基于半导体的下一代测序平台上非整倍体的植入前基因检测
2022年8月17日
该协议介绍了在基于半导体的下一代测序平台上对非整倍性进行植入前基因检测所需的整体实验室内程序。在这里，我们以具有代表性的结果介绍了全基因组扩增、DNA片段选择、文库构建、模板制备和测序工作流程的详细步骤。
该协议介绍了从单细胞扩增到最终报告数据的过程，用于基于半导体的下一代测序平台上的非整倍性植入前基因检测。该程序可以帮助观察者很好地了解PGT-A测序的实验工作流程，并在具有基于半导体的NGS平台的诊断实验室中复制该技术。首先移取25微升全基因组扩增产物，并将其转移到预装有25微升无核酸酶水的1.5毫升离心管中。
涡旋并混合DNA纯化珠。将50微升该溶液等分到每个样品管中。涡旋并短暂离心五秒钟。
将试管在室温下放置五分钟以进行DNA结合过程。将1.5毫升离心管插入磁性架。然后，等到所有磁珠都被吸引到管的侧壁上。
小心地将上清液转移到新的1.5毫升离心管中。避免移出磁珠。按原样品体积。
移液30微升磁珠，涡旋并短暂离心五秒钟。将试管在室温下放置五分钟以进行DNA结合过程。将 1.5 毫米离心管插入磁性架。
然后，等到所有磁珠都被吸引到管的侧壁上。小心地除去并丢弃上清液。避免将磁珠移出。
将300微升70%乙醇移液到1.5毫升离心管中。然后以 180 度角轻轻旋转试管两次，并沿管壁移动珠子进行彻底清洗。移液并弃去上清液。
避免将磁珠移出。重复洗涤程序一次。清洁程序完成后，在系统中放置一个新的扩增板。
将收集管（每个收集管预装有 150 微升破碎溶液二）插入转子，然后将桥放在收集管上。将反应油加入管的一半，将乳化剂破碎溶液加入管的三分之一。将用于模板制备的新过滤器放在试管架上，样品入口朝上。
涡旋溶液五秒钟，短暂离心五秒钟。然后在移液800微升三次后将溶液转移到过滤器的样品通道中。在最后一次注射之前离心管以减少气泡。
避免将空气注入过滤器。注入200微升反应油二，按照混合溶液。向下转动过滤器的样品入口，并用过滤器更换洗涤适应装置。
将样品针插入转子盖的中心孔中，然后将针头压到底部。单击屏幕上的"运行"按钮，然后根据相应的套件选择程序。然后选择"辅助"以检查所有步骤。
单击"下一步"，直到运行开始。运行大约需要 4.5 小时才能完成。程序完成后选择"下一步"。
系统将开始10分钟的离心过程。离心后，单击"打开盖子"按钮并将收集管移动到架子上。如果该过程在 15 分钟内没有进入下一步，请按最终旋转以重新离心。
除去收集管中的上清液，在管中留下100微升溶液。通过移液混合剩余的样品，并将样品转移到标有OT的新1.5毫升离心管中。移取上清液时，避免沿侧面接触管底部。将100微升无核酸酶的水移液到每个收集管中，并将溶液转移到通过重复移液洗涤的OT管中。
向OT管中加入600微升无核酸酶的水，以构成一毫升的总体积。在离心机中以15， 500倍G涡旋30秒，持续8分钟。轻轻除去上清液，在OT管中留下100微升溶液。
使用吸头完全丢弃油层。加入900微升无核酸酶的水，涡旋30秒，以15， 500倍G离心8分钟。除去上清液直到保留20微升溶液，然后加入模板重悬溶液以弥补100微升的体积。
然后涡旋30秒，短暂离心两秒钟。在样品处理后 12 小时内进行下一步 将 100 微升稀释库、130 微升 C1 珠、300 微升三 x 模板洗涤溶液和 300 微升熔融脱落溶液加载到八个孔条中。将八个孔条安装在富集模块上，装入移液吸头，并将 200 微升离心管置于收集位置。
单击"开始"以运行该程序。吸取55微升样品溶液并将其注入芯片的样品孔中。将芯片放在离心机上。
将凹口朝向外部，将样品门户保持在内部。然后，将其与另一个用过的芯片平衡并离心 10 分钟。按照文本手稿中的说明准备加载溶液。
将100微升空气吹入发泡溶液中。反复移液，直到气泡处于致密的起泡状态，并将泡沫体积保持在约250微升。离心机后将芯片放在工作台上。
将 100 微升泡沫注入样品孔，然后将挤出的溶液取出到出入口中。然后，将芯片短暂离心 30 秒。重复此过程一次。
在50%洗涤缓冲液中注入100微升两次，并在每次注射后在出门口中除去挤出的溶液。然后在50%退火缓冲液中注入100微升三次，并在每次注射后在出门中除去挤出的溶液。在50%酶反应缓冲液中注入65微升，避免气泡，并在出门中除去挤出的溶液。
将加载的芯片在室温下稳定五分钟，然后将芯片安装在定序器芯片门户上。选择"计划"程序，检查信息并开始运行。代表性运行共获得17.6 GB的数据，离子球粒子在芯片总孔中的总加载率为88%。
热图确认了总芯片面积上的均匀样品加载。总读取量的 77% 可用。所有装有ISP的孔均显示出100%的模板富集，其中78%是克隆的。
在所有克隆模板中，97%有资格作为最终文库。读取的平均长度为177个碱基对，而中位数和模式分别为176和174个碱基对。模板中胸腺嘧啶、胞嘧啶和腺嘌呤的峰数在合格临界线50上约为76。
在所有具有活ISP的可寻址孔中，99.5%符合构建文库的资格，过滤掉20%的多克隆和低质量文库，而76.6%的ISP符合进一步分析的条件。单个样本的拷贝数方差结果描绘了 182.16 兆碱基对马赛克三体，即 P 16.3 至 Q 35.2 在 4 号染色体上，33 点 13 兆碱基对单体片段为 Q 11.1 至 Q 13.33 在 22 号染色体上。进行片段选择时，应根据同一批次样品的大小修改步骤之间的时间间隔，以防止前端和后端样品过度暴露和暴露不足。
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概述
本协议介绍了在半导体基因组下一代测序平台上进行胚胎植入前非整倍体遗传测试的单细胞扩增到最终报告数据的程序。它详细说明了PGT-A测序的实验工作流程，使诊断实验室能够复制。
关键研究组成部分
科学领域
- 遗传测试
- 下一代测序
- 生殖生物学
背景
- 胚胎植入前非整倍体遗传测试（PGT-A）对于评估胚胎活力至关重要。
- 下一代测序（NGS）为遗传分析提供了高通量方法。
- 理解工作流程对于准确诊断至关重要。
- 本协议概述了成功实施所需的步骤。
研究目的
- 提供使用NGS进行PGT-A的全面协议。
- 促进对实验工作流程的理解。
- 使诊断环境中能够复制该技术。
所用方法
- 单细胞全基因组扩增。
- DNA片段选择和纯化。
- 文库构建和模板准备。
- 在半导体基础平台上进行测序。
主要结果
- 成功扩增和测序遗传物质。
- 导致可靠遗传测试结果的详细工作流程。
- 代表性结果展示了协议的有效性。
- 在生殖健康中进行高通量诊断的潜力。
结论
- 该协议为使用NGS进行PGT-A提供了明确的框架。
- 它增强了实验室准确执行遗传测试的能力。
- 未来应用可能会扩大该技术在临床环境中的使用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Semiconductor-based next-generation sequencing (NGS) platforms for pre-implantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) enable high-throughput, scalable, and cost-effective detection of chromosomal abnormalities in early-stage embryos. This workflow enhances predictive confidence in embryo selection, directly impacting translational decision points in reproductive genetics and supporting risk-adjusted portfolio advancement. The protocol's quantitative outputs and reproducibility are critical for enterprise-level adoption in diagnostic and research settings.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust detection of chromosomal copy number variants, supporting genetic hypothesis testing in reproductive biology.
- Facilitates biological de-risking by providing high-resolution structural variant data from single-cell samples.
- Supports predictive confidence in embryo viability assessments, informing downstream translational research.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, quantitative readouts for copy number variation, essential for assay standardization and reproducibility.
- Prepares high-quality genomic libraries suitable for scalable screening workflows in genetic diagnostics.
- Enables reliable evaluation of sample quality and sequencing performance metrics for downstream analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant genetic screening by detecting aneuploidies and structural variants at clinically actionable resolutions.
- Provides continuity from discovery-stage genetic analysis to preclinical validation of genomic biomarkers.
- Supports risk-adjusted advancement decisions in reproductive and genetic medicine pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This NGS-based PGT-A protocol integrates from sample acquisition and whole genome amplification through library construction, sequencing, and quantitative reporting, bridging early discovery with translational research in reproductive genetics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling detection of chromosomal abnormalities at single-cell resolution.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for copy number analysis, facilitating assay readiness and standardization.
- Analytics: Generates comprehensive sequencing metrics and copy number variant reports for robust comparative analysis.
- Translational Research: Ensures continuity of genetic findings from early-stage screening to preclinical validation of embryo viability.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow adaptable across genetic testing platforms and sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genetic screening workflows.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable protocols for high-throughput genetic analysis.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement in reproductive genetics portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genetic testing programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell genomics and NGS workflow management.
- Demands access to semiconductor-based sequencing platforms and robust analytical infrastructure.
- Necessitates strict adherence to protocol timing and handling to ensure data quality and reproducibility.
- Adaptation across sample types and batch sizes may require protocol optimization for consistent results.
- Potential limitations include sensitivity to sample quality and the need for precise fragment selection timing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:40
Fragment Selection Procedure
2:20
Sequencing Template Preparation and Enrichment
5:48
Loading the Sample and Sequencing
7:22
Results: Whole Genome Amplification Combined with Next-Generation Sequencing for Analysis of Embryo Aneuploidy
8:59
Conclusion
