Name: 使用连续截面电子显微镜对肝细胞中组织间接触位点进行三维表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 了解连续切片电子显微镜技术，用于三维重建肝细胞中的细胞器膜接触位点。该方法无需专用体积电镜即可实现高分辨率成像，适用于研究细胞器相互作用与病理机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢Joanna Hanley、Rebecca Fiadeiro和Ania Straatman-Iwanowska提供的专业技术支持。同时感谢Stefan实验室成员以及Ian J. White的有益讨论。J.J.B.由英国医学研究理事会（MRC）对伦敦大学学院（UCL）分子细胞生物学MRC实验室的资助支持，资助编号为MC_U12266B。C.J.S.由英国医学研究理事会（MRC）对伦敦大学学院（UCL）分子细胞生物学MRC大学单位的资助支持，资助编号为MC_UU_00012/6。P.G.由欧洲研究理事会资助，资助编号为ERC-2013-StG-337057。

作者声明无利益冲突。

本方案描述了一种可及的vEM技术，用于在三维空间中可视化细胞器结构及其相互作用。本文以肝细胞中细胞器间接触的形态学特征作为案例进行展示。然而，该方法也已应用于研究多种其他样本和研究领域，包括外周神经中施万细胞与内皮细胞的相互作用45、内皮细胞中魏贝尔-帕拉德小体的生物发生46、肾细胞中的物质分泌47，以及海马神经元突触的形态学48。为了更深入地理解肝脏生物学，该方法可用于研究二维肝细胞培养、三维肝类器官模型系统49以及肝脏组织中的肝细胞形态。这一稳健且灵活的方法适用于许多具备常规120 kV透射电子显微镜和超薄切片机的实验室，无需昂贵的样品制备技术。
尽管本方案具有较好的可操作性，但需要注意的是，尚有其他vEM技术可供选择，这些技术可能根据具体的研究问题为研究者提供某些优势；详见 表1 综述<sup class=...

自20世纪30年代发明以来，电子显微镜使研究人员能够观察细胞和组织的结构组分1,2。大多数研究提供的是二维信息，因为构建三维模型需要 painstaking 的连续切片收集、手动摄影、底片处理、手工描记，以及从玻璃、塑料或泡沫塑料板上创建和组装三维模型3,4。近70年后的今天，该过程的诸多方面已取得显著进展，包括显微镜性能、连续切片收集、自动数字成像，以及用于三维重建、可视化和分析的先进软件与硬件，同时还发展出多种替代方法，这些方法如今统称为体积电子显微镜技术（volume EM, vEM）。这些vEM技术通常被认为可在微米尺度范围内以纳米级分辨率提供三维超微结构信息，涵盖透射电子显微镜（TEM）和较新的扫描电子显微镜（SEM）技术；参见相关综述5,6,7,8。
例如，聚焦离子束扫描电镜（FIB-SEM）利用扫描电镜（SEM）内的聚焦离子束，在对样品表面进行连续SEM成像扫描之间逐次铣削去除样品表面材料，从而实现对样品的重复自动化铣削与成像，进而构建用于三维重建的3D数据集9,10。相比之下，连续块面扫描电镜（SBF-SEM）则在SEM腔体内使用超薄切片机，在每次成像前去除样品块表面的材料11,12；而阵列断层成像是一种非破坏性过程，需先将连续超薄切片收集到盖玻片、晶圆或胶带上，然后建立自动化工作流程，在SEM中对各连续切片中的目标区域依次成像，以生成3D数据集13。与阵列断层成像类似，连续切片透射电镜（ssTEM）也需要在成像前预先收集物理切片；但这些切片需收集在透射电镜（TEM）载网上，并在TEM中进行成像14,15,16。ssTEM还可通过执行倾斜断层成像进一步扩展其应用17,18,19。连续倾斜断层成像在x、y和z方向均能提供最佳分辨率，尽管已被用于完整细胞的三维重建20，但其操作相对复杂且具有挑战性。本实验方案重点关注ssTEM的实际操作方面，因其是目前许多电子显微镜实验室最容易实现的三维电镜（vEM）技术，尤其适用于那些尚无专用切片设备或vEM专用仪器，但仍希望获得三维vEM数据的研究团队。
用于三维重建的连续超薄切片技术过去一直被认为具有挑战性。要切出厚度均匀且平直的切片条带，并将其按正确顺序排列并拾取到载网上，同时确保支撑充分，又不因载网栅条遮挡感兴趣区域，最重要的是避免切片丢失（因为不完整的系列可能导致无法完成完整的三维重建），这些操作都十分困难21。然而，近年来商用超薄切片机、金刚石切割刀与修块刀22,23、载网上的电子透明支持膜21,24，以及有助于切片黏附和条带保存的黏合剂13,21等方面的逐步改进，使该技术在许多实验室中已趋于常规化。一旦收集完成连续切片，在透射电子显微镜（TEM）中进行连续成像就相对简单，可获得在 x 和 y 方向上像素尺寸达亚纳米级的电镜图像，从而实现对亚细胞结构的高分辨率观察——这对许多研究问题而言可能是必要的。本文展示的案例研究，演示了连续切片透射电镜（ssTEM）与三维重建技术在肝细胞内质网（ER）-细胞器接触研究中的应用，其中&#160;ER-细胞器接触最初即在此类细胞中被观察到25,26。
内质网虽与核膜相连，但也与多种其他细胞器形成紧密接触，包括溶酶体、线粒体、脂滴以及质膜27。内质网与其他细胞器之间的接触参与调控脂质代谢28、磷脂酰肌醇和钙信号传导29、自噬调控以及应激反应30,31。这些内质网-细胞器接触以及其他细胞器间接触是高度动态的结构，能够响应细胞代谢需求和胞外信号刺激。研究表明，它们在形态上表现出大小、形状以及细胞器膜间距等方面的差异32,33。这些超微结构的差异可能反映了其不同的蛋白质/脂质组成及功能34,35。然而，目前仍难以准确定义细胞器间的接触并对其进行分析36。因此，亟需一种可靠且简便的实验方案，用于进一步研究和表征细胞器间的接触结构。
由于内质网（ER）与细胞器之间的膜接触间距通常在10至30 nm之间，因此长期以来，透射电子显微镜（TEM）一直是识别此类结构的金标准。薄切片TEM技术已揭示出定位于特定膜接触位点的内质网驻留蛋白具有明确的亚区域定位37。传统上，该方法能够以纳米级分辨率揭示内质网与细胞器之间的接触，但通常仅提供这些相互作用的二维视图。然而，体积电子显微镜（vEM）技术可在三维空间中呈现这些接触位点的超微结构形态及其周围环境，从而实现对接触结构的完整重建，并更准确地分类（如点状、管状或类似扁囊状）和定量分析38,39。除了是最早观察到内质网-细胞器接触的细胞类型之一25,26，肝细胞还拥有广泛的其他细胞器间接触系统，这些接触在其细胞结构和生理功能中发挥着至关重要的作用28,40。然而，目前对肝细胞中内质网-细胞器及其他细胞器间接触的系统性形态学表征仍然不足。因此，细胞器间接触在肝细胞再生与修复过程中如何形成和重塑，对于理解肝细胞生物学及肝脏功能具有特别重要的意义。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>铝制托盘</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3912</td><td></td></tr><tr><td>Amira v6</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>https://www.thermofisher.com</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher</td><td>C/4960/PB08</td><td></td></tr><tr><td>DDSA/十二烯基琥珀酸酐</td><td>TAAB</td><td>T027</td><td>Epon 组分</td></tr><tr><td>金刚石刀</td><td>DiaTOME</td><td>ultra 45&amp;deg;</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30/2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚</td><td>TAAB</td><td>D032</td><td>Epon 组分</td></tr><tr><td>Dumont 镊子 N5</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT5293</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/</td></tr><tr><td>Fiji TrakEM2 插件</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/</td></tr><tr><td>36% 甲醛溶液</td><td>TAAB</td><td>F003</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 包被的载网</td><td>自制</td><td></td><td>替代品：EMS diasum (FF2010-Cu)</td></tr><tr><td>带涂布棒的玻璃瓶</td><td>Medisca</td><td>6258</td><td></td></tr><tr><td>玻璃小瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>15364769</td><td></td></tr><tr><td>25% 戊二醛溶液</td><td>TAAB</td><td>G011</td><td></td></tr><tr><td>MNA/甲基纳迪克酸酐</td><td>TAAB</td><td>M011</td><td>Epon 组分</td></tr><tr><td>2% 四氧化锇溶液</td><td>TAAB</td><td>O005</td><td></td></tr><tr><td>铁氰化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8131</td><td></td></tr><tr><td>环氧丙烷</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0050/PB08</td><td></td></tr><tr><td>可重复使用粘合剂</td><td>Blue Tack</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reynolds 柠檬酸铅</td><td>TAAB</td><td>L037</td><td>切片染色</td></tr><tr><td>二甲胂酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0250</td><td>用于配制 0.1 M 二甲胂酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>RS Components</td><td>918-6872</td><td>氰基丙烯酸酯胶，步骤 1.3</td></tr><tr><td>TAAB 812 树脂</td><td>TAAB</td><td>T023</td><td>Epon 组分</td></tr><tr><td>单宁酸</td><td>TAAB</td><td>T046</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>双组分环氧树脂</td><td>RS Components</td><td>132-605</td><td>替代品：步骤 2.13</td></tr><tr><td>超薄切片机</td><td>Leica</td><td>UC7</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td></td><td>切片厚度 100 &amp;micro;m，切割速度 0.16 mm/s，振幅 1 mm。</td></tr><tr><td>Weldwood 原装接触胶</td><td>DAP</td><td>107</td><td>接触型粘合剂：步骤 3.1.4</td></tr></tbody></table>

利用连续切片电子显微镜对肝细胞中细胞器间接触位点进行三维表征

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

透射电子显微镜长期以来被认为是观察细胞超微结构的金标准。然而，分析通常局限于二维层面，限制了对细胞器三维（3D）超微结构及其功能关系的全面描述。体积电子显微镜（vEM）是一类技术的统称，能够以介观、微观和纳米级分辨率对细胞超微结构进行三维解析。
本方案提供了一种简便且可靠的获取体积电子显微镜（vEM）数据的方法，采用连续切片透射电子显微镜（TEM），涵盖从样品处理到数字化三维重建的全部技术环节，整个流程单一且直观。为展示该技术的应用价值，本文呈现了肝细胞中内质网与线粒体之间的三维超微结构关系及其接触位点。细胞器间的接触在离子、脂质、营养物质及其他小分子的转运过程中发挥着关键作用。然而，尽管这些接触位点最初是在肝细胞中被发现的，但关于其物理特征、动态行为及功能，仍有许多未知有待探索。
细胞器之间的接触可呈现多种形态，其特征在于两个细胞器彼此之间的接近程度（通常约为 ~10–30 nm）以及接触区域的范围（从点状接触至较大的类似囊腔的三维结构接触）。对这些紧密接触的观察需要高分辨率成像，而连续切片透射电镜（TEM）非常适合用于可视化肝细胞分化过程中细胞器间接触的三维超微结构，以及与代谢性疾病相关的肝细胞结构改变。

对于该技术，根据生物学研究目的在包埋组织修块和切片前预先选定感兴趣的区域。同样，切面的大小可能由具体的研究问题决定；本实验中，将样品修块至切面尺寸约为 0.3 mm × 0.15 mm（图 4A）。此尺寸可制备两个网格，每个网格包含 9 张连续切片，共获得 18 张连续切片，涵盖约 62 µm3（316 µm × 150 µm × 1.3 µm）体积的肝组织。该体积足以实现肝组织中单个线粒体的完整三维重建。
<img alt="显示肝细胞中内质网-线粒体接触的电子显微镜示意图；分割分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63496/63496fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：分割与三维重建分析...

一种简单且全面的方案，用于获取肝脏肝细胞或其他组织细胞中细胞器之间膜接触位点的三维细节。

透射电子显微镜长期以来一直被视为观察细胞超微结构的金标准。然而，分析是……

本方案能够以简单且稳健的方式实现细胞器的三维重建，同时适用于目前不具备专业体电子显微镜的实验室。该技术具有极高的灵活性，可提供优良的X/Y方向分辨率，并可在需要时对样品进行重复成像。当需要极高Z方向分辨率时，该方法还可与倾斜断层扫描技术兼容。该技术能够在细胞器间的相互关系背景下研究细胞器的形态学特征。因此，该方法可进一步拓展用于分析任何伴有细胞器缺陷的病理状态。此方法可为细胞器间的相互作用及细胞内物质运输事件提供深入见解。除肝细胞外，该方法还可应用于其他组织、类器官模型和细胞培养系统。初次使用者在连续切片和拾取过程中可能会发现难以避免损失。建议在对珍贵样品应用本方案前，先熟练掌握常规超薄切片技术。首先，将包埋在树脂中的组织固定在修块适配器中，用剃刀小心地进行修块。将样品连同样品夹和标本舟一起转移到切片机的标本臂上，并调整标本舟的位置，使其运动方向为从上到下。将金刚石刀片放入刀座中并固定，确保刀片的切割角度设置适当。将刀片架牢固地锁定在载物台上。关闭载物台透射照明，打开载物台上方照明，小心地将刀片移向样品，通过调节相应的旋钮，持续调整刀片的侧向角度、样品倾斜度和样品旋转角度，直至样品表面与刀刃对齐。设定样品臂切削窗口的上下位置，并使样品刚好位于刀刃下方。用干净的双蒸水填充刀舟，确保水面与刀刃齐平且略微下凹。然后开始切片。当样品刚通过刀刃后，立即停止切割。使用空的载网槽位来估算每个载网上需收集的切片数量。用双手各持一根眼睫毛，轻轻地将切带分割成适合载网槽长度的小段切带。 mentally 记录它们在样品中的相对位置。使用玻璃涂布棒，在切片上悬滴一滴氯仿以使其展平。用第一把编号的镊子夹取第一个空槽载网，先轻轻浸入Triton X-100中，然后在蒸馏水中浸洗两次。用一片滤纸从镊子边缘吸去多余的水分。用镊子轻轻将约三分之二涂有火棉胶的载网插入刀舟的水中。确保火棉胶面朝下，载网长边的右侧边缘位于水面，并与水边平行。轻轻晃动载网，使载网朝切片条方向在水中摆动，以便在回程时切片漂向载网。继续以越来越小的摆动幅度重复此操作，直到丝带的右边缘与槽口的右边缘对齐。然后，在最后一次摆动时，轻柔地将网格提起，使切片进入槽口网格中。在培养皿盖下方放置数粒氢氧化钠颗粒，以提供一个无二氧化碳的环境。然后，小心地将40 µL的雷诺氏柠檬酸铅溶液滴加到Parafilm上，每张载网一滴。将每张载网倒置在柠檬酸铅液滴上，并用培养皿盖保护，静置7至10分钟。在载网染色的同时，在Parafilm上为每张载网放置约300 µL的蒸馏水滴，共五滴。柠檬酸铅孵育结束后，将每张载网转移至一滴蒸馏水中，洗涤一分钟，注意不要直接向载网呼气。重复此步骤四次。使用编号的交叉镊子夹取第一张载网。用滤纸轻触网格边缘，吸去大部分水分，然后将网格置于镊子上干燥至少20分钟。每个网格均重复此操作。在低倍镜下观察连续切片的排列顺序、位置和方向。在网格上找到序列的中段区域。浏览样品并确定感兴趣区域，然后在所需放大倍数下观察样品。建议以稍低的放大倍数采集图像序列，因为切片通常并非完全对齐，后续可能需要对图像进行裁剪。接下来，在较低放大倍数下拍摄参考图像，这有助于理解感兴趣区域的背景信息，以及该区域在不同放大倍数下相对于切片边界的粗略位置和样本内的标志性结构特征。使用这些方法在其他部分中标示感兴趣区域。对于屏幕参考，可使用可重复使用的黏性橡皮泥、贴纸，或将一张透明投影胶片用胶带固定在屏幕上，以在屏幕上放置临时标记。这将有助于在整个数据集中反复对感兴趣区域的相同特征进行成像，并使其始终位于图像中心。打开图像堆栈，指定体素测量值，然后选择“分割”选项卡以开始分割。在分割编辑器面板中点击“新建”，以在材料列表中定义新对象。右键单击以更改对象颜色，双击以重命名对象。进行手动分割时，选择材料列表下方的分割工具，并选取默认的画笔工具以高亮显示像素。此处显示的是两个相对的肝细胞的电子显微镜图像。更高倍数的成像可实现以纳米级分辨率观察不同细胞器的形态学细节。代表性图像显示了同一断层图的分割版本，包括内质网、线粒体以及不同区域中内质网与线粒体之间的膜间接触结构。代表性图像还展示了一个倾斜的正交切片，其上叠加了分割轮廓，并标示了该切片在整个线粒体中的相对位置。此处还展示了分割后的细胞器以及内质网-线粒体接触结构在不同角度下的三维重建图像。由于该方案在需要极高Z轴分辨率时可与倾转断层扫描技术兼容，因此有助于解析微小或复杂的结构。该技术非常适合用于初步评估不同细胞器之间的空间关系，因此在膜接触与膜稳态这一不断发展的研究领域中尤为有用。

three-dimensional-characterization-interorganelle-contact-sites

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用连续截面电子显微镜对肝细胞中组织间接触位点进行三维表征

肝窦内皮细胞（SECs）的研究必须使用从动物体内获取的原代细胞进行，因为目前尚无可用的细胞系。该方法依赖于肝脏消化和差速离心法来纯化SECs，以便后续培养和实验操作。...

体内 肝脏内吞作用的观察及通过肝脏灌注纯化肝细胞

本方案旨在利用扫描电子显微镜（SEM）对组织中特定细胞进行纳米级分辨率的成像。首先在光学显微镜下对来自树脂包埋生物样品的大量连续切片进行成像，以识别目标区域，随后以逐级放大的方式在扫描电子显微镜中进行成像。...

大体积样本中连续切片的多模态分层成像以定位特定细胞靶标

我们提出了一种研究线粒体和内质网在基因改造后于全细胞中分布的方案，该方案结合了相关光镜与三维电子显微镜技术，包括抗坏血酸过氧化物酶2和辣根过氧化物酶染色、在同一切片中对含有或不含目标基因的细胞进行连续切片，以及通过电子显微镜进行连续成像。...

线粒体与内质网的光与体电子显微镜关联成像

本文介绍了一种利用改良的胶原酶灌注技术从成年小鼠肝脏中分离小鼠肝细胞的实验方案。同时描述了在三维胶原三明治结构中对肝细胞进行长期培养的方法，以及对细胞骨架成分进行免疫标记，以研究胆小管的形成及其对处理的响应。...

分离与三维胶原三明治培养原代小鼠肝细胞以研究细胞骨架在体外胆小管形成中的作用

本文介绍一种简单且易于实施的策略，用于对福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织切片中的免疫细胞进行可视化、定量和定位分析。该方法结合了现有的成像技术和数字分析手段，旨在拓展成像检测的多重检测能力和多参数分析水平。...

肿瘤微环境中免疫细胞群体的可视化、定量与定位分析

由于人们对研究膜接触位点（MCSs）及其组分的细胞结构日益关注，迫切需要开发新的研究方法。本文介绍了一种整合了已有显微镜技术的实验方案，用于鉴定并定量位于膜接触位点的细胞器内及细胞器间蛋白质复合物。...

通过邻位连接检测法对内质网-线粒体接触位点内源性细胞器内蛋白质相互作用的可视化与定量分析

本方案描述了快速且可重复地生成内胚层肝类器官（eHEPOs）的方法。通过本方案，可在2周内生成eHEPOs，并能够长期扩增（超过1年）而不丧失其分化能力与功能特性。...

功能性内胚层肝类器官的生成

冷冻扫描透射电子显微镜断层成像技术提供了一种无需包埋、切片或其他侵入性制备步骤即可观察完整细胞中细胞器的方法。目前该技术获得的三维分辨率可达数纳米，视场范围为数微米，可观察样品厚度约为 1...

细胞器的可视化 原位 通过冷冻扫描透射电子显微镜断层成像技术

本文介绍了一种基于内源性荧光标记的优化切片上相关光镜-电镜联用技术方案，用于研究稀有蛋白质相对于细胞超微结构的定位。该方法的优势通过在未使用巴佛洛霉素处理的饥饿细胞中实现内源性LC3蛋白的超微结构定位得以展示。...

通过切片上相关联的光学-电子显微镜对内源性LC3进行超微结构定位

本方案描述了如何重建线粒体嵴以实现高精度、高分辨率和高通量的三维成像。...

一种用于可视化胰腺癌细胞线粒体超微结构变化的三维技术

本方案介绍了一种全面的成像流程，用于在完整肝组织中可视化并建模肝星状细胞的形态。该方法结合利用小鼠遗传学对成纤维细胞进行荧光标记， 原位 基于肝脏灌注的组织制备，以及改良的iDISCO组织透明化方法，以实现光学透明。...

在小鼠肝纤维化模型中绘制肝星状细胞形态

了解连续切片电子显微镜技术，用于三维重建肝细胞中的细胞器膜接触位点。该方法无需专用体积电镜即可实现高分辨率成像，适用于研究细胞器相互作用与病理机制。

利用连续切片电子显微镜对肝细胞中细胞器间接触位点进行三维表征

探索更多视频