Name: TNBS诱导的啮齿动物模型研究机械应力在克罗恩病中的致病作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: 了解TNBS诱导的啮齿动物模型用于研究机械应力在克罗恩病中的致病作用。该模型通过结肠内灌注TNBS诱导透壁炎症，模拟狭窄性克罗恩病，帮助研究者比较炎症部位与近端机械扩张部位的差异。

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本研究工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目编号：R01 DK124611，授予 XZS）和美国国防部（项目编号：W81XWH-20-1-0681，授予 XZS）资助的支持。&#160;组织学工作得到了德克萨斯大学医学分部（UTMB）外科病理学实验室的帮助。

所有动物实验均按照德克萨斯大学医学分部机构动物护理与使用委员会的规定进行（编号：#0907051C）。实验使用约8至9周龄的雄性或雌性Sprague-Dawley大鼠。
1. 动物准备
<ol>
	<li>禁食大鼠24小时，并在夜间给予泻药（肠道清洁剂，参见材料表）处理。</li>
	<li>次日，使用麻醉系统（参见材料表），在给予TNBS期间以1 L/min的氧气流速联合2%异氟烷对大鼠进行麻醉。通过检查反射或轻捏足趾确认麻醉效果。</li>
	<li>根据大鼠体重配制新鲜的TNBS溶液。 
	&#8203;注：使用的TNBS剂量为每公斤体重65 mg，溶于250 µL含40%乙醇的生理盐水中&#160;。</li>
	<li>将大鼠仰卧固定于麻醉台上。为诱导结肠炎，经肛门插入医用级开放式聚氨酯导管，深度约为肛缘起7–8 cm，缓慢将TNBS溶液（按步骤1.3配制）注入结肠19。对照假手术组大鼠仅给予250 µL生理盐水。</li>
	<li>注入TNBS或生理盐水后，将大鼠保持仰卧位并略微头低脚高位（约30°），同时闭合肛门2分钟，以促进TNBS在结肠内的分布并防止外溢。</li>
	<li>术后自由饮水和进食，持续7天，每日观察并记录大鼠的体重、摄食量、粪便性状及总体健康状况。</li>
</ol>
2. 组织制备
<ol>
	<li>在安乐死当天，使用 CO2 吸入法对大鼠实施安乐死，并通过颈椎脱位确认死亡。</li>
	<li>使用外科手术剪和镊子打开大鼠腹腔。</li>
	<li>小心取出整个结肠（肛管以上部分），并立即将结肠转移至预冷的 1× HBSS 缓冲液中。</li>
	<li>在缓冲液中将结肠拉直，用直尺测量结肠长度。使用尼龙线围绕结肠，测量对照组和 TNBS 处理组大鼠结肠节段的外部周长。取全层组织用于组织学分析。</li>
	<li>沿肠系膜缘将结肠切开，并用 HBSS 缓冲液充分清洗结肠。根据先前描述的标准19并稍作修改，对结肠进行宏观炎症评分。 
	注意：0 = 黏膜正常；1 = 局部充血，无糜烂或溃疡；2 = 溃疡和狭窄（病变区域 &#60; 5 mm）；3 = 严重溃疡、瘢痕及狭窄（病变区域 &#62; 5 mm）。</li>
	<li>分别从 TNBS 处理组大鼠的 P 位点（炎症部位近端 2–3 cm 处）、I 位点（炎症部位，通常距结肠末端 4–6 cm，TNBS 灌注处）和 D 位点（炎症部位远端 1–2 cm 处）采集结肠组织样本。 
	注意：每个节段取长约 ~1–2 cm 的结肠组织。此外，从生理盐水处理组大鼠距结肠末端约 4–6 cm 处取 2 cm 长的结肠组织作为假手术对照（S）（图 1）。</li>
	<li>从每个位点取组织样本用于全层制备，如需要，还可分别取黏膜/黏膜下层和肌层组织21,22。</li>
	<li>先将组织样本在液氮中速冻，然后于 -80 °C 保存，可保存长达一年，用于后续实验（如 RNA 制备）。</li>
</ol>
3. 肠道炎症与纤维化的组织病理学评估
<ol>
	<li>将全层结肠组织置于10%福尔马林中固定48小时，然后转移至70%乙醇中处理24-48小时。</li>
	<li>使用切片机对石蜡包埋组织进行切片，厚度为5 µm，分别用于苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色和马松三色染色6,19,23（参见材料表）。</li>
	<li>使用配备高分辨率相机及配套软件的正置显微镜采集并观察图像（参见材料表）。</li>
	<li>由两名独立的研究人员（包括一名胃肠外科病理学家）根据既往文献描述的标准6,23并稍作修改后，对炎症和纤维化指数进行评分。评分细则见补充文件1。</li>
	<li>在每张H&amp;#38;E染色标本的四个视野中测量横行肌层和纵行肌层的厚度及细胞数量，并对每个标本的四次测量值取平均值。</li>
</ol>
4. RNA 提取与定量 RT-PCR
<ol>
	<li>使用RNA提取试剂盒的裂解试剂（见材料表）对假手术对照组及TNBS结肠炎大鼠三个部位（P、I、D）切除的结肠组织进行匀浆处理。</li>
	<li>利用该试剂盒从每个样本中提取RNA，并用30 µL无RNase的水洗脱RNA沉淀。</li>
	<li>使用微量紫外-可见分光光度计（见材料表）测定RNA浓度并检测其纯度。</li>
	<li>取1 µg总RNA，使用cDNA合成试剂盒（见材料表）合成cDNA21,22。</li>
	<li>以50 ng cDNA为模板，采用商业实时PCR试剂盒（见材料表），联合IL-6和CTGF的探针进行实时PCR，分析并定量基因表达水平。</li>
	<li>使用对照基因18S rRNA对样本进行标准化，并基于获得的Cq值量化相对基因表达水平。</li>
</ol>
5. 统计分析
<ol>
	<li>使用统计分析软件（参见材料表）比较假手术对照组与TNBS结肠炎大鼠。</li>
	<li>若p值&#60;0.05，则认为具有统计学显著性15,19。</li>
	<li>为检验两组之间的差异，采用Student's t检验分析；若比较的组别超过两组，则进行ANOVA检验15,19。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突，无可披露内容。

TNBS诱导的结肠炎于1989年被首次建立&#160;，并自此作为克罗恩病的实验模型被广泛应用19,20,23。该模型在啮齿类动物中的显著特征是出现透壁性炎症，其组织病理学病变与人类克罗恩病高度相似19,20。以往对该模型的研究主要集中在肉眼可见炎症部位（部位I）黏膜层的异常免疫反应19,20,23。而对于炎症近端和远端的肠段则关注较少。本研究针对炎症部位、扩张的近端肠段以及未扩张的远端肠段，揭示了基因表达、炎症反应及组织病理学特征方面明显的部位特异性变化。该模型被重新审视，以探讨机械应力在克罗恩病纤维化及组织重塑中的潜在致病作用。
<p cl...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63499">A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn&#39;s Disease</a>. The Introduction and Protocol were updated.
The first sentence of the Introduction was updated from:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn&#39;s disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
to:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn&#39;s disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
Step 1.3 in the Protocol was updated from:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights. 
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 &#181;L of 40% ethanol was used.
to:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights. 
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 &#181;L of 40% ethanol/saline was used.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63499">A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn&#39;s Disease</a>. The Introduction and Protocol were updated.

Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease

炎症性肠病（IBD），包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD），其特征是胃肠道（GI）出现慢性炎症，影响约100万至200万美国人1。在美国，IBD治疗的年度估计费用为118亿美元。与UC不同，CD的特征是透壁性炎症和狭窄形成2,3。高达70%的CD患者会出现狭窄（stenosis）3，其可能由透壁性炎症（炎性狭窄）或肠道纤维化（纤维性狭窄）引起4,5。肠道纤维化以过量的胶原沉积和其他细胞外基质（ECM）为特征，其中平滑肌细胞（SMC）是参与该过程的主要间充质细胞类型之一3,4。与肥大相关的平滑肌增生是CD纤维性狭窄中的另一重要组织学改变6。尽管CD中的狭窄形成与慢性炎症相关，但除手术治疗外，尚无有效的抗炎治疗方法2,6。然而，在足够长的时间内，术后复发率几乎达到100%2,7。作为一种炎症反应，纤维化和平滑肌细胞增生也可能在肠道的非炎症性条件下（如肠梗阻）发生8,9；目前认为，狭窄形成涉及炎症依赖性和非依赖性两种机制3,4。鉴于大量针对炎症依赖性机制的研究尚未转化为任何有效的狭窄治疗手段，亟需开展研究以探讨炎症非依赖性机制在肠道纤维化中的可能作用。
作为一种非炎症性因素，与水肿、炎性细胞浸润、组织变形、纤维化和狭窄相关的机械应力（MS）10,11,12,13 在炎症性肠病（IBD）中常见，尤其是以透壁性炎症为特征的克罗恩病（CD）。在狭窄型CD中，机械应力尤为显著，此时炎症部位的狭窄（炎症性或纤维性）对局部组织产生机械应力，并导致梗阻部位近端肠段管腔扩张。10,14. 之前 体外 研究表明，机械应力会改变特定炎症介质（如 COX-2、IL-6）的基因表达8,14,15 以及胃肠道组织（尤其是肠道平滑肌细胞（SMC））中的生长因子（如TGF-β）16最近的研究还发现，某些特异性促纤维化介质（如结缔组织生长因子（CTGF））的表达对机械应力高度敏感。17,18人们曾假设机械应力可能在克罗恩病（CD）相关的炎症、纤维化和组织重塑中发挥独立的致病作用。然而，机械应力在克罗恩病肠道炎症、纤维化以及平滑肌增生中的致病意义仍基本未被探索。这部分可能是因为炎症相较于机械应力更为明显且研究更为充分。更重要的是，目前尚无明确定义的炎症性肠病（IBD）动物模型，可用于区分机械应力与炎症各自的作用。
本研究描述了一种通过向结肠内注射半抗原试剂2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）19,20诱导的类似克罗恩病（CD）的啮齿类动物结肠炎模型，可用于研究机械应力在克罗恩病中的作用。研究发现，TNBS灌注可在远端结肠引起局限性（长约2 cm）透壁性炎症，并伴随肠腔狭窄（狭窄）。该狭窄导致灌注部位近端结肠节段出现显著的肠管扩张（机械应力）14,15，但无明显炎症表现；相反，狭窄部位远端的结肠节段则既无炎症也无机械应力。在三个不同部位观察到基因表达、炎症、纤维化及平滑肌细胞增生的显著部位特异性变化。结果提示，机械应力——尤其是机械应力诱导的基因表达——可能在克罗恩结肠炎中纤维化和平滑肌细胞增生的发展过程中发挥关键作用。

<table><tbody><tr><td>ACT-1 控制软件 Ver2.63</td><td>Nikon</td><td>DXM1200F</td><td></td></tr><tr><td>带96孔快速反应模块的C1000 Touch梯度PCR仪</td><td>BIO-RAD</td><td>1851196</td><td></td></tr><tr><td>实时荧光定量PCR系统的CFX96光学反应模块</td><td>BIO-RAD</td><td>1845097</td><td></td></tr><tr><td>Dako Agilent Artisan Link Pro全自动组织染色机</td><td>Dako</td><td>AR310</td><td></td></tr><tr><td>Dako-Agilent Masson三色染色试剂盒 货号# AR173</td><td>Dako</td><td>AR173</td><td></td></tr><tr><td>DXM1200数字彩色高分辨率相机</td><td>Nikon</td><td>DXM1200</td><td></td></tr><tr><td>真核生物18S rRNA内参对照</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4352930E</td><td></td></tr><tr><td>E-Z麻醉系统</td><td>E-Z Systems Inc.</td><td>EZ-155</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9</td><td>GraphPad</td><td>9.0.2 (161)</td><td></td></tr><tr><td>硬壳96孔PCR板，低矮型，薄壁，带裙边，白色/透明</td><td>BIO-RAD</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>HBSS（Corning汉克平衡盐溶液，1×，不含钙和镁）</td><td>CORNING</td><td>21-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>HM 325切片机</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-667</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey数字成像系统</td><td>LI-COR</td><td>9120</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler epGradient梯度PCR仪，带控制面板5340</td><td>Eppendorf</td><td>5341</td><td></td></tr><tr><td>医用级开放式聚氨酯导管</td><td>Covidien</td><td>8890703013</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E800正置显微镜</td><td>Nikon</td><td>E800</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜/滤纸夹心组合，每包50片，0.45 &amp;mu;m，7 x 8.5 cm</td><td>BIO-RAD</td><td>1620215</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇3350，渗透性泻药</td><td>Miralax</td><td>C8175</td><td>剂量：17 g溶于226 mL水中</td></tr><tr><td>RNeasy Mini试剂盒（250）&lt;br/&gt; 含250个RNeasy Mini离心柱、收集管（1.5 mL和2 mL）、无RNase试剂与缓冲液</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III第一链cDNA合成系统</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan基因表达检测 Rn00573960_g1 CTGF探针</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan基因表达检测 Rn99999011_m1 IL6探针</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced预混液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Prisma H&amp;E染色试剂盒 #1</td><td>Sakura</td><td>6190</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Prisma &lt;em&gt;Plus &lt;/em&gt;全自动载玻片染色机</td><td>Sakura</td><td>6171</td><td></td></tr><tr><td>TNBS（苦味酸磺酸溶液）</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>92822</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究机械应力在克罗恩病发病机制中作用的tnbs诱导啮齿类动物模型

A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease

炎症性肠病（IBD），如克罗恩病（CD），是一类慢性胃肠道炎症性疾病，在欧洲和美国的发病率约为每1,000,000人中有20例。CD的特征是透壁性炎症、肠道纤维化和管腔狭窄。尽管抗炎治疗可能有助于控制炎症，但对CD中的纤维化和狭窄并无疗效。CD的发病机制尚不明确。目前的研究主要集中在阐明肠道免疫反应失调的机制。虽然CD相关的透壁性炎症、肠道纤维化和管腔狭窄均对肠壁产生机械应力，但机械应力在CD中的作用尚未明确定义。为了确定机械应力是否在CD中具有独立的致病作用，已建立了一种在啮齿类动物中通过TNBS诱导的类似CD结肠炎的实验模型。该TNBS诱导的透壁性炎症和纤维化模型在结肠中再现了CD的病理特征，通过将TNBS灌注至成年Sprague-Dawley大鼠的远端结肠而建立。在此模型中，透壁性炎症导致TNBS灌注部位（部位I）出现狭窄；在灌注部位近端区域（部位P）可观察到机械性扩张，表现为机械应力但无明显炎症；而在炎症部位远端的结肠段（部位D）则既无炎症也无机械应力。在不同部位（P、I和D）观察到基因表达、免疫反应、纤维化及平滑肌生长的显著差异，突显了机械应力的深远影响。因此，这种类似CD的结肠炎模型将有助于我们更深入地理解CD的致病机制，特别是机械应力及其诱导的基因表达在免疫失调、肠道纤维化和组织重塑中的作用。

经结肠内灌注TNBS诱导的类克罗恩病结肠炎的大体观 
如图所示 图1在大鼠中通过直肠内灌注TNBS可诱导局部透壁性炎症（长度约2 cm），表现为灌注部位远端结肠肠壁增厚和管腔狭窄（狭窄）图1A）。TNBS灌注部位称为部位I。由于透壁性炎症和狭窄，部位I同时存在炎症和机械应力。部位I的狭窄导致TNBS灌注部位近端肠段（部位P）出现显著的管腔扩张（图1）。与假手术对照组结肠相比，P点和I点的结肠周长显著增加（p &lt; 0.05 与. 对照）（图1B）。在机械性扩张状态下，P部位未显示明显炎症。相反，TNBS灌注部位远端的结肠节段为D部位，既无炎症也无机械性扩张。图1A，B).
为...

本实验方案描述了在啮齿类动物中建立类似克罗恩病的结肠炎模型。透壁性炎症导致三硝基苯磺酸（TNBS）灌注部位出现狭窄，狭窄近端肠段则出现机械性扩张。这些变化使得研究结肠炎中的机械应力成为可能。

一种用于研究机械应力在克罗恩病发病机制中作用的TNBS诱导啮齿类动物模型

炎症性肠病（IBD）如克罗恩病（CD）是影响胃肠道的慢性炎症性疾病，可累及……

因此，在我们的实验方案中，经结肠灌注TNBS会在灌注部位引起透壁性炎症，并导致炎症近端肠段的机械性扩张。这一过程模拟了狭窄型克罗恩病。由于近端肠段虽存在机械性扩张但无明显炎症表现，通过比较近端肠段与炎症部位，有助于判断机械应力是否在克罗恩结肠炎的发生中起作用。以往的研究仅关注炎症部位。本方案通过在模型的不同部位进行操作，强调了机械应力在克罗恩病，特别是狭窄型克罗恩病中的关键作用。首先，将大鼠仰卧位放置于麻醉台上。为诱导结肠炎，将医用级开放式聚氨酯导管经肛门插入，深度约为距肛缘七至八厘米，缓慢注入TNBS。对照组假手术大鼠给予250微升生理盐水。为促进TNBS或生理盐水在结肠内的分布并防止外溢，将大鼠保持仰卧位，头部向下倾斜约30度，同时闭合肛门持续两分钟。使用外科手术剪和镊子打开大鼠腹部。仔细分离并取出肛管上方的整个结肠，立即将结肠转移至预冷的1× HBSS缓冲液中。在缓冲液中将结肠展直，并用直尺测量结肠长度。取一根尼龙线，围绕结肠测量对照组和TNBS处理组大鼠结肠节段的外部周长。取全层组织用于组织学检查。沿肠系膜缘将结肠剪开，并用HBSS缓冲液彻底清洗结肠。根据预设标准并稍作修改，对结肠进行宏观炎症评分。从经TNBS处理的大鼠结肠组织中采集P、I和D三个部位的样本。P部位位于炎症部位近端（口腔侧）2至3厘米处。I部位为TNBS灌注的炎症部位，通常距离结肠末端4至6厘米。最后，D部位位于炎症部位口侧边缘远端一至两厘米处。在大鼠中经结肠内灌注TNBS可诱导出约两厘米长的局限性透壁性炎症，表现为远端结肠灌注部位肠壁增厚和管腔狭窄。TNBS灌注部位称为I部位。由于透壁性炎症和狭窄的存在，I部位同时存在炎症和机械应力。I部位的狭窄导致TNBS灌注部位近端肠段显著管腔扩张，该区域称为P部位。与假手术对照组结肠相比，P部位和I部位的结肠周长均显著增加。在机械性扩张的情况下，P部位未表现出明显的炎症。相反，TNBS灌注部位远端的结肠段（称为D部位）既无炎症，也无机械性扩张。与假手术对照组相比，TNBS处理组大鼠I部位的炎症宏观评分显著升高，而结肠炎大鼠P和D部位则无此现象。与假手术组相比，P点和D点的炎症评分未见显著升高。因此，在该模型中不仅需要研究I点，还应研究P点和D点，这有助于认识机械应力在克罗恩病中的致病意义。为了进一步确定机械应力是否为肠道炎症的致病因素，还可以尝试通过仅给予动物液体饮食来解除机械性扩张，观察其是否有助于改善炎症和肠道功能。

a-tnbs-induced-rodent-model-to-study-pathogenic-role-mechanical

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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了解TNBS诱导的啮齿动物模型用于研究机械应力在克罗恩病中的致病作用。该模型通过结肠内灌注TNBS诱导透壁炎症，模拟狭窄性克罗恩病，帮助研究者比较炎症部位与近端机械扩张部位的差异。

一种用于研究机械应力在克罗恩病发病机制中作用的TNBS诱导啮齿类动物模型

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