利用连续切片电子显微镜对肝细胞中细胞器间接触位点进行三维表征

本方案能够以简单且稳健的方式实现细胞器的三维重建，同时适用于目前不具备专业体电子显微镜的实验室。该技术具有极高的灵活性，可提供优良的X/Y方向分辨率，并可在需要时对样品进行重复成像。当需要极高Z方向分辨率时，该方法还可与倾斜断层扫描技术兼容。

该技术能够在细胞器间的相互关系背景下研究细胞器的形态学特征。因此，该方法可进一步拓展用于分析任何伴有细胞器缺陷的病理状态。此方法可为细胞器间的相互作用及细胞内物质运输事件提供深入见解。

除肝细胞外，该方法还可应用于其他组织、类器官模型和细胞培养系统。初次使用者在连续切片和拾取过程中可能会发现难以避免损失。建议在对珍贵样品应用本方案前，先熟练掌握常规超薄切片技术。

首先，将包埋在树脂中的组织固定在修块适配器中，用剃刀小心地进行修块。将样品连同样品夹和标本舟一起转移到切片机的标本臂上，并调整标本舟的位置，使其运动方向为从上到下。将金刚石刀片放入刀座中并固定，确保刀片的切割角度设置适当。

将刀片架牢固地锁定在载物台上。关闭载物台透射照明，打开载物台上方照明，小心地将刀片移向样品，通过调节相应的旋钮，持续调整刀片的侧向角度、样品倾斜度和样品旋转角度，直至样品表面与刀刃对齐。设定样品臂切削窗口的上下位置，并使样品刚好位于刀刃下方。

用干净的双蒸水填充刀舟，确保水面与刀刃齐平且略微下凹。然后开始切片。当样品刚通过刀刃后，立即停止切割。

使用空的载网槽位来估算每个载网上需收集的切片数量。用双手各持一根眼睫毛，轻轻地将切带分割成适合载网槽长度的小段切带。 mentally 记录它们在样品中的相对位置。

使用玻璃涂布棒，在切片上悬滴一滴氯仿以使其展平。用第一把编号的镊子夹取第一个空槽载网，先轻轻浸入Triton X-100中，然后在蒸馏水中浸洗两次。用一片滤纸从镊子边缘吸去多余的水分。

用镊子轻轻将约三分之二涂有火棉胶的载网插入刀舟的水中。确保火棉胶面朝下，载网长边的右侧边缘位于水面，并与水边平行。轻轻晃动载网，使载网朝切片条方向在水中摆动，以便在回程时切片漂向载网。

继续以越来越小的摆动幅度重复此操作，直到丝带的右边缘与槽口的右边缘对齐。然后，在最后一次摆动时，轻柔地将网格提起，使切片进入槽口网格中。在培养皿盖下方放置数粒氢氧化钠颗粒，以提供一个无二氧化碳的环境。

然后，小心地将40 µL的雷诺氏柠檬酸铅溶液滴加到Parafilm上，每张载网一滴。将每张载网倒置在柠檬酸铅液滴上，并用培养皿盖保护，静置7至10分钟。在载网染色的同时，在Parafilm上为每张载网放置约300 µL的蒸馏水滴，共五滴。

柠檬酸铅孵育结束后，将每张载网转移至一滴蒸馏水中，洗涤一分钟，注意不要直接向载网呼气。重复此步骤四次。使用编号的交叉镊子夹取第一张载网。

用滤纸轻触网格边缘，吸去大部分水分，然后将网格置于镊子上干燥至少20分钟。每个网格均重复此操作。在低倍镜下观察连续切片的排列顺序、位置和方向。

在网格上找到序列的中段区域。浏览样品并确定感兴趣区域，然后在所需放大倍数下观察样品。

建议以稍低的放大倍数采集图像序列，因为切片通常并非完全对齐，后续可能需要对图像进行裁剪。接下来，在较低放大倍数下拍摄参考图像，这有助于理解感兴趣区域的背景信息，以及该区域在不同放大倍数下相对于切片边界的粗略位置和样本内的标志性结构特征。

使用这些方法在其他部分中标示感兴趣区域。对于屏幕参考，可使用可重复使用的黏性橡皮泥、贴纸，或将一张透明投影胶片用胶带固定在屏幕上，以在屏幕上放置临时标记。这将有助于在整个数据集中反复对感兴趣区域的相同特征进行成像，并使其始终位于图像中心。

打开图像堆栈，指定体素测量值，然后选择“分割”选项卡以开始分割。在分割编辑器面板中点击“新建”，以在材料列表中定义新对象。右键单击以更改对象颜色，双击以重命名对象。

进行手动分割时，选择材料列表下方的分割工具，并选取默认的画笔工具以高亮显示像素。此处显示的是两个相对的肝细胞的电子显微镜图像。更高倍数的成像可实现以纳米级分辨率观察不同细胞器的形态学细节。

代表性图像显示了同一断层图的分割版本，包括内质网、线粒体以及不同区域中内质网与线粒体之间的膜间接触结构。代表性图像还展示了一个倾斜的正交切片，其上叠加了分割轮廓，并标示了该切片在整个线粒体中的相对位置。此处还展示了分割后的细胞器以及内质网-线粒体接触结构在不同角度下的三维重建图像。

由于该方案在需要极高Z轴分辨率时可与倾转断层扫描技术兼容，因此有助于解析微小或复杂的结构。该技术非常适合用于初步评估不同细胞器之间的空间关系，因此在膜接触与膜稳态这一不断发展的研究领域中尤为有用。