Name: 基于半导体的下一代测序平台上非整倍体的植入前基因检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 了解基于半导体测序平台的胚胎植入前非整倍体基因检测完整流程，涵盖单细胞全基因组扩增、文库构建及测序分析。该方法为生殖医学诊断实验室提供可复制的标准化操作方案。

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我们感谢张勇明博士和侯荣基先生对实验室信息管理系统（LIMS）扩展应用提出的建议。本研究由中国人民解放军计划生育专项研究项目（17JS008，20JSZ08）、广西代谢性疾病研究重点实验室基金（编号：20-065-76）以及广州市市民健康科技研究项目（201803010034）资助。

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作者无任何利益冲突需要披露。

胚胎染色体非整倍性是自然受孕或辅助生殖技术受孕中导致大量妊娠丢失的原因 体外 受精（IVF）。在IVF的临床实践中，建议通过筛查胚胎非整倍体并移植整倍体胚胎以提高IVF的结局。荧光 原位 杂交是最早用于性别选择和胚胎植入前遗传学检测-非整倍体（PGT-A）的技术；然而，该技术对实验室人员的技术水平要求较高，且相对费时费力。近年来，采用荧光检测的PGT-A研究日益增多 原位 杂交技术显示对活产率无改善17,18.
然而，随着技术的快速发展，植入前遗传学检测中的拷贝数分析已取得显著进展；不同方法各有优缺点。新开发的综合性分子技术，如定量荧光PCR、单核苷酸多态性（SNP）芯片、微阵列比较基因组杂交（aCGH）以及下一代测序，在改善体外受精（IVF）结局方面展现出良好前景7。在这些技术中，尽管下一代测序（NGS）具有可扩展性强、通量更高、更易于自动化以及进一步降低成本的潜...

非整倍体是指染色体数目异常，表现为多出一条或数条染色体，或缺失一条或数条染色体。携带某种类型非整倍体的胚胎可能存活至出生并伴有出生缺陷，例如缺失一条X染色体（特纳综合征）、常染色体额外拷贝，如21号常染色体三体（唐氏综合征）、13号常染色体三体（帕陶综合征）和18号常染色体三体（爱德华氏综合征），或性染色体额外拷贝，如47, XXY（克兰费尔特综合征）和47, XXX（三X综合征）。1非整倍体是导致孕早期流产的主要原因 体外 体外受精（IVF）失败2据报道，在试管婴儿技术中，自然周期和药物控制组的不同年龄层中，非整倍体率可能在25.4%至84.5%之间。3.
下一代测序技术正被广泛应用于临床遗传信息的检测；该技术高效、高通量，为基因组序列的获取提供了切实可行的途径。特别是，下一代测序技术还彻底改变了具有遗传因素疾病的诊断方式，并实现了对基因组异常的检测4采用半导体测序技术，将测序生物反应中的化学信号直接转化为数字数据，基于半导体的测序系统可在3–7小时内实现对序列数据的直接、实时检测5,6.
在体外受精（IVF）过程中，胚胎植入前遗传学检测（PGT）可在胚胎移植入子宫前分析其遗传特征，以提高IVF成功率并降低新生儿遗传性疾病的风险1,7。在结合高通量测序（NGS）技术的PGT中，从少于10个细胞中提取的遗传物质使用全基因组扩增试剂盒或自行研发的全基因组扩增试剂进行扩增。该过程在扩增阶段仅需一步反应，无需预扩增，即可获得全基因组扩增产物。随后在构建的文库中设计并应用针对拷贝数变异及特定基因位点测序的引物或探针 panel。
在下一代测序（NGS）中，胚胎植入前遗传学检测-非整倍体（PGT-A）的典型工作流程涉及一系列连续步骤，需要实验室人员投入大量工作量8。某些操作失误导致的流程回退可能会造成实验室时间和资源的不必要损失。制定简洁明了的标准操作程序（SOP）对PGS-NGS工作流程具有帮助作用；然而，纯文字格式的方案无法充分展示样本处理、设备操作及仪器设置等方面的详细信息，而这些内容可通过视频方案直观呈现。本文所述经验证的工作流程结合操作细节的可视化演示，可为基于半导体测序平台的PGT实践提供更直接、更直观的参考方案。
本方案描述了一种可同时批量处理多达16个胚胎活检样本的方法。对于更大规模的批次，建议使用基于商用试剂盒的半导体测序方案，例如 Reproes-PGS。

<table><tbody><tr><td>0.45 &amp;mu;m 注射器滤器单元</td><td>Merkmillipore</td><td>Millex-HV</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL DNA LoBind 管</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL DNA LoBind 管</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>5x Anstart Taq 缓冲液（含 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;）</td><td>FAPON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Anstart Tap DNA 聚合酶</td><td>FAPON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP 试剂（用于 DNA 结合的磁珠）</td><td>Beckman</td><td>A63881</td><td>https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881</td></tr><tr><td>细胞裂解缓冲液</td><td>南方医科大学</td><td></td><td>含有 40 mM Tris（pH 8）、100 mM NaCl、2 mM EDTA、1 mM 乙二醇四乙酸（EGTA）、1%（v/v）Triton X-100、5 mM 焦磷酸钠、2 mM &amp;beta;-甘油磷酸钠、0.1% SDS 的细胞裂解缓冲液</td></tr><tr><td>ClinVar</td><td>NCBI</td><td></td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/</td></tr><tr><td>DNA 洗脱缓冲液</td><td>NEB</td><td>T1016L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Vazyme</td><td>P031-AA</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁力架</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>广州化学试剂厂 Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>http://www.chemicalreagent.com/</td></tr><tr><td>自主开发的全基因组扩增试剂</td><td>南方医科大学</td><td></td><td>试剂包含以下组分：&lt;br/&gt; 1. 细胞裂解&lt;br/&gt; 2. 扩增预混液&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1) 引物 WGA-P2（10 &amp;mu;M）&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 2) dNTP（10 mM）&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 3) 5x Anstart Taq 缓冲液（含 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;）&lt;br/&gt; 3. 扩增酶&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1) Anstart Tap DNA 聚合酶（5 U/&amp;mu;L）</td></tr><tr><td>Ion PI Hi-Q OT2 200 试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A26434</td><td>步骤 4.2.8 中提到的试剂盒</td></tr><tr><td>Ion PI Hi-Q 测序 200 试剂盒&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A26433</td><td></td></tr><tr><td>Ion Proton 系统</td><td>Life Technologies</td><td>4476610</td><td></td></tr><tr><td>Ion Reporter 服务器系统</td><td>Life Technologies</td><td>4487118</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>广州化学试剂厂</td><td></td><td>http://www.chemicalreagent.com/</td></tr><tr><td>文库制备试剂盒</td><td>达安基因有限公司</td><td>114</td><td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-1KG</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Life Technologies</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>引物 Oligo WGA-P2</td><td>生工生物</td><td></td><td>5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN&lt;br/&gt; NNNNATGTGG-3'</td></tr><tr><td>OneTouch 2 系统</td><td>Life Technologies</td><td>4474779</td><td>&amp;nbsp;模板扩增与富集系统</td></tr><tr><td>PCR 管</td><td>Axygen</td><td>PCR-02D-C</td><td></td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 试剂盒</td><td>Takara Bio USA</td><td>R300671</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Quality Scientific Products</td><td></td><td>https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx</td></tr><tr><td>便携式迷你离心机 LX-300</td><td>麒麟比尔</td><td>E0122</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 荧光计</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td>荧光计</td></tr><tr><td>Qubit 检测管</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>测序仪服务器系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Torrent Suite 软件</td></tr><tr><td>通用测序反应试剂盒</td><td>达安基因有限公司</td><td>113</td><td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html&lt;br/&gt; 本试剂盒包含以下组分：&lt;br/&gt; 1. 模板制备试剂盒套装&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 1.1 模板制备试剂盒：&lt;br/&gt; 乳液 PCR 缓冲液&lt;br/&gt; 乳液 PCR 酶混合液&lt;br/&gt; 模板载体溶液&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 1.2 模板制备溶液：&lt;br/&gt; 模板制备反应油 I&lt;br/&gt; 破乳液 II&lt;br/&gt; 模板制备反应油 II&lt;br/&gt; 无核酸酶水&lt;br/&gt; Tween 溶液&lt;br/&gt; 脱乳化溶液 I&lt;br/&gt; 模板洗涤液&lt;br/&gt; C1 磁珠洗涤液&lt;br/&gt; C1 磁珠重悬液&lt;br/&gt; 模板重悬液&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 1.3 模板制备材料：&lt;br/&gt; 试剂管 I&lt;br/&gt; 连接器&lt;br/&gt; 收集管&lt;br/&gt; 试剂管移液器 I&lt;br/&gt; 扩增板&lt;br/&gt; 8 孔条&lt;br/&gt; 专用吸头&lt;br/&gt; 模板制备洗涤适配器&lt;br/&gt; 模板制备滤器&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 2. 测序试剂盒套装&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 2.1 测序试剂盒：&lt;br/&gt; dGTP&lt;br/&gt; dCTP&lt;br/&gt; dATP&lt;br/&gt; dTTP&lt;br/&gt; 测序酶溶液&lt;br/&gt; 测序引物&lt;br/&gt; 质控模板&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 2.2 测序溶液：&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 测序溶液 II&lt;br/&gt; 测序溶液 IIII&lt;br/&gt; 退火缓冲液&lt;br/&gt; 上样缓冲液&lt;br/&gt; 起泡剂&lt;br/&gt; 氯片&lt;br/&gt; C1 磁珠&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 2.3 测序材料：&lt;br/&gt; 试剂管 II&lt;br/&gt; 试剂管盖&lt;br/&gt; 试剂管吸液管 II&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 试剂瓶吸液管&lt;br/&gt; 试剂瓶&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 3. 芯片</td></tr><tr><td>氢氧化钠溶液</td><td>Sigma</td><td>72068-100ML</td><td></td></tr><tr><td>热循环仪</td><td>Life Technologies</td><td>4375786</td><td></td></tr></tbody></table>

基于半导体的下一代测序平台上进行非整倍体植入前遗传学检测

Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform

下一代测序技术在临床应用中对遗传变异的检测日益重要。在胚胎植入前遗传学检测中，该技术在可扩展性、通量和成本方面具有独特优势。对于胚胎植入前非整倍体分析的遗传学检测，本文所介绍的基于半导体的下一代测序（NGS）系统可提供一种全面的方法，以最低8 Mb的分辨率检测结构遗传变异。从样本采集到最终报告，整个工作流程包含多个步骤，需严格遵循操作规范。由于多个关键步骤可能影响扩增结果、文库质量、测序读长的覆盖度以及数据输出，因此除文字描述外，辅以可视化操作演示可更详细地呈现实验操作细节，从而对所有关键步骤的结果产生重要影响。本文所述方法将展示活检获得的滋养层（TE）细胞全基因组扩增（WGA）、基因组文库构建、测序仪管理，以及最终生成拷贝数变异报告的完整流程。

当测序程序在仪器运行结束后完成时，测序服务器系统会报告生成数据的摘要信息，包括数据的描述性信息、芯片状态、ISP加载率以及文库质量，如图2所示。在本结果示例中，总共获得了17.6 G的碱基数据，芯片所有孔中的ISP总体加载率为88%；热图显示样本在芯片的整个区域上分布均匀（图2A）。在一次代表性运行中，共获得99,761,079条总读长，其中77%为可用读长；在所有加载了ISP的孔中，100%含有富集的模板，其中78%为克隆性模板。在所有克隆性模板中，97%被认定为合格的最终文库（图2B）。读长的平均长度分别为117 bp（均值）、176 bp（中位数）和174 bp（众数）（图2C）。模板适配子区域中T、C和A的峰值计数约为76，超过50的合格阈值线（图2D）。在所有含有活性ISP的可寻址孔中，99.5%被认定为构建合格的文库，而20%的多...

本方案介绍了在基于半导体的下一代测序平台上进行胚胎植入前非整倍体遗传学检测所需的全部实验室操作流程。本文详细阐述了全基因组扩增、DNA片段筛选、文库构建、模板制备及测序工作流程的各个步骤，并展示了代表性结果。

下一代测序在临床应用中对遗传变异检测的重要性日益增加。在胚胎植入前……

本方案介绍了在基于半导体的下一代测序平台上，从单细胞扩增到最终报告数据的植入前非整倍体遗传学检测（PGT-A）完整操作流程。该流程可帮助读者充分理解PGT-A测序的实验工作流程，并在配备基于半导体NGS平台的诊断实验室中重复此技术。首先，用移液器吸取25 µL全基因组扩增产物，转移至预先加入25 µL无核酸酶水的1.5 mL离心管中。涡旋混匀DNA纯化磁珠。将50微升该溶液分装至每个样品管中。涡旋混匀后，短暂离心5秒。将离心管在室温下放置五分钟，以完成DNA结合过程。将1.5毫升离心管插入磁力架中，静置直至所有磁珠完全吸附至管壁一侧。小心地将上清液转移至新的 1.5 毫升离心管中。避免吸出珠子。根据原始样品体积进行操作。用移液器吸取30微升磁珠，涡旋混匀并短暂离心5秒。将离心管在室温下放置5分钟，以完成DNA结合过程。将1.5毫升离心管插入磁力架中。然后，等待所有磁珠完全吸附至管壁一侧。小心移除并弃去上清液，避免将磁珠吸出。将300微升70%乙醇用移液器加入1.5毫升离心管中。然后轻轻将管子旋转180度角两次，使磁珠沿管壁移动，以彻底清洗。用移液器吸出并弃去上清液。避免将珠子吸出。重复洗涤步骤一次。清洁程序完成后，在系统中放入一个新的扩增板。将收集管（每管预先加入150微升裂解液二）插入转子中，然后将支架放在收集管上。向半数管中加入反应油，向三分之一管中加入乳化剂裂解液。将新的模板制备滤柱置于试管架上，确保样品入口朝上。涡旋振荡溶液5秒，然后短暂离心5秒。用移液器反复吹打800微升三次后，将溶液转移至滤膜的加样孔中。在最后一次上样前，离心管体以减少气泡。避免将空气注入滤器中。在混合溶液之后，注入200 µL的反应油二。将滤器的样品口朝下旋转，并将清洗接头更换为滤器。将样本针插入转子盖的中心孔，然后将针压到底部。点击屏幕上的“运行”按钮，并根据相应的试剂盒选择程序。然后选择“辅助”以检查所有步骤。单击“下一步”，直到运行开始。运行完成大约需要 4.5 小时。程序结束后，选择“下一步”。系统将开始一个10分钟的离心过程。离心结束后，单击“打开盖子”按钮，将收集管转移至管架中。如果在15分钟内未进入下一步操作，请按“最终离心”以重新离心。弃去收集管中的上清液，保留100微升溶液于管中。用移液器吹打混匀剩余样品，并将样品转移至新标记为OT的1.5毫升离心管中。吸取上清液时，避免移液器枪头沿管壁接触管底。向每个收集管中加入100微升无核酸酶水，通过反复吹打混匀后，将溶液转移至已洗涤过的OT管中。向OT管中加入600微升无核酸酶水，使总体积达到1毫升。在15,500 ×g离心机中涡旋振荡30秒，离心8分钟。轻轻弃去上清液，保留OT管中100微升溶液。用枪头彻底弃去油层。加入900 µL无核酸酶水，涡旋振荡30秒，然后在15,500 ×g条件下离心8分钟。弃去上清液，保留20 µL溶液，再加入模板重悬液至终体积为100 µL。然后涡旋振荡30秒，并短暂离心2秒。在样品处理后的12小时内进行下一步操作。向八联管条中加入100 µL稀释后的文库、130 µL C1磁珠、300 µL 3×模板洗涤液以及300 µL洗脱液。将八联管条安装至富集模块上，装载移液吸头，并将200 µL离心管置于收集位置。单击“开始”以运行程序。用移液器吸取55微升样品溶液，并将其注入芯片的样品孔中。将芯片放置在离心机上。将凹槽朝向外侧，样品孔朝内放置。然后用另一块使用过的芯片配平，离心10分钟。按照文本稿件中的描述准备上样溶液。向发泡溶液中吹入100微升空气。反复吹打溶液，直至气泡呈密集的泡沫状态，并将泡沫体积控制在约250微升。离心后将芯片放置在实验台上。向样品孔中注入 100 微升泡沫，并将挤出的溶液移至出口孔。然后，将芯片短暂离心 30 秒。重复此过程一次。注入100微升50%洗涤缓冲液，重复两次，每次注入后移除出口端挤出的溶液。然后注入100微升50%退火缓冲液，重复三次，每次注入后移除出口端挤出的溶液。接着注入65微升50%酶反应缓冲液，避免产生气泡，并移除出口端挤出的溶液。将加载好的芯片在室温下稳定放置五分钟，然后将芯片安装到测序仪的芯片端口。选择“Planned”程序，核对信息后启动运行。一次典型的运行共获得 17.6 GB 的数据，芯片总孔数中离子球颗粒的整体加载率为 88%。热图证实了在整个芯片区域上的样品加样均匀。77%的总读数可用。所有加载了ISP的孔均显示出100%的模板富集率，其中78%为克隆性扩增。在所有克隆模板中，97%达到了最终文库的标准。读段的平均长度为177个碱基对，中位数和众数分别为176和174个碱基对。模板中胸腺嘧啶、胞嘧啶和腺嘌呤的峰值计数均约为76，超过50的合格阈值。在所有可寻址的孔中，含有活体ISP的样本中有99.5%被认定为构建合格的文库，20%的多克隆和低质量文库被过滤掉，而76.6%的ISP符合进一步分析的标准。单个样本的拷贝数变异结果显示，在4号染色体上存在一段从P16.3至Q35.2、长度为182.16兆碱基对的嵌合性三体，以及在22号染色体上存在一段从Q11.1至Q13.33、长度为33.13兆碱基对的单体片段。进行片段筛选时，应根据同一批次中各样本的大小调整各步骤之间的时间间隔，以避免前部和后部样本出现过度或不足的处理。

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科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

基于半导体的下一代测序平台上非整倍体的植入前基因检测

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