基于半导体的下一代测序平台上进行非整倍体植入前遗传学检测

本方案介绍了在基于半导体的下一代测序平台上，从单细胞扩增到最终报告数据的植入前非整倍体遗传学检测（PGT-A）完整操作流程。该流程可帮助读者充分理解PGT-A测序的实验工作流程，并在配备基于半导体NGS平台的诊断实验室中重复此技术。首先，用移液器吸取25 µL全基因组扩增产物，转移至预先加入25 µL无核酸酶水的1.5 mL离心管中。

涡旋混匀DNA纯化磁珠。将50微升该溶液分装至每个样品管中。涡旋混匀后，短暂离心5秒。

将离心管在室温下放置五分钟，以完成DNA结合过程。将1.5毫升离心管插入磁力架中，静置直至所有磁珠完全吸附至管壁一侧。

小心地将上清液转移至新的 1.5 毫升离心管中。避免吸出珠子。根据原始样品体积进行操作。

用移液器吸取30微升磁珠，涡旋混匀并短暂离心5秒。将离心管在室温下放置5分钟，以完成DNA结合过程。将1.5毫升离心管插入磁力架中。

然后，等待所有磁珠完全吸附至管壁一侧。小心移除并弃去上清液，避免将磁珠吸出。

将300微升70%乙醇用移液器加入1.5毫升离心管中。然后轻轻将管子旋转180度角两次，使磁珠沿管壁移动，以彻底清洗。用移液器吸出并弃去上清液。

避免将珠子吸出。重复洗涤步骤一次。清洁程序完成后，在系统中放入一个新的扩增板。

将收集管（每管预先加入150微升裂解液二）插入转子中，然后将支架放在收集管上。向半数管中加入反应油，向三分之一管中加入乳化剂裂解液。将新的模板制备滤柱置于试管架上，确保样品入口朝上。

涡旋振荡溶液5秒，然后短暂离心5秒。用移液器反复吹打800微升三次后，将溶液转移至滤膜的加样孔中。在最后一次上样前，离心管体以减少气泡。

避免将空气注入滤器中。在混合溶液之后，注入200 µL的反应油二。将滤器的样品口朝下旋转，并将清洗接头更换为滤器。

将样本针插入转子盖的中心孔，然后将针压到底部。点击屏幕上的“运行”按钮，并根据相应的试剂盒选择程序。然后选择“辅助”以检查所有步骤。

单击“下一步”，直到运行开始。运行完成大约需要 4.5 小时。程序结束后，选择“下一步”。

系统将开始一个10分钟的离心过程。离心结束后，单击“打开盖子”按钮，将收集管转移至管架中。如果在15分钟内未进入下一步操作，请按“最终离心”以重新离心。

弃去收集管中的上清液，保留100微升溶液于管中。用移液器吹打混匀剩余样品，并将样品转移至新标记为OT的1.5毫升离心管中。吸取上清液时，避免移液器枪头沿管壁接触管底。向每个收集管中加入100微升无核酸酶水，通过反复吹打混匀后，将溶液转移至已洗涤过的OT管中。

向OT管中加入600微升无核酸酶水，使总体积达到1毫升。在15,500 ×g离心机中涡旋振荡30秒，离心8分钟。轻轻弃去上清液，保留OT管中100微升溶液。

用枪头彻底弃去油层。加入900 µL无核酸酶水，涡旋振荡30秒，然后在15,500 ×g条件下离心8分钟。弃去上清液，保留20 µL溶液，再加入模板重悬液至终体积为100 µL。

然后涡旋振荡30秒，并短暂离心2秒。在样品处理后的12小时内进行下一步操作。向八联管条中加入100 µL稀释后的文库、130 µL C1磁珠、300 µL 3×模板洗涤液以及300 µL洗脱液。将八联管条安装至富集模块上，装载移液吸头，并将200 µL离心管置于收集位置。

单击“开始”以运行程序。用移液器吸取55微升样品溶液，并将其注入芯片的样品孔中。将芯片放置在离心机上。

将凹槽朝向外侧，样品孔朝内放置。然后用另一块使用过的芯片配平，离心10分钟。按照文本稿件中的描述准备上样溶液。

向发泡溶液中吹入100微升空气。反复吹打溶液，直至气泡呈密集的泡沫状态，并将泡沫体积控制在约250微升。离心后将芯片放置在实验台上。

向样品孔中注入 100 微升泡沫，并将挤出的溶液移至出口孔。然后，将芯片短暂离心 30 秒。重复此过程一次。

注入100微升50%洗涤缓冲液，重复两次，每次注入后移除出口端挤出的溶液。然后注入100微升50%退火缓冲液，重复三次，每次注入后移除出口端挤出的溶液。接着注入65微升50%酶反应缓冲液，避免产生气泡，并移除出口端挤出的溶液。

将加载好的芯片在室温下稳定放置五分钟，然后将芯片安装到测序仪的芯片端口。选择“Planned”程序，核对信息后启动运行。一次典型的运行共获得 17.6 GB 的数据，芯片总孔数中离子球颗粒的整体加载率为 88%。

热图证实了在整个芯片区域上的样品加样均匀。77%的总读数可用。所有加载了ISP的孔均显示出100%的模板富集率，其中78%为克隆性扩增。

在所有克隆模板中，97%达到了最终文库的标准。读段的平均长度为177个碱基对，中位数和众数分别为176和174个碱基对。模板中胸腺嘧啶、胞嘧啶和腺嘌呤的峰值计数均约为76，超过50的合格阈值。

在所有可寻址的孔中，含有活体ISP的样本中有99.5%被认定为构建合格的文库，20%的多克隆和低质量文库被过滤掉，而76.6%的ISP符合进一步分析的标准。单个样本的拷贝数变异结果显示，在4号染色体上存在一段从P16.3至Q35.2、长度为182.16兆碱基对的嵌合性三体，以及在22号染色体上存在一段从Q11.1至Q13.33、长度为33.13兆碱基对的单体片段。进行片段筛选时，应根据同一批次中各样本的大小调整各步骤之间的时间间隔，以避免前部和后部样本出现过度或不足的处理。