次展示了来自 hSOD1G93A ALS 大鼠脑组织的星形胶质细胞相较于非转基因对照组对 ALS IgG 产生更显著的 Ca2+ 反应，并阐述了该现象与 Ca2+ 储存机制差异之间的关联。此外，还展示了小胶质细胞在急性暴露于 ALS IgG 时的钙成像结果，其胞内钙反应较轻微。

<table><tbody><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Sarstedt, Germany</td><td>62 554 502</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 离心管</td><td>Sarstedt, Germany</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>21 G 针头</td><td>Nipro, Japan</td><td>HN-2138-ET</td><td></td></tr><tr><td>23 G 针头</td><td>Nipro, Japan</td><td>HN-2338-ET</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>Nipro, Japan</td><td>SY3-5SC-EC</td><td></td></tr><tr><td>6 mm 圆形玻璃盖玻片</td><td>Menzel Glasser, Germany</td><td>630-2113</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>ThermoFisher Scientific, USA</td><td>130181</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver A1</td><td>Carl Zeiss, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>B6917</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>2110</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>驴抗山羊 AlexaFluor 647 IgG 抗体</td><td>Invitrogen, USA</td><td>A-21447</td><td></td></tr><tr><td>驴抗小鼠 AlexaFluor 488 IgG 抗体</td><td>Invitrogen, USA</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>EDS-100G</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>&amp;rdquo;evolve&amp;rdquo;-EM 512 数字相机系统</td><td>Photometrics, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ 软件</td><td>在 GNU 通用公共许可证下的开源软件</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC 滤光片组</td><td>Chroma Technology Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Molecular Probes, USA</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗 Iba1 抗体</td><td>Fujifilm Wako Chemicals, USA</td><td>011-27991</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biowest, France</td><td>P5455</td><td></td></tr><tr><td>高速溶液交换系统</td><td>ALA Scientific Instruments, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Memmert GmbH + Co. KG, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Matlab 软件</td><td>Math Works, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 GFAP 抗体</td><td>Merck Millipore, USA</td><td>MAB360</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 40-88</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>324590</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>青霉素和链霉素</td><td>ThermoFisher Scientific, USA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>多聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Carlo Erba Reagents, Spain</td><td>471686</td><td></td></tr><tr><td>DELFIA PlateShake 摇床</td><td>PerkinElmer Life Sciences, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>七水合磷酸氢二钠</td><td>Carl ROTH GmbH</td><td>X987.2</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>毒胡萝卜素</td><td>Tocris Bioscience, UK</td><td>1138</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>Vapro 蒸气压渗透压计 5520</td><td>Wescor, ELITechGroup Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiFluor 成像系统</td><td>Visitron System Gmbh, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VisiChrome 多色仪系统</td><td>Visitron System Gmbh, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VisiView 高性能配置</td><td>Visitron System Gmbh, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氙短弧灯</td><td>Ushio, Japan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

大鼠星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养及其在肌萎缩侧索硬化研究中的应用

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

本方案演示了如何从 Sprague Dawley 大鼠的大脑皮层中分离培养原代胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞，并利用这些细胞研究大鼠 hSOD1G93A 模型中肌萎缩侧索硬化症（ALS）的病理生理机制。首先，本方案展示了如何从新生大鼠大脑皮层中分离并培养星形胶质细胞和小胶质细胞，随后通过免疫细胞化学方法，利用星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和小胶质细胞标志物离子化钙结合接头分子1（Iba1）对培养细胞进行鉴定和纯度检测。在下一阶段，介绍了对培养细胞进行染料负载（使用钙敏感性染料 Fluo 4-AM）的方法，以及在活细胞上通过视频成像实验记录 Ca2+ 变化的技术。
视频记录示例包括：（1）Ca2+ 对培养的星形胶质细胞急性暴露于自肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者分离的免疫球蛋白G（IgG）进行成像，结果显示其产生特征性且特异性的反应，与同一实验中三磷酸腺苷（ATP）诱导的反应相比具有明显差异。示例还显示，在表达人源突变SOD1（hSOD1）的细胞中，ALS IgG诱发的细胞内钙离子浓度瞬时升高更为显著。G93A 星形胶质细胞与非转基因对照组相比；（2）Ca2+ 使用毒胡萝卜素（Thg）耗竭钙库过程中对培养星形胶质细胞进行成像，Thg 是内质网 Ca²⁺-ATP 酶的非竞争性抑制剂2+ ATP酶，随后通过在记录液中添加钙以诱导促发的钙库操纵性钙内流，表明了Ca之间的差异2+ hSOD1中的储存操作G93A 以及在非转基因星形胶质细胞中；（3）Ca2+ 培养的小胶质细胞成像显示，其对ALS IgG主要无反应，而ATP刺激则引起Ca2+ 变化。本文还强调了关于细胞密度和培养纯度的关键注意事项，以及选择正确浓度的 Ca2+ 染料及染料负载技术

培养物中不同类型胶质细胞的鉴定 
通常需要 15–21 天培养星形胶质细胞用于实验，而小胶质细胞的生长需要 10–15 天。通过免疫染色评估培养物的细胞纯度。图 1 显示了在各自的培养物中星形胶质细胞标志物 GFAP 与小胶质细胞标志物 Iba1 的双标表达情况。
钙成像技术可用于揭示健康星形胶质细胞与病变星形胶质细胞在细胞生理学上的差异。此前在野生型星形胶质细胞中，我们已证明肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者的IgG可通过动员胞内和胞外钙库，使细胞质中Ca2+浓度升高8。本实验方案旨在确定在急性暴露于ALS患者IgG样本后，hSOD1G93A转基因与非转基因培养星形胶质细胞之间的钙瞬变是否存在差异。实验中，将负载Fluo4-AM的星形胶质细胞用ECS灌流3分钟，以获得稳定的基线信号；随后，在浴液中加入100 µg/mL的ALS IgG，持续5分钟；接着用ECS冲洗细胞，最后在每次记录结束时加入1...

本文介绍了一种从大鼠大脑皮层分离胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞以建立原代培养的实验方案，用于在hSOD1G93A大鼠模型中研究肌萎缩侧索硬化症病理生理机制时，进行细胞内Ca2+动态变化的延时视频成像。

本方案演示了如何从 Sprague Dawley 大鼠大脑皮层制备胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养物，以及如何……

本方案可用于揭示每种细胞类型在健康和疾病状态下的特征性细胞间钙信号传导模式。该技术可对复杂细胞行为进行快速而详细的生物物理表征。我们计划将这种IgG诱导的钙信号传导作为神经炎症性疾病个体化治疗的指纹标志。在真实生活环境中，观察和跟踪所有过程与事件并不容易，尤其是显微镜下发生的过程。因此，视觉数据非常重要。使用小型弯头剪刀切开皮肤，暴露出生后一至三天幼鼠的颅骨，然后将其头部切除。然后从枕骨大孔向眼眶方向剪开颅骨，并做一条垂直的正中切口。将脑组织从颅骨中取出，放入含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。用镊子尖端撕开两侧半球之间的连接，并用弯头镊子轻轻将一侧半球从中心向侧面推动，以分离脑半球。使用直头镊子和弯头镊子小心撕除脑膜。然后用弯头镊子夹取海马并移除，弃去或用于其他细胞培养制备。接着，将皮层组织转移至含有 3 毫升冷 PBS 的 15 毫升离心管中，用 1 毫升枪头反复吹打 10 至 15 次，充分匀浆组织。将细胞在500 ×g下离心5分钟。弃去上清液，并用1毫升枪头加入3毫升冷的PBS重悬沉淀。再次离心后，将沉淀重悬于2毫升含10% FBS和抗生素的完全DMEM培养基中。将匀浆转移至一个2毫升离心管后，用21号和23号针头反复吹打匀浆，以获得单细胞悬液。将一个皮质组织制备的细胞悬液倒入含有3毫升完全DMEM培养基的60毫米培养皿中，并轻轻晃动培养皿，使悬液均匀分布。将细胞置于37 °C、含5%二氧化碳和95%空气的湿润化培养箱中孵育。为促进星形胶质细胞生长，当细胞融合度达到70%至80%时，移除旧的培养基，并用预热的PBS洗涤细胞，以去除松散贴附的胶质细胞及残留的胎牛血清（FBS）。随后，加入1 mL预热的胰蛋白酶溶液，对底层的星形胶质细胞进行消化，在37°C孵育2至5分钟。使用显微镜观察细胞是否开始脱落，然后加入4 mL完全DMEM培养基。收集细胞悬液，转移至15毫升离心管中。在500 ×g条件下离心5分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于1毫升完全培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。接着，准备培养皿并加入培养基。以每平方厘米10的4次方个细胞的密度，将细胞重新接种于5毫升新鲜的完全DMEM培养基中，并在每次更换培养基前，用完全DMEM培养基洗涤细胞。当细胞融合度达到70%至80%时，重复进行胰蛋白酶消化，并将5×10³个星形胶质细胞接种到直径为7毫米的多聚-L-赖氨酸包被的圆形玻璃盖玻片上。让细胞贴壁10分钟，然后加入完全DMEM培养基。接种48小时后可用于实验。制备小胶质细胞培养物后，为促进小胶质细胞生长，需让胶质细胞生长至融合状态，10至15天后小胶质细胞将出现在星形胶质细胞层上方。将培养皿置于摇床上，以220 RPM的转速振荡两小时。随后，用1毫升移液器吸头轻轻吸除上清液，以洗涤已脱落和松散附着的细胞。轻轻将上清液多次滴加到细胞层上，确保在此洗涤步骤中覆盖整个细胞层表面。收集含有脱落细胞的培养基，并转移至15毫升离心管中。离心、重悬并计数细胞，操作方法同前文所示。将5 × 10³个小胶质细胞接种到直径为7毫米的多聚-L-赖氨酸包被的圆形玻璃盖玻片上。静置10分钟使其贴壁，然后加入完全DMEM培养基。接种48小时后用于实验。为了彻底洗去DMEM，将一张盖玻片转移至含有细胞外溶液的培养皿中。通过将1毫摩尔的Fluo-4 AM用细胞外溶液稀释，配制染料负载溶液，使其终浓度为5微摩尔。将带有细胞的盖玻片置于染料负载溶液中，在室温避光条件下孵育30分钟，随后用细胞外溶液洗涤细胞20分钟。将盖玻片放入记录室中，并加入一毫升工作液。选择在整个实验过程中细胞数量保持稳定的视野。开始成像，并通过采集三到五分钟的基础荧光水平来确定基线。然后停止工作液的灌流，切换至测试液并维持所需的时间。每次更换测试液之间，用工作液持续灌流清洗细胞3到5分钟。通过从液面上方施加持续的负压吸引，保持记录室内的溶液体积为1毫升。选择信号强度最高的帧，使用多边形工具圈选一个细胞。在已获取的视野中圈选完所有细胞后，使用圆形工具在背景区域选择五个感兴趣区域。然后测量每个时间点单个细胞及背景的平均信号强度。选择所有感兴趣区域，使用 ImageJ 中 ROI Manager 的多测量（Multi-Measure）命令，或使用商业软件中的等效命令。将数据导入 MATLAB 软件后，对五个背景感兴趣区域取平均值，并从同步采集的各帧的平均感兴趣区域强度中减去该平均背景值。随后，通过确定钙峰的幅度、钙瞬变的积分变化、达峰时间、上升时间、半峰宽及频率，分析钙活动。GFAP用于标记星形胶质细胞，Iba1用于标记小胶质细胞。与非转基因星形胶质细胞相比，hSOD1G93A星形胶质细胞对肌萎缩侧索硬化症免疫球蛋白G（ALS immunoglobulin G）的钙瞬变反应幅度更大，总体积分变化更显著，达峰时间更短。该反应可与对ATP的反应相区分。通过钙库耗竭实验发现，hSOD1G93A 星形胶质细胞的钙库中钙离子水平更高，表明该离子存在过载。培养小胶质细胞后，随时间提取其平均荧光强度。三个细胞的钙信号轨迹显示，仅有一个细胞对肌萎缩侧索硬化症免疫球蛋白 G 产生反应，而所有细胞均对三磷酸腺苷产生反应。伪彩色图像表示细胞对ALS、IgG和ATP反应的荧光强度和基线水平。细胞需要充分负载，且成像系统的参数需适当调整，以确保实验过程中信号不发生分离。此外，可结合钙信号发射进行膜片钳记录。因此，可以更全面地了解不同膜离子电流与钙释放之间的相关性。理解细胞内钙稳态对于探索细胞对自然刺激以及应激性和外界刺激的多种反应具有重要意义。

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大鼠星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养及其在肌萎缩侧索硬化症研究中的应用

本文提供了一种在胶质细胞饲养层存在下培养大鼠皮层神经元的实验方案。培养的神经元可建立极性并形成突触，且可将神经元与胶质细胞分离，用于多种实验应用，如电生理学、钙成像、细胞存活率检测、免疫细胞化学以及RNA/DNA/蛋白质提取。...

原代大鼠皮层神经元与胶质细胞的双层共培养

从大脑复杂的细胞异质性中分离原代小胶质细胞，对于研究其在生理和病理条件下的作用至关重要。本方案描述了一种机械分离与混合细胞培养技术，可获得高产量、高纯度且具有活性的原代小胶质细胞 体外...

从新生大鼠脑组织的混合胶质细胞培养物中分离原代小胶质细胞

该视频展示了一种从大鼠皮层培养原代星形胶质细胞的技术。通过机械分离法将皮层组织解离，获得均一的胶质细胞悬液，随后将其接种于多肽包被的培养板上，以促进星形胶质细胞的选择性增殖。随后，利用酶消化法将星形胶质细胞从培养板上解离，并转移至新鲜培养基中，从而实现纯星形胶质细胞的培养。...

从幼鼠脑组织制备星形胶质细胞原代培养

本视频展示了一种从大鼠脑组织中分离和培养小胶质细胞的方法。该方法通过使用包被有特异性识别小胶质细胞的单克隆抗体的培养板，将小胶质细胞与其他神经元及非神经元细胞分离开来。...

从大鼠脑组织中分离和培养小胶质细胞的无血清培养基方法

星形胶质细胞已被确认为多功能细胞，参与多种基本生物学过程，在正常脑发育、功能维持及中枢神经系统修复中发挥重要作用。本文介绍一种快速获取纯化小鼠星形胶质细胞培养物的实验流程，用于研究这类主要中枢神经系统细胞的生物学特性。...

小鼠皮层星形胶质细胞的分离与培养

表型正常的星形胶质细胞和神经干细胞取自携带floxed条件性致癌等位基因的基因工程小鼠，通过病毒介导的Cre重组进行转化，可用于建立星形细胞瘤发病机制的模型 体外 和 体内...

星形细胞瘤发病机制建模 体外 和 体内 利用条件性基因工程小鼠的皮层星形胶质细胞或神经干细胞

神经病理性疼痛的发生涉及脊髓胶质细胞的病理性改变。一种源自成年脊髓组织并用于研究这些细胞的可靠胶质细胞培养体系 体外...

成年小鼠脊髓组织原代混合胶质细胞培养物的制备

此处描述的AWESAM方案是快速、简便且经济地从其他脑细胞中分离培养小鼠星形胶质细胞的最佳方法。AWESAM星形胶质细胞表现出自发性Ca2+ 与星形胶质细胞相似的信号传导、形态及基因表达谱 体内.

培养 在体 内使用快速、简单且经济的AWESAM方案培养类小鼠星形胶质细胞

深入了解小胶质细胞功能的努力因缺乏能够模拟成熟小胶质细胞特性的培养模型而受到阻碍 体内...

分离与培养啮齿类动物小胶质细胞以在无血清培养基中促进动态分支状形态

我们描述了一种用于诱导人源多能干细胞分化为脊髓星形胶质细胞和神经元，并将其共培养以进行电生理记录的方法。...

建立用于模拟肌萎缩侧索硬化症的电生理平台：采用区域特异性人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元

本方案概述了从成年小鼠脊髓中分离纯化星形胶质细胞和小胶质细胞的方法，可用于后续的RNA分析和细胞培养等应用。方案包括详细的细胞解离方法及操作步骤，旨在提高分离细胞的质量和得率。...

从成年小鼠脊髓中分离纯化的星形胶质细胞和小胶质细胞 体外 检测与转录组学研究

学习大鼠星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养方法，用于肌萎缩侧索硬化症研究中的钙信号成像分析。该技术可揭示神经炎症条件下细胞行为的详细生物物理特征。

大鼠星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养及其在肌萎缩侧索硬化研究中的应用

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