Name: 一种报告基因检测法，用于分析哺乳动物细胞中内旋微RNA成熟 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: 学习一种报告基因检测法，用于分析哺乳动物细胞中内源微RNA成熟过程。该方法利用荧光素酶活性评估miRNA与靶标结合效率，适用于研究RNA结合蛋白对微RNA生物合成的调控作用。

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作者感谢新加坡南洋理工大学的 E. Makeyev 提供 HeLa-Cre 细胞以及 pRD-RIPE 和 pCAGGS-Cre 质粒。我们感谢 Edna Kimura、Carolina Purcell Goes、Gisela Ramos、Lucia Rossetti Lopes 和 Anselmo Moriscot 提供的支持。

本文所述实验方案的概述见图1。
1. 质粒构建
<ol>
	<li>pCAGGS-Cre：该质粒由 Dr. E. Makeyev 提供21。</li>
	<li>pRD-miR-17-92：
	<ol>
		<li>使用 0.5 µM 的特异性引物（材料表）、150 ng cDNA、1 mM dNTPs、1× Taq PCR 缓冲液和 5 U 高保真 Taq DNA 聚合酶，通过 PCR 扩增 pre-miR-17-92。同时进行无模板对照 PCR 反应（以水替代 cDNA），以检测是否存在 DNA 污染。</li>
		<li>利用 DNA 连接酶将 PCR 产物连接至 pRD-RIPE 载体（由新加坡南洋理工大学 Dr. E. Makeyev 惠赠）21 中 EcoRI 与 EcoRV 限制性酶切位点之间的内含子区域，构建 pRD-miR-17-92。通过 Sanger 测序验证序列完整性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>pmiRGLO-RAP-IB
	<ol>
		<li>设计两侧带有 XhoI/XbaI 限制性酶切位点、内部含一个 NotI 限制性酶切位点的正向与反向引物。将等摩尔量的正向与反向引物混合，于 90 °C 孵育 5 分钟，随后转移至 37 °C 孵育 15 分钟。作为对照，使用靶序列随机化的引物（材料表）。</li>
		<li>使用 XhoI/XbaI 限制性内切酶切割退火后的片段，并将其连接至 pmiR-GLO 载体中 luc2 序列的下游，构建 pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR（Luc-RAP-1B）和 pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR（Luc-scrambled）报告载体。通过 NotI 酶切验证连接结果。 
		&#8203;注意：确保引物退火后形成的突出末端与载体经酶切后的末端互补。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>pFLAG-HuR
	<ol>
		<li>为构建 HuR 过表达质粒，使用特异性引物扩增 HuR 序列。混合 300 ng cDNA、0.5 µM 的每种特异性引物、1 mM dNTPs 混合液、1× PCR 缓冲液和 5 U 高保真 Taq DNA 聚合酶。</li>
		<li>将 PCR 产物连接至 pGEM-T 载体，并通过 Sanger 测序确认 DNA 序列完整性。从 pGEM-T 中切下 HuR 片段，并亚克隆至 pFLAG-CMV-3 哺乳动物表达载体，构建 pFLAG-HuR 载体。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞培养
注意：HeLa-Cre 细胞系由 E. Makeyev 博士惠赠21，乳头状甲状腺癌细胞（BCPAP）由意大利那不勒斯“费德里科二世”大学 Massimo Santoro 博士惠赠。HeLa 细胞、乳头状甲状腺癌细胞（BCPAP）和 HEK-293T 细胞均用于过表达 HuR。
<ol>
	<li>除非另有说明，否则将细胞维持在含有10%胎牛血清、1 mM丙酮酸钠、200 mM L-谷氨酰胺和1×青霉素-链霉素（100 U/mL青霉素，100 µg/mL链霉素）的DMEM高糖培养基中，培养于100 mm培养皿中。将细胞在37 °C、加湿且气体环境可控的培养箱（5% CO2）中孵育。</li>
	<li>用胰蛋白酶/EDTA（0.5%溶液混合物）在37 °C孵育贴壁细胞3–5分钟，使其从培养板上脱落（孵育时间可根据细胞类型有所不同）。</li>
	<li>按照制造商说明书，使用基于脂质的转染试剂进行转染。确保细胞培养物的融合度约为70%。通过添加适当的DNA，使所有转染组合使用相似量的DNA，具体如下所述。转染实验需设置重复。
	<ol>
		<li>将200 ng DNA与1.25 µL转染试剂在100 µL培养基中混合。将转染混合物加入细胞中。在37 °C下用转染混合物孵育细胞4小时。随后更换为含10% FBS的培养基，并继续孵育24小时后再加入抗生素进行筛选。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. HuR 过表达
<ol>
	<li>将 pFLAG-HuR 和空载体 pFLAG 转染至 HeLa 细胞中。通过逐步提高遗传霉素（G418）浓度进行细胞筛选 &#181;g/mL）从100 &#181;g/mL 至 1000 &#181;g/mL，以生成稳定细胞系。</li>
	<li>使用针对 HuR mRNA 的特异性引物，通过定量 PCR 确认过表达，具体操作如步骤 7 所述。</li>
</ol>
4. 总RNA提取
<ol>
	<li>使用新鲜收集的细胞。按照步骤 2.2 所述，对 70% 汇合度的细胞培养物（本实验使用 HeLa-Cre 细胞）进行胰蛋白酶消化处理。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟收集细胞沉淀，并用 1× PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤一次；重复离心一次。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 1 mL 的 1× PBS 中，并转移至 1.5 mL 微量离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>称量干燥的细胞沉淀，并相应调整溶液体积和离心管规格。每 1 mg 细胞可获得约 1 µg 总 RNA。</li>
	<li>在通风橱中，向细胞沉淀中加入 500–1,000 µL 苯酚/氯仿试剂（理想情况下，每 0.25 g 细胞加入 750 µL），通过反复吹打并涡旋混合使其充分均质化。</li>
	<li>室温（20 °C 至 25 °C）孵育 5 分钟，以确保核蛋白复合物完全解离。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，每使用 1 mL 苯酚:氯仿试剂加入 200 µL 氯仿。盖紧管盖。</li>
	<li>剧烈振荡 15 秒（手动或低速短暂涡旋），并在室温（20 °C 至 25 °C）孵育 2 至 3 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 12,000 × g 离心 15 分钟。</li>
	<li>检查是否存在下层红色苯酚-氯仿相、中间相以及上层无色水相。RNA 保留在上层水相中。在通风橱中，小心吸取水相，避免接触中间相，并转移至新管中。</li>
	<li>向水相中加入与所用苯酚/氯仿体积比为 1:1 的分子生物学级异丙醇（400 µL），并在每管中加入 2 µL 甘油原（有助于观察沉淀形成），混匀以沉淀 RNA。</li>
	<li>手动剧烈振荡或用枪头混匀约 10 秒。在 −20 °C 孵育 15 分钟或过夜。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 12,000 × g 离心 20 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>向 RNA 沉淀中加入 3 倍体积的 100% 乙醇（约 1 mL，使用 DEPC 水配制），涡旋混匀，直至沉淀从管底脱离并悬浮于液体中，以洗涤 RNA 沉淀。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 7,500 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>向 RNA 沉淀中加入 1 mL 75% 乙醇洗涤一次，涡旋混匀直至沉淀从管底脱离并悬浮于液体中。重复步骤 4.17 所述的离心操作。</li>
	<li>额外进行 5 秒短暂离心，使管壁残留液体聚集至管底，随后用移液器小心吸除残留液体，注意勿扰动沉淀。</li>
	<li>打开管盖，在室温下短暂空气干燥 RNA 沉淀 3–5 分钟，然后将其溶解于 20–50 µL 无 RNase 的 DEPC 处理水中。在 55–60 °C 孵育 10 分钟，以促进沉淀充分重悬。</li>
</ol>
5. 总RNA浓度与质量的测定
<ol>
	<li>使用分光光度计在 260 nm 和 280 nm 处测量吸光度，以确定 RNA 浓度。在将样品用于下游应用之前，获取完整的光谱数据。</li>
	<li>通过在 0.5X TBE 缓冲液（45 mM Tris 碱，45 mM 硼酸，1 mM EDTA）中使用 1.5% 琼脂糖凝胶电泳 800–1000 ng 的 RNA 来控制 RNA 质量。总 RNA 会分离成对应于 28S 和 18S rRNA 的两条条带。
	<ol>
		<li>所有试剂均使用经 DEPC 处理的水配制，并用该水清洗凝胶电泳所用的全部设备。DEPC 处理水的制备方法：在通风橱内，将 1 mL 二乙基焦碳酸酯加入 1000 mL 超纯水中，室温或 37 °C 下孵育约 2 小时，随后进行高压灭菌。可于室温下保存长达 10 个月。 
		注意：哺乳动物总 RNA 的电泳会导致 28S 和 18S rRNA 分离，其条带强度比约为 2:1。条带应完整且清晰可见为两条锐利的带；降解的 RNA 会导致条带模糊。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 逆转录
<ol>
	<li>使用 1 µg 总 RNA 设置逆转录反应。</li>
	<li>使用逆转录酶（见材料表）和 50 ng/µL 随机十聚体引物进行逆转录（RT）。
	<ol>
		<li>在 10 µL 体系中混合 RNA、随机引物和 1 mM dNTP 混合物（10 mM）。在 65 °C 孵育 5 分钟，然后置于冰上 1 分钟。加入以下试剂：1× RT 缓冲液、5 mM MgCl2、10 mM DTT、40 U RNase 抑制剂和 200 U 逆转录酶。</li>
		<li>在 25 °C 孵育 10 分钟，然后在 50 °C 孵育 1 小时（若使用不同酶，温度可作调整）。在 85 °C 孵育 5 分钟以终止反应。cDNA 可在 −20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 定量 PCR
<ol>
	<li>在最终体积为15的条件下组装反应 &#181;L，混合3 &#181;cDNA 的 L（100 纳克/微升）&#181;L），每种引物 3.2 pmol，6 &#181;L 含有 dNTPs 和酶的混合液，以及 2.8 &#181;超纯水 L 
	注意：使用内源性组成型基因的引物作为对照（看家基因），以标准化 HuR mRNA 和 miRNA 的表达水平。 &#946;-肌动蛋白（Actin）和snRNA U6（RNU6B）可分别用于mRNA和miRNA的标准化，但根据具体情况，其他基因也可能适用。</li>
	<li>使用 delta-delta Ct (2-&#916;&#916;Ct）法20.</li>
</ol>
8. 报告基因检测
<ol>
	<li>用于检测的细胞
	<ol>
		<li>按如下方法将质粒转染至 HeLa-Cre 细胞：先转染 pTK-Renilla（40 ng），然后转染 pRD-miR-17-92，获得 HeLa-Cre-miR-17-92 细胞系，并用 1 µg/mL 嘌呤霉素进行筛选。</li>
		<li>分别将 pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR 或 pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR 转染至 HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla 细胞中，使用青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 µg/mL）进行筛选。这些转染操作分别产生 Luc-RAP-1-B 和 Luc-scrambled 细胞系。</li>
		<li>将细胞转染 pFLAG-HuR 或空载体 pFLAG（第 3 步）。</li>
		<li>按照步骤 2.2 中详述的方法进行细胞培养，培养 HeLa-Cre miR-17-92-luc、HeLa-Cre miR-17-92-scrambled、HeLa-Cre miR-17-92-HuR 和 HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc 细胞，直至细胞融合度达到约 80%。加入 1 µL 多西环素（1 µg/mL），在 37 °C 下诱导 30 分钟。同时，将所有细胞在相同时间内不加多西环素作为对照。 
		注意：多西环素的最终浓度取决于所选细胞系。过多的多西环素可能对哺乳动物细胞具有毒性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>发光检测
	<ol>
		<li>为定量并比较不同发光强度，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒。将荧光素酶检测试剂溶液解冻，并在开始检测前置于室温下平衡。</li>
		<li>通过将 200 µL 底物加入 10 mL Luciferase Assay Buffer II 中，配制 Stop and Glo 混合液（蓝色盖管）；通过将 10 mL Luciferase Assay Buffer II 加入 Luciferase Assay Substrate II 的棕色瓶中，充分混匀，配制 LAR II 混合液（绿色盖管）。</li>
		<li>将配制好的溶液转移至预先标记并避光的 15 mL 离心管中。 
		注意：作为替代方案，可将溶液预先分装为 1–2 mL 的等分试样，用铝箔包裹避光，于 −80 °C 冻存。</li>
		<li>使用如 Synergy 等仪器进行发光检测，以相对光单位（RLU）测量荧光素酶表达量。</li>
		<li>将结果导出至电子表格，用于后续统计分析。</li>
		<li>以对照 Renilla 荧光素酶活性对萤火虫荧光素酶活性进行归一化处理（荧光素酶/Renilla），并将结果以相对光单位（RLU）形式绘制成图。对有和无多西环素诱导的组别均重复此步骤。</li>
		<li>计算均值及均值标准误（SEM）。采用 Student t 检验或双因素方差分析（two-way ANOVA）结合 Tukey 事后检验进行组间比较。这些分析可通过 GraphPad Prism 等软件包完成。以 p 值 &#60; 0.05 视为差异具有统计学意义。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Chang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELAVL1+regulates+alternative+splicing+of+eIF4E+transporter+to+promote+postnatal+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).</li>
<li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+therapeutics+targeting+the+mRNA-binding+protein+HuR+using+3DNA+nanocarriers+suppresses+ovarian+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth.</a> Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).</li>
<li>Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuR+regulates+cyclin+A+and+cyclin+B1+mRNA+stability+during+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation.</a> The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).</li>
<li>Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-16+modulates+HuR+regulation+of+cyclin+E1+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).</li>
</ol>

作者无利益冲突。

前体mRNA剪接是基因表达调控的重要过程，对其调控可显著影响细胞表型的改变22,23。在人类中，超过70%的miRNA由内含子转录而来，我们推测其加工与成熟过程可能受到剪接调控蛋白的促进24,25。我们建立了一种在培养细胞中分析内含子miRNA加工与功能的方法。该检测方法使用四种不同的质粒，可检测内源性、外源性或诱导性miRNA的成熟过程。本文所述方法可在2至3天内完成，且无需使用昂贵的试剂。
鉴于HuR是一种对mRNA稳定性至关重要的RNA结合蛋白，且能与miR-18和miR-19a miRNA发生共免疫沉淀17，本实验旨在验证其是否可促进内含子miRNA的生成与成熟。HuR并不位于剪接体的核心，但可与参与mRNA稳定化的蛋白质相互作用<sup class="xre...

前体mRNA剪接是真核生物基因表达调控的重要过程1。内含子的切除和外显子在成熟RNA中的连接由剪接体催化完成，剪接体是一种分子量为2兆道尔顿的核糖核蛋白复合物，由5种snRNA（U1、U2、U4、U5和U6）以及超过100种蛋白质组成2,3。剪接反应在转录过程中同时发生，剪接体在每个新的内含子上组装，其组装过程由外显子-内含子边界及内含子内部保守剪接位点的识别所引导4。尽管剪接体复合物及其组分高度保守，不同内含子的剪接速率仍可能存在差异。除了剪接位点保守性差异之外，分布于内含子和外显子上的调控序列可招募RNA结合蛋白（RBP），从而促进或抑制剪接过程5,6。HuR是一种广泛表达的RNA结合蛋白，在调控mRNA稳定性方面具有重要作用7。我们课题组先前的研究结果表明，HuR能够结合含有miRNA的内含子，提示该蛋白可能在促进miRNA的加工与成熟过程中发挥关键作用，同时也可导致可变剪接异构体的产生6,8,9。
许多微小RNA（miRNA）由内含子序列编码。其中一些miRNA是内含子的一部分，而另一些被称为“mirtron”，由整个内含子形成10,11。miRNA是一类短链非编码RNA，长度介于18至24个核苷酸之间12。其成熟序列与mRNA中的靶序列具有部分或完全互补性，从而影响翻译过程和/或mRNA的降解速率。miRNA与靶标的组合可引导细胞产生不同的生物学结果。多个miRNA可促使细胞呈现促肿瘤或抗肿瘤表型13。致癌性miRNA通常靶向具有抑制功能的mRNA，导致细胞增殖、迁移和侵袭能力增强14。相反，肿瘤抑制性miRNA可能靶向致癌性mRNA或与细胞增殖增强相关的mRNA。
miRNA 的加工和成熟过程也取决于其来源。大多数内含子 miRNA 的加工需要微处理器（microprocessor）的参与，该复合物由核糖核酸酶 Drosha 和蛋白质辅助因子组成12。mirtron 类 miRNA 则独立于 Drosha，由剪接体（spliceosome）催化其加工过程15。鉴于在内含子中发现 miRNA 的频率较高，我们推测参与剪接的 RNA 结合蛋白也可能促进这些 miRNA 的加工与成熟。值得注意的是，RNA 结合蛋白 hnRNP A2/B1 已被发现与微处理器及 miRNA 的生成相关联16。
我们先前报道过，通过质谱分析发现多种RNA结合蛋白（如hnRNPs和HuR）与内含子miRNA相关联17。通过免疫沉淀和in silico分析已证实，HuR（ELAVL1）与miR-17-92内含子簇来源的miRNA存在相互作用9。miR-17-92是一个由六个miRNA组成的内含子miRNA簇，在多种癌症中表达上调18,19。该簇也被称为“oncomiR-1”，包含miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20、miR-19b和miR-92a。miR-19a和miR-19b是该簇中致癌性最强的miRNA之一19。HuR表达升高可促进miR-19a和miR-19b的合成9。由于该miRNA簇两侧的内含子区域与HuR相关联，我们建立了一种方法来研究该蛋白是否能够调控miR-19a和miR-19b的表达与成熟过程。我们假设的一个重要推论是：作为调控蛋白，HuR可能促进miRNA的生成，从而导致表型改变。但也存在另一种可能性，即miRNA虽在HuR刺激下被加工，却未能成熟或不具备功能，因此该蛋白的作用不会直接影响表型。为此，我们开发了一种剪接报告基因检测方法，用于探究HuR等RNA结合蛋白（RBP）是否能够影响内含子miRNA的生物合成与成熟过程。通过验证miRNA的加工与成熟，本检测方法可显示目标序列的相互作用以及成熟且具有功能的miRNA的生成。在本实验中，我们将内含子miRNA簇的表达与荧光素酶质粒偶联，以检测培养细胞中miRNA对靶标的结合能力。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;重组DNA&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS-Cre（表达Cre的质粒）</td><td></td><td></td><td>E. Makeyev 惠赠，来自 Khandelia 等人，2011</td></tr><tr><td>pFLAG-HuR</td><td></td><td></td><td>本研究工作中生成</td></tr><tr><td>pmiRGLO-RAP-IB</td><td></td><td></td><td>本研究中生成</td></tr><tr><td>pmiRGLO-随机序列</td><td></td><td></td><td>本研究中生成</td></tr><tr><td>pRD-miR-17-92</td><td></td><td></td><td>本研究中生成</td></tr><tr><td>pRD-RIPE-供体质粒</td><td></td><td></td><td>E. Makeyev 惠赠，来自 Khandelia 等，2011</td></tr><tr><td>pTK-Renilla</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗β-肌动蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>抗-HuR</td><td>细胞信号传导</td><td>mAb&amp;nbsp;12582</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680CW 山羊抗小鼠 IgG</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW 山羊抗兔 IgG</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>929-70020</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;实验模型：细胞系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-Cre</td><td></td><td></td><td>E. Makeyev 的惠赠，来自 Khandelia 等人，2011</td></tr><tr><td>HeLa-Ce miR17-92</td><td></td><td></td><td>本研究工作中生成</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-HuR</td><td></td><td></td><td>本研究中生成</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc</td><td></td><td></td><td>本研究工作中产生</td></tr><tr><td>HeLa-Ce miR17-92-luc</td><td></td><td></td><td>本研究工作中生成</td></tr><tr><td>HeLa-Ce miR17-92-乱序对照</td><td></td><td></td><td>本研究中生成</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学品与多肽&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/高糖</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>多西环素</td><td>BioBasic</td><td>MB719150</td><td></td></tr><tr><td>双荧光素酶报告基因检测系统</td><td>Promega</td><td>E2940</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ER0271</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0301</td><td></td></tr><tr><td>遗传霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E859-EG</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pFLAG-CMV&amp;trade;-3 表达载体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6783</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA 聚合酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10966-030</td><td></td></tr><tr><td>pmiR-GLO</td><td>Promega</td><td>E1330</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>RNAse OUT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>752899</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV 试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18091050</td><td></td></tr><tr><td>Trizol-LS 试剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA 10倍浓缩液</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>普洛麦格</td><td>R616A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;寡核苷酸&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>正向 RAP-1B pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG&lt;br/&gt; CTACTATATCAGTTTGCACAT</td><td></td></tr><tr><td>反向 RAP-1B pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>CTAGATGTGCAAACTGATATAGT&lt;br/&gt; AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td><td></td></tr><tr><td>反向随机 pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA&lt;br/&gt; GCTACTATATCAGGGGTAAAAT</td><td></td></tr><tr><td>反向随机化 pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>CTAGATTTTACCCCTGATATAGT&lt;br/&gt; AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td><td></td></tr><tr><td>正向 HuR pFLAG</td><td>Exxtend</td><td>GCCGCGAATTCAATGTCTAAT&lt;br/&gt; GGTTATGAAGAC</td><td></td></tr><tr><td>反向 HuR pFLAG</td><td>Exxtend</td><td>GCGCTGATATCGTTATTTGTG&lt;br/&gt; GGACTTGTTGG</td><td></td></tr><tr><td>pre-miR-1792 正向 pRD-RIPE</td><td>Exxtend</td><td>ATCCTCGAGAATTCCCATTAG&lt;br/&gt; GGATTATGCTGAG</td><td></td></tr><tr><td>反向 pre-miR-1792 pRD-RIPE</td><td>Exxtend</td><td>ACTAAGCTTGATATCATCTTG&lt;br/&gt; TACATTTAACAGTG</td><td></td></tr><tr><td>U6 小核 RNA（RNU6B）正向</td><td>Exxtend</td><td>CTCGCTTCGGCAGCACATATAC</td><td></td></tr><tr><td>小核RNA U6（RNU6B）反向</td><td>Exxtend</td><td>GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG</td><td></td></tr><tr><td>B-Actin qPCR 正向引物</td><td>Exxtend</td><td>ACCTTCTACAATGAGCTGCG</td><td></td></tr><tr><td>逆转录 B-Actin qPCR</td><td>Exxtend</td><td>CCTGGATAGCAACGTACATGG</td><td></td></tr><tr><td>HuR 荧光定量 PCR 正向引物</td><td>Exxtend</td><td>ATCCTCTGGCAGATGTTTGG</td><td></td></tr><tr><td>反向 HuR qPCR</td><td>Exxtend</td><td>CATCGCGGCTTCTTCATAGT</td><td></td></tr><tr><td>前向 pre-miR-1792 qPCR</td><td>Exxtend</td><td>GTGCTCGAGACGAATTCGTCA&lt;br/&gt; GAATAATGTCAAAGTG</td><td></td></tr><tr><td>逆转录 pre-miR-1792 qPCR</td><td>Exxtend</td><td>TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC&lt;br/&gt; TCAACAGGCCG</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件与算法&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 8 for Mac OS X</td><td>Graphpad</td><td>https://www.graphpad.com</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>http://imagej.nih.gov/ij</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于分析哺乳动物细胞中内含子microrna成熟的报告基因检测方法

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

microRNA（miRNA）是一类在真核生物中广泛存在的短链RNA分子。大多数miRNA由内含子转录而来，其成熟过程涉及细胞核内多种RNA结合蛋白。成熟的miRNA通常介导基因沉默，这一特性已成为研究转录后调控事件的重要工具。此外，该机制还可被开发为一种具有前景的基因治疗策略。然而，目前尚缺乏直接检测哺乳动物细胞培养中miRNA表达的有效方法。本文介绍一种高效且简便的方法，可通过验证miRNA与其靶序列的相互作用，辅助研究miRNA的生成与成熟过程。该系统利用可被多西环素诱导的启动子，能够高效、低成本地调控初级miRNA（pri-miRNA）的转录，从而将外源性miRNA的成熟过程与其内源性活性分离开来。此外，该工具允许通过独立的质粒对RNA结合蛋白进行调控。除适用于多种不同的miRNA及其相应靶标外，该系统还可适配于多种细胞系，前提是这些细胞系可被有效转染。

我们最初的假设是，HuR 可能通过结合 pre-miRNA 序列促进内含子来源的 miRNA 生成。因此，HuR 表达与 miR-17-92 基因簇生成之间的关联可能揭示调控这些 miRNA 成熟的新机制。在三种不同细胞系（HeLa、BCPAP 和 HEK-293T）中，转染 pFLAG-HuR 后均证实了 HuR 的过表达（图 2）。作为对照，使用了未转染的细胞以及转染空 pFLAG 载体的细胞。重要的是，我们观察到在这些细胞中 HuR 的过表达促进了 miR-19a 的表达（Gatti da Silva 等人9报道的补充 表 1 结果）。
为了证实所诱导的miRNA确实具有功能，进行了一项 体外 报告系统设计如本处所述。pRD-RIPE 载体中的人工内含子将 eGFP 的两个编码区隔开。该表达盒受四环素响应元件（TRE）调控。因此，eGFP 的表达由细胞培养基中抗生素多西环素（DOX）...

我们开发了一种可用于细胞的内含子微小RNA（microRNA）生成报告检测方法 体外 使用四种质粒：一种携带内含子miRNA，一种携带靶序列，一种用于过表达调控蛋白，一种用于Renilla荧光素酶。miRNA被加工处理后，可通过结合靶序列来调控荧光素酶的表达。

一种用于分析哺乳动物细胞中内含子microRNA成熟的报告基因检测方法

微小RNA（miRNA）是一类在真核生物中广泛存在的短链RNA分子。大多数miRNA由内含子转录而来，其成熟过程涉及……

我们的实验方案直接从细胞培养物出发，研究调控性RNA结合蛋白对microRNA生成与成熟过程的影响。所描述的方法可使用常见的细胞培养试剂完成，且相对快速。该方法对于研究microRNA及其靶基因在不同类型的真核细胞中的表型效应具有重要意义。可使用正常细胞或具有疾病特征的细胞。为通过荧光素酶活性观察靶标亲和力的变化，选择易于转染的细胞系并进行充分的转染和诱导对照实验至关重要。实验开始时，将细胞培养于添加高糖的DMEM培养基中，置于100毫米的培养皿内，并在37°C、含5%二氧化碳的湿润恒温培养箱中孵育。为了消化贴壁细胞，将细胞与胰蛋白酶-EDTA溶液在37摄氏度下孵育3至5分钟。进行转染时，将200纳克DNA和1.25微升转染试剂加入100微升培养基中混合，然后将转染混合物加入细胞中。随后，将细胞与转染混合物在37摄氏度下孵育4小时。然后更换为含10% FBS的培养基，继续培养24小时后再加入抗生素进行筛选。转染pFLAG-HuR和MT-pFLAG至HeLa细胞后，通过将遗传霉素（Geneticin）浓度从100微克/毫升逐步增加至1000微克/毫升进行细胞筛选，建立稳定表达细胞系。随后，使用针对HuR mRNA的特异性引物，通过定量PCR验证过表达效果。将40纳克pTK-Renilla质粒和pRD miR 17-92质粒共转染至HeLa-Cre细胞中，获得HeLa-Cre miR 17-92细胞系，并用1微克/毫升嘌呤霉素进行筛选。随后，分别将pTK-Renilla质粒与pmirGLO RAB1B 3'UTR或pmirGLO scrambled 1B 3'UTR质粒转染至HeLa-Cre miR 17-92细胞中。接着，使用青霉素和链霉素进行筛选，获得luc RAB1B和luc scrambled细胞系。接下来，按照先前所述方法，用 pFLAG-HuR 或 MT-PFLAG 转染细胞。继续培养 HeLa-Cre miR 17-92 luc、HeLa-Cre miR 17-92 scrambled、HeLa-Cre miR 17-92 HuR 和 HeLa-Cre miR 1792 HuR lock 细胞，直至细胞融合度达到约 80%。然后，在 37°C 条件下加入 1 微升多西环素诱导 30 分钟，同时将所有未加多西环素的细胞作为对照组，在相同时间内进行相同处理。为了定量和比较不同的发光强度，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒。在开始检测之前，将荧光素酶检测试剂溶液解冻并置于室温下。接下来，通过将200微升底物与10毫升荧光素酶检测试剂缓冲液二混合，配制Stop and Glo混合液。然后将 10 毫升荧光素酶检测试剂缓冲液二加入荧光素酶检测试剂底物二的棕色小瓶中，配制混合液 LAR II，并充分振荡混匀。随后，将溶液转移至预先标记并避光保存的 15 毫升离心

a-reporter-assay-to-analyze-intronic-microrna-maturation-mammalian

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

一种报告基因检测法，用于分析哺乳动物细胞中内旋微RNA成熟

本文介绍了一种检测方法，该方法结合显微注射与荧光原位杂交技术，以准确测定哺乳动物体细胞中mRNA的核输出动力学。...

哺乳动物细胞中mRNA核输出动力学的显微注射分析

microRNA（miRNA）是基因表达的重要调控因子，已被证明在多种生物学过程中发挥作用。为了更深入地理解miRNA与非翻译区（UTR）之间的相互作用，我们构建了一个全基因组范围的3'...

利用3'非翻译区报告基因构建体和microRNA模拟物在贴壁细胞中使用LightSwitch荧光素酶检测系统鉴定人类microRNA靶标

在本视频中，我们证明在存在磷酸二酯酶抑制剂的情况下，卵母细胞的细胞周期会停滞在第一次减数分裂前期，此时转录的 mRNA 在无翻译的情况下被储存。当抑制剂被去除后，卵母细胞的成熟过程恢复，细胞进入第一次减数分裂中期。在第一次减数分裂中期，与目标基因融合的报告 mRNA...

体外单卵母细胞报告基因检测：一种研究体外卵母细胞成熟过程中靶mRNA翻译调控的技术

基因报告基因检测是一种成熟且强大的工具，用于解析DNA序列与其基因调控活性之间的关系。将候选调控元件与携带可识别序列标签的报告基因相偶联，可实现这些检测的大规模平行化。...

在培养的哺乳动物细胞中进行大规模平行报告基因分析

为了表征miRNA在分化的人类神经干细胞（hNSCs）中的变化，本文描述了在三维系统中进行hNSC分化的方法、通过miRNA...

三维培养条件下人神经干细胞系的分化、microRNA及潜在靶基因分析

本文提出一种策略，利用公共可获取的数据、计算资源以及在转染靶向特定转录因子的小发夹（sh）RNA后通过microRNA芯片获得的高通量数据，研究该转录因子对microRNA转录组的影响。...

描述转录因子依赖性调控microRNA转录组

本报告描述了一种快速且可靠的细胞miRNA mRNA靶标验证方法。该方法利用合成的生物素标记的锁核酸（Locked Nucleic Acid,...

基于生物素的下拉实验验证细胞miRNA的mRNA靶标

micro-RNAs（miRNAs）是一类短小且高度同源的RNA序列，可作为信使RNA（mRNAs）的转录后调控因子。目前的miRNA检测方法在灵敏度和特异性方面存在差异。本文描述了一种结合了 原位...

利用小鼠心脏切片进行组织特异性miRNA表达谱分析 原位 杂交

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一种体外评估肿瘤细胞中microRNA水平、功能及相关靶基因的实验方案

本方案描述了一种报告基因检测方法，用于研究单个卵母细胞中mRNA翻译的调控过程 体外...

利用单卵母细胞报告基因检测法定义体外成熟过程中母源mRNA翻译程序

本方案描述了一种微型基因报告基因检测方法，用于监测5´剪接位点突变对剪接的影响，并开发了用于挽救突变所致剪接抑制的抑制性U1 snRNA。将报告基因和抑制性U1...

基于报告基因的细胞检测法用于监测剪接效率

学习一种报告基因检测法，用于分析哺乳动物细胞中内源微RNA成熟过程。该方法利用荧光素酶活性评估miRNA与靶标结合效率，适用于研究RNA结合蛋白对微RNA生物合成的调控作用。

一种用于分析哺乳动物细胞中内含子microRNA成熟的报告基因检测方法

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