Name: DNA帘法破译组蛋白组装的分子机制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 了解DNA帘法在单分子成像中的应用，用于实时观察Abo1蛋白与DNA的相互作用，揭示组蛋白分子伴侣在染色质动态调控中的机制。该方法克服了传统批量实验的局限，为研究蛋白质-DNA相互作用提供了高通量可视化工具。

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作者感谢韩国科学技术院（KAIST）的Ji-Joon Song教授、Carol Cho博士和Juwon Jang博士在Abo1和Cy5-H3-H4方面提供的大力支持。本研究得到了国家研究基金会资助项目（NRF-2020R1A2B5B01001792）、蔚山科学技术院内部研究基金（1.210115.01）以及基础科学研究所（IBS-R022-D1）的支持。

1. 流通池的制备
<ol>
	<li>按照先前发表的文献报道，制备带有纳米沟槽图案的清洁熔融石英载玻片25.
	<ol>
		<li>在一块洁净的熔融石英载片上钻两个直径为1 mm的孔图1A) 使用金刚石涂层钻头（参见 材料表).</li>
		<li>使用直流溅射法在载玻片上沉积250 nm厚的铝（Al）层32 （参见 材料表) 通入10 mTorr的氩气。</li>
		<li>旋涂一层310 nm厚的4% 950K聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）（参见 材料表在4,000 rpm条件下离心1分钟，并在180 °C的加热板上烘烤3分钟。</li>
		<li>使用电子束（ebeam）光刻技术在两个孔之间的PMMA层上绘制纳米沟道图案33 在80 kV电压下，电流为0.724 nA。 
		注意：纳米沟槽图案的结构和尺寸如图所示 图1A.</li>
		<li>通过将载玻片浸泡在显影液（甲基异丁基酮与异丙醇按1:3比例混合，参见 材料表2分钟</li>
		<li>使用氯气（Cl₂）通过电感耦合等离子体-反应离子刻蚀（ICP-RIE）刻蚀铝层2）和三氯化硼（BCl3）气体。 
		注意：这两种气体可去除电子束曝光区域的 Al。</li>
		<li>使用四氟化硫（SF₄）在载玻片上刻蚀纳米沟槽4四氟化碳（CF₄）4）和氧气（O2）气体（参见 材料表).</li>
		<li>通过将载玻片浸泡在铝蚀刻剂（AZ 300 MIF 显影剂，参见 材料表10 分钟</li>
		<li>制作完成后，用去离子水冲洗载玻片，并在丙酮中使用浴式超声波清洗机超声处理30分钟。</li>
		<li>用2% Hellmanex III溶液清洗载玻片（参见 材料表至少磁力搅拌1天。</li>
		<li>将载玻片依次在丙酮中进行超声处理30分钟，然后在1 M NaOH中进行超声处理30分钟。</li>
		<li>用去离子水冲洗载玻片，并用氮气（N₂）吹干2) 气体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将一张洁净的纸片（5 mm × 35 mm）置于双面胶中央。将胶带贴于载玻片上，覆盖两个孔洞及带有纳米图案的区域，并用纸片固定。</li>
	<li>使用洁净的刀片切除纸片（图1A).</li>
	<li>将玻璃盖玻片置于双面胶带上，用移液器吸头按压盖玻片以形成微流控腔室（图1A).</li>
	<li>将组装好的流动池置于两片显微镜载玻片之间并用夹子固定。</li>
	<li>在120 °C的真空烘箱中烘烤流动池45分钟。</li>
	<li>将流体连接器（Nanoport）连接至用于芯片分析的芯片（参见 材料表使用热熔胶枪将鲁尔锁紧接头管连接至每个开口处，并将两根鲁尔锁紧接头管连接起来。</li>
	<li>连接一个含有3 mL去离子水的鲁尔锁紧式注射器，冲洗腔室。</li>
	<li>用3 mL脂质缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，100 mM NaCl）冲洗腔室 通过 逐滴连接 
	注意：逐滴连接可将所有注射器与流动池相连，以避免将气泡注入腔室。</li>
	<li>向腔室内分两次注入1 mL脂质缓冲液中的0.04x生物素化脂质，每次注射后孵育5分钟。 
	注意：1x 生物素化脂质储备液的制备方法见先前发表的报告34.</li>
	<li>用3 mL脂质缓冲液冲洗腔室，并孵育20分钟，使脂质双层在载玻片表面充分成熟。</li>
	<li>加入1 mL BSA缓冲液（40 mM Tris-HCl，pH 8.0，50 mM NaCl，2 mM MgCl₂）2，以及 0.2 mg/mL BSA），孵育 5 分钟以封闭载玻片表面。 
	注意：此步骤可减少蛋白质与载玻片表面的非特异性结合。</li>
	<li>在1 mL BSA缓冲液中，以两次注射方式加入0.025 mg/mL的链霉亲和素，每次注射后孵育10分钟。</li>
	<li>用 3 mL BSA 缓冲液洗去残留的链霉亲和素。</li>
	<li>向腔室中分两次注入300 pM（30 µL）生物素标记的λ噬菌体DNA（溶于1 mL BSA缓冲液），每次注射后孵育10分钟。 
	&#8203;注意：生物素标记的λ DNA的制备方法见先前发表的文献34.</li>
</ol>
2. 将流动池连接至微流控系统并装载到显微镜上
<ol>
	<li>制备 Abo1 成像缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，100 mM NaCl，1 mM DTT，1 mM ATP，2 mM MgCl₂）2，1.6%葡萄糖，以及0.1x的gloxy，参见 材料表). 
	注意：Gloxy 是一种氧气清除系统，可减少荧光染料的光漂白。含葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的 100 倍浓缩 Gloxy 储存液的配制方法见参考文献35.</li>
	<li>将装有10 mL成像缓冲液的注射器连接至注射泵，并排出微流控系统中所有管路内的气泡。</li>
	<li>将制备好的流动池与微流控系统连接 通过 液滴到液滴连接，以避免气泡注入流动池（图1B).</li>
	<li>组装流体池和流体池支架，并将组件安装在自行搭建的全内反射荧光显微镜上（图1C). 
	警告：将流动池置于显微镜下时，需仔细调节物镜高度。流动池不得接触物镜，否则可能损坏镜头。</li>
	<li>在流动池中心滴加折射率匹配油，并放置自制的鸽形棱镜（参见 材料表油滴上的作用</li>
</ol>
3. 使用DNA幕技术研究Abo1介导的组蛋白组装
<ol>
	<li>在150 µL成像缓冲液中混合5 nM的Abo1和12.5 nM的Cy5标记H3-H4组蛋白二聚体（Cy5-H3-H4）（见材料表）。所有蛋白质均按照先前发表的文献方法制备17。</li>
	<li>将混合物置于冰上孵育15分钟。 
	注意：为避免Cy5发生光漂白，孵育过程必须在避光条件下进行。</li>
	<li>通过100 µL样品环注入约20 pM（2 µL）的YOYO-1染料（溶于成像缓冲液），以标记λ DNA分子。</li>
	<li>运行成像软件（见材料表），开启488 nm激光器，检查DNA幕是否形成良好。 
	注意：若DNA幕形成良好，在流动条件下，被YOYO-1染色的DNA分子会在屏障处呈现为排列整齐的线条；当停止流动时，拉伸的DNA线条会从屏障处回缩并扩散离开。</li>
	<li>注入2 mL高盐缓冲液（含200 mM NaCl和40 mM MgCl2），以去除DNA上的YOYO-1染料。</li>
	<li>在YOYO-1染料去除后，注入预先孵育的蛋白样品。</li>
	<li>当蛋白到达DNA幕时，关闭注射泵，关闭截止阀，并孵育15分钟，使Abo1介导组蛋白装载到DNA上。</li>
	<li>用缓冲液冲洗5分钟，洗去未结合的Abo1和组蛋白。</li>
	<li>打开截止阀，恢复缓冲液流动。</li>
	<li>开启637 nm激光器，在缓冲液持续流动的条件下对荧光蛋白进行成像。</li>
	<li>短暂停止缓冲液流动，以检测组蛋白是否已装载至DNA上（图2C）。</li>
	<li>使用图像采集程序收集DNA幕图像（见材料表）。 
	&#8203;注意：当缓冲液流动短暂停止时，DNA回缩出全内反射的渐逝场，因此结合在DNA上的荧光标记蛋白信号会消失。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>将图像采集程序拍摄的图像转换为TIFF格式的图像序列。 
	注意：所有数据均使用Image J（NIH）进行分析，方法见参考文献20。</li>
	<li>从图像序列中选取一条单独的DNA分子，并绘制延时图像（kymograph）。 
	注意：延时图像可显示结合在单个DNA分子上的每个组蛋白蛋白的荧光强度随时间的变化情况。</li>
	<li>根据延时图像生成荧光强度曲线图，并用多个高斯函数进行拟合。</li>
	<li>收集荧光强度曲线图中峰的中心坐标。在此步骤中，可获得组蛋白荧光的最低强度值。</li>
	<li>将从曲线图中收集到的所有峰强度值除以最低强度值。此步骤用于估算结合到DNA上的H3-H4二聚体数量。</li>
	<li>对其他DNA分子重复执行步骤4.2–4.5。</li>
	<li>以1 kbp为区间大小，绘制H3-H4二聚体结合分布的直方图。分析的分子数量至少为300个。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

作为一种单分子成像技术，DNA curtain 已被广泛用于研究DNA代谢反应43。DNA curtain 是一种融合了脂质流动性、微流控技术和全内反射荧光显微镜（TIRFM）的杂合系统。与其他单分子技术不同，DNA curtain 能够实现对蛋白质-DNA 相互作用的高通量实时可视化观察。因此，该技术适用于探究分子间相互作用的机制，包括序列特异性结合、蛋白质沿DNA的移动以及蛋白质在DNA上的碰撞17,20,26。此外，DNA curtain 的高通量特性使其能够收集足够多的数据，以确保统计上的可靠性。DNA curtain 有助于研究蛋白质的生物-物理化学性质，包括动力学参数、扩散系数、移动速度和持续性17,26,27</sup...

真核生物的DNA被包装成一种称为染色质的高级结构1,2。核小体是染色质的基本单位，由约147 bp的DNA缠绕在八聚体核心组蛋白上构成3,4。染色质在真核细胞中发挥着关键作用；例如，其致密结构可保护DNA免受内源性因素和外源性威胁的损伤5。染色质结构会随着细胞周期阶段和外界刺激而动态变化，这些变化调控了在DNA复制、转录和修复等过程中蛋白质对DNA的可及性6。染色质的动态变化对于基因组稳定性和表观遗传信息的传递也具有重要意义。
染色质受到多种因素的动态调控，包括组蛋白尾部修饰以及染色质结构调控因子，如染色质重塑复合物、多梳蛋白家族（polycomb group proteins）和组蛋白伴侣蛋白7。组蛋白伴侣蛋白通过核心组蛋白的沉积或解离，协调核小体的组装与解离via8,9。组蛋白伴侣蛋白的功能缺陷可导致基因组不稳定，并引发发育障碍和癌症9,10。多种组蛋白伴侣蛋白在组装或解离核小体时，无需消耗ATP等化学能9,11,12,13。近期研究表明，含有溴结构域的AAA+型ATP酶（ATPase associated with diverse cellular activities）可作为组蛋白伴侣蛋白参与染色质动态调控14,15,16,17。人类ATAD2（ATPase家族AAA结构域蛋白2）可促进染色质可及性，从而增强基因表达18。作为转录共调节因子，ATAD2调控致癌转录因子的染色质状态14，且ATAD2的过表达与多种癌症的不良预后相关19。Yta7是Saccharomyces cerevisiae（S. cerevisiae）中ATAD2的同源蛋白，可降低染色质中的核小体密度15。相反，Abo1是Schizosaccharomyces pombe（S. pombe）中ATAD2的同源蛋白，却可增加核小体密度16。通过一种独特的单分子成像技术——DNA帘幕法（DNA curtain），可研究Abo1是否参与核小体的组装或解离过程17,20。
传统上，生物大分子的生化特性通常通过群体实验进行研究，例如电泳迁移率偏移分析（EMSA）或共免疫沉淀（co-IP），在这些实验中，大量分子被同时检测，其平均性质得以表征21,22。在群体实验中，分子的亚状态被系综平均效应所掩盖，从而限制了对生物分子相互作用的探测。相比之下，单分子技术克服了群体实验的局限性，能够对生物分子相互作用进行详细表征。特别是单分子成像技术，已被广泛用于研究DNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用23。其中一种技术是DNA幕帘法，这是一种基于微流控和全内反射荧光显微镜（TIRFM）的独特单分子成像技术24,25。在DNA幕帘实验中，数百个单独的DNA分子被锚定在脂双层上，由于脂质的流动性，DNA分子可在二维平面上运动。当施加流体动力学流动时，DNA分子沿流动方向在脂双层上移动，并在扩散屏障处被截留，从而实现排列和拉伸。在使用嵌入染料对DNA染色的同时，注入荧光标记的蛋白质，并利用TIRFM在单分子水平上实时观察蛋白质-DNA相互作用23。DNA幕帘平台有助于观察蛋白质的运动行为，如扩散、易位和碰撞26,27,28。此外，DNA幕帘还可用于在具有确定位置、取向和拓扑结构的DNA上进行蛋白质定位，或应用于研究蛋白质与核酸的相分离过程29,30,31。
本研究采用DNA幕技术，通过直接观察特定蛋白质，为分子伴侣的功能提供证据。此外，由于DNA幕技术是一种高通量平台，能够收集足够广泛的数据，从而确保统计学上的可靠性。本文详细描述了如何开展DNA幕实验，以研究裂殖酵母（S. pombe）含溴结构域的AAA+ ATP酶Abo1的分子功能。

<table><tbody><tr><td>1 mL 鲁尔锁式注射器</td><td>贝克顿-迪金森</td><td>301321</td><td></td></tr><tr><td>1英寸 × 3英寸熔融石英载玻片</td><td>G. Finkenbeiner</td><td></td><td>1 英寸 × 3 英寸矩形，厚度 1 毫米</td></tr><tr><td>10 mL 鲁尔锁型注射器</td><td>贝克顿-迪金森</td><td>302149</td><td></td></tr><tr><td>18:1 (&amp;Delta;9-顺式)磷脂酰胆碱（DOPC）</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td>这是生物素标记脂质储备液的一个组分</td></tr><tr><td>18:1 生物素化帽状 PE</td><td>Avanti</td><td>870273</td><td>这是生物素标记脂质储备液的一个组分</td></tr><tr><td>18:1 PEG2000 PE</td><td>Avanti</td><td>880130</td><td>这是生物素标记脂质储备液的一个组分</td></tr><tr><td>3 mL 鲁尔锁注射器</td><td>贝克顿-迪金森</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>六通样品进样阀</td><td>IDEX</td><td>MX系列II</td><td></td></tr><tr><td>950K PMMA</td><td>全电阻</td><td>671.04</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>SAMCHUN</td><td>A1759</td><td></td></tr><tr><td>三磷酸腺苷二钠盐水合物（ATP）</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>铝（Al）</td><td>TASCO，韩国</td><td>LT50AI414</td><td>直径4英寸，厚度1/4英寸</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 离心滤膜，截留分子量 10 kDa</td><td>Millipore</td><td>Z648027</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Mbcell</td><td>MB-A4128</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>AZ 300 MIF 显影液</td><td>默克</td><td>10454110521</td><td>用于去除铝</td></tr><tr><td>刀片</td><td>DORCO</td><td>DN52</td><td>12 mm x 6 m</td></tr><tr><td>三氯化硼（BCl₃）&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>UNIONGAS</td><td></td><td>纯度： &gt;99.99%</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma</td><td>C40-1g</td><td>这是100倍浓缩gloxy储存液的组分之一</td></tr><tr><td>氯（Cl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>UNIONGAS</td><td></td><td>纯度： &gt;99.99%</td></tr><tr><td>透明双面胶带</td><td>3M</td><td>313770</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>直流溅射</td><td>索罗纳</td><td>SRM-120</td><td>用于在载玻片上沉积铝膜</td></tr><tr><td>金刚石涂层钻头</td><td>Eurotool</td><td>DIB-211.00</td><td>用于在熔融石英载玻片上打孔</td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>道威棱镜</td><td>韩国电光有限公司</td><td>1906-106</td><td>定制熔融石英道威棱镜，带抗反射涂层</td></tr><tr><td>钻孔</td><td>Dremel</td><td>Dremel 3000</td><td>用于在熔融石英载玻片上打孔</td></tr><tr><td>电子束光刻</td><td>Nanobeam Ltd.</td><td>NB3</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>指旋接头</td><td>IDEX</td><td>F-300</td><td>它与 &quot;PFA 管道，天然色&quot; 形成鲁尔锁式管路</td></tr><tr><td>无凸缘螺母</td><td>IDEX</td><td>P-235</td><td>它与 &quot;PFA 管道，本色&quot; 形成鲁尔锁式管路</td></tr><tr><td>冷冻干燥机，HyperCOOL</td><td>Labogene</td><td>HC3110</td><td>用于液体蛋白的冻干</td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma</td><td>G2133-50KU</td><td>这是100倍浓缩gloxy储存液的组分</td></tr><tr><td>盐酸胍</td><td>Acros Organics</td><td>364790025</td><td></td></tr><tr><td>汉密尔顿注射器</td><td>Hamilton公司</td><td>80065</td><td>该注射器用于样品进样</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma</td><td>Z805939</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg</td><td>Cytiva</td><td>28-9893-36</td><td>用于FPLC（尺寸排阻）</td></tr><tr><td>加热板搅拌器</td><td>康宁</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma</td><td>H1759</td><td>用于 Tris-HCl</td></tr><tr><td>折射率匹配油</td><td>ZEISS</td><td>444970-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>电感耦合等离子体反应离子刻蚀</td><td>Top Technology Ltd.</td><td>FabStar</td><td></td></tr><tr><td>异丙基 &amp;beta;异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）</td><td>格伦特汉生命科学</td><td>GC6586-100g</td><td>用于诱导 &amp;beta;β-半乳糖苷酶活性</td></tr><tr><td>λ噬菌体DNA</td><td>NEB</td><td>N0311</td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤</td><td>BD Difco</td><td>244610</td><td>大肠杆菌细胞生长培养基</td></tr><tr><td>鲁尔接头 10-32</td><td>IDEX</td><td>P-659</td><td>连接鲁尔锁式注射器与管路</td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>fisher bioreagents</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>甲基异丁基酮（MIBK）</td><td>KAYAKU ADVANCED MATERIALS</td><td></td><td>用于配制溶液</td></tr><tr><td>显微镜（Eclipse Ti2）</td><td>尼康</td><td>Eclipse Ti2</td><td>倒置荧光显微镜</td></tr><tr><td>显微镜玻璃盖玻片</td><td>MARIENFELD</td><td>101142</td><td>22 x 50 mm（1号）</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>DURAN GROUP</td><td>DU.2355013</td><td>载玻片磨砂边 45&amp;deg;，普通 26 x 76 mm</td></tr><tr><td>Nanoport</td><td>IDEX</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td>物镜</td><td>尼康</td><td>CFI Plan Apochromat VC 60XC WI</td><td>浸油类型：水，放大倍数：60倍，校正：18，工作距离：0.29（0.31-0.28）</td></tr><tr><td>One Shot BL21 (DE3)pLysS 化学感受态 E. coli</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C6060-03</td><td>用于过表达蛋白的感受态细胞</td></tr><tr><td>氧气（O₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>NOBLEGAS，韩国</td><td></td><td>纯度： &gt;99.99%</td></tr><tr><td>PFA 管道，天然色</td><td>IDEX</td><td>1512L</td><td>它与 &quot;指旋接头&quot; 形成鲁尔锁式管路</td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>罗氏</td><td>11359061001</td><td>蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>Sephacryl S-200 High Resolution</td><td>Cytiva</td><td>17-0584-01</td><td>用于FPLC（尺寸排阻）</td></tr><tr><td>关闭阀</td><td>IDEX</td><td>P-732</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma</td><td>791741</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Sigma</td><td>s5881</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 分子多孔膜管，截留分子量 6-8 kDa</td><td>Spectrum 实验室</td><td>132660</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S888</td><td></td></tr><tr><td>四氟化硫（SF&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>中国台湾</td><td></td><td>纯度： &gt;99.99%</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>KD Scientific</td><td>78-8210</td><td></td></tr><tr><td>四氟化碳（CF₄）&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>中国台湾</td><td></td><td>纯度： &gt;99.99%</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 碱</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>用于 Tris-HCl</td></tr><tr><td>TSKgel SP-5PW</td><td>TOSOH</td><td>14715</td><td>用于FPLC（离子交换）</td></tr><tr><td>联合体组装</td><td>IDEX</td><td>P-760</td><td>连接管路</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>真空烘箱</td><td>Jeio Tech</td><td>OV-11</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Y3601</td><td>该嵌入染料用DMSO稀释</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇（BME）</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr></tbody></table>

利用dna幕技术解析组蛋白组装的分子机制

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

染色质是一种高级结构，用于包装真核生物的DNA。染色质会根据细胞周期阶段以及对外界环境刺激的响应发生动态变化。这些变化对于维持基因组完整性、表观遗传调控以及DNA的代谢反应（如复制、转录和修复）至关重要。染色质组装是染色质动态变化的关键过程，由组蛋白伴侣蛋白催化完成。尽管已有大量研究，组蛋白伴侣蛋白如何介导染色质组装的机制仍不明确。此外，由组蛋白伴侣蛋白组织形成的核小体的全局特征也尚不清楚。为解决这些问题，本研究介绍了一种独特的单分子成像技术——DNA幕帘（DNA curtain），该技术有助于在分子水平上研究组蛋白伴侣蛋白介导的核小体组装过程。DNA幕帘是一种混合技术，结合了脂质流动性、微流控技术和全内反射荧光显微镜（TIRFM），为实时观察多种蛋白质-DNA相互作用提供了通用平台。利用DNA幕帘技术，本研究探究了Abo1（一种含有溴结构域的粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe AAA+ ATP酶）的组蛋白伴侣功能，并揭示了Abo1介导组蛋白组装的分子机制。DNA幕帘为研究染色质动态提供了独特的方法。

本文描述了用于DNA幕实验的流动池制备流程（图 1A）。DNA帘实验促进了对Abo1介导组蛋白H3-H4二聚体在DNA上组装的研究。首先，通过使用YOYO-1（一种嵌入式染料）对DNA分子进行染色，检测DNA帘的形成。结果显示为平行排列的绿色条带，表明YOYO-1已嵌入DNA分子中，且DNA分子在流体动力作用下于扩散屏障处整齐排列并充分拉伸（图 2A). 为排除YOYO-1可能阻碍DNA与组蛋白相互作用的可能性，在加入组蛋白前，使用高盐缓冲液将YOYO-1从DNA上移除。当在无Abo1存在的情况下将Cy5-H3-H4二聚体注入DNA帘时，Cy5-H3-H4未与DNA结合，表明H3-H4二聚体无法自发结合DNA（图2B）。当注入 Cy5-H3-H4 与 Abo1 时，DNA 分子上出现红色荧光点状信号，表明 Abo1 可将 H3-H4 二聚体装载到 DNA 上（图 2C）。暂时关闭缓冲液流动，以确保Cy...

DNA幕是一种高通量单分子成像技术，可提供实时可视化多种蛋白质-DNA相互作用的平台。本实验方案利用DNA幕技术研究Abo1的生物学功能及其分子机制，Abo1是一种来自裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的含溴结构域AAA+ ATP酶。

利用DNA幕技术解析组蛋白组装的分子机制

染色质是一种对真核生物DNA进行高级包装的结构。染色质会根据细胞周期阶段以及...发生动态变化。

本方案展示了如何利用DNA幕技术研究染色质动态，特别是探究组蛋白伴侣分子的功能。高通量单分子成像技术DNA幕克服了传统群体实验的局限性，支持实时成像，从而实现对生物分子相互作用的详细表征。将一张尺寸为5毫米×35毫米的洁净纸片置于双面胶带中央。用胶带覆盖载玻片上的两个孔洞和纳米图案，并盖上纸片。然后使用洁净的刀片将纸片切除。在双面胶带上放置一片玻璃盖玻片，用移液器吸头按压盖玻片，以形成微流控腔室。将组装好的流动池置于两张显微镜载玻片之间并用夹子固定。在120摄氏度的真空烘箱中烘烤流动池45分钟。使用热熔胶枪将基于芯片分析的流体连接器连接到每个开放的孔上。连接两段诱饵锁管路。连接一个含有三毫升去离子水的诱饵锁注射器，清洗腔室。再通过逐滴连接的方式，用三毫升脂质缓冲液再次清洗腔室。将1毫升脂质缓冲液中0.04倍浓度的生物素化脂质分两次注入腔室，每次注入后孵育5分钟。将1毫升BSA溶液中0.025毫克/毫升的链霉亲和素分两次注入，每次注入后孵育10分钟。将1毫升BSA缓冲液中约30皮摩尔的生物素化λ噬菌体DNA分两次注入腔室，每次注入后孵育10分钟。将装有10毫升成像缓冲液的注射器连接至注射泵，并去除微流控系统中所有管路内的气泡。通过液滴对液滴连接方式，将制备好的流动池与微流控系统耦合，以避免将气泡注入流动池中。组装流动池及流动池支架，并将组件安装至自行搭建的全内反射荧光显微镜上。通过100微升的样品环注入200微升成像缓冲液中的YOYO-1染料，以染色Lambda DNA分子。运行成像软件，并打开488纳米激光器，检查DNA帘是否形成良好。在去除YOYO-1染料后，注入预先孵育的蛋白质样品。当蛋白质到达DNA幕时，关闭注射泵，关闭截断阀，并孵育15分钟以使Abo1加载组蛋白。用缓冲液洗去未结合的Abo1和组蛋白，持续5分钟。暂时停止缓冲液流动，以检查组蛋白是否已加载到DNA上。通过使用嵌入式染料对DNA分子进行染色，检测DNA幕的形成。平行排列的绿色条带表明，YOYO1已嵌入DNA分子，并在流体动力作用下于扩散屏障处良好地对齐并拉伸。当在无Abo1存在的情况下将Cy5-H3-H4二聚体注入DNA幕时，Cy5-H3-H4未结合DNA，表明H3-H4二聚体无法自发结合DNA。当 Cy5-H3-H4 与 Abo1 一同注入时，在 DNA 分子上观察到红色荧光点，表明 Abo1 可将 H3-H4 二聚体装载到 DNA 上。在无缓冲液流动时，荧光信号消失，当恢复流动时信号重新出现，表明 H3-H4 二聚体能够结合 DNA。H3-H4 二聚体与 DNA 的结合也通过显迹图（kymograph）得到证实，显迹图显示，每当停止流动时，荧光信号即消失。在无核苷酸或存在ADP的情况下，DNA帘中仅出现少量荧光斑点，表明H3-H4二聚体在无配体状态或ADP存在下均极少结合DNA。定量分析显示，在ATP存在时，结合到DNA上的H3-H4二聚体数量增加。结果表明，ATP水解对于Abo1介导的H3-H4装载到DNA上至关重要。避免将气泡注入流动池是所有步骤中最关键的环节。因此，在本方案中，我们强调逐滴连接的操作方式。DNA 幕帘实验可进一步拓展为利用双重纳米图案构建双锚定 DNA 幕帘。此外，我们还可以利用单链DNA、RNA或肌动蛋白丝构建另一种类型的DNA幕。DNA幕技术能够实现对蛋白质在DNA上运动的可视化观察，并有助于研究靶标搜寻机制。该技术还可拓展应用于DNA代谢过程的研究，包括DNA复制和转录。

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