Name: 分析易患狼疮的MRL/lpr小鼠的蛋白尿、白细胞肾浸润和蛋白质的肾脏沉积 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 了解如何使用MRL/lpr小鼠模型通过蛋白尿检测、白细胞肾浸润分析和肾脏蛋白质沉积评估来追踪狼疮进展。该方法为研究狼疮肾炎提供可靠且经济有效的替代方案。

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感谢弗吉尼亚理工学院及州立大学的流式细胞术核心设施、组织病理学实验室和弗拉林影像中心提供的技术支持。本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）各项基金以及机构内部资助的支持。

本方案已获得弗吉尼亚理工学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。由于狼疮疾病在雌性个体中发病率较高，因此仅使用雌性MRL/lpr小鼠。样本采集从4周龄开始，至15周龄结束。小鼠来源于商业渠道（见材料表），并根据机构指南在特定病原体-free环境中饲养和维持。
1. 蛋白尿检测
<ol>
	<li>按照以下步骤收集尿液。
	<ol>
		<li>使用70%乙醇喷洒超净台进行消毒，并在台面放置无菌塑料垫。准备移液器吸头、1.5 mL离心管和移液器，用于收集约20 μL液体。 
		注意：吸头和离心管必须无菌，且未经任何预处理。</li>
		<li>取出小鼠笼盒，在放入超净台前用70%乙醇喷洒消毒。</li>
		<li>用一只手固定小鼠，另一只手从上至下轻轻按摩其腹部区域。</li>
		<li>使用1.5 mL离心管或移液器直接收集尿液；若尿液滴落在塑料垫上，则从垫上收集。每份样本均需使用新的手套、塑料垫和吸头。 
		注意：若上述方法无效，可使用无菌烧杯将小鼠隔离，待其排尿后从烧杯中收集尿液。</li>
		<li>将小鼠放回笼盒。取出下一只小鼠，重复步骤1.1.3–1.1.4。 
		注意：每次收集完一只小鼠的样本后，必须用70%乙醇清洁塑料垫和烧杯。每组至少需要五只小鼠，以确保统计学意义。尿液样本可在–80 °C保存，最长可保存12个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用Bradford法测定蛋白质含量24。
	<ol>
		<li>将尿液样本、白蛋白标准品和Bradford试剂从冰箱取出，在室温（RT）下放置10–20分钟，使其恢复至室温。 
		注意：Bradford试剂和白蛋白标准品包含于市售试剂盒中（见材料表）。白蛋白标准品的起始浓度为2 mg/mL，需用去离子水进行连续倍比稀释（1:2，共6次）。</li>
		<li>向96孔板中每孔加入200 μL未稀释的Bradford试剂。</li>
		<li>每孔加入5 µL未稀释的尿液样本，并使用吸头反复吹打数次以充分混匀。</li>
		<li>设置标准品孔（400、200、100、50、25、12.5 mg/dL），每个浓度设复孔。留出若干孔作为空白对照。 
		&#8203;注意：加入样本和标准品的操作应迅速完成。</li>
		<li>室温静置5–10分钟。</li>
		<li>按照仪器制造商的操作说明，使用酶标仪在595 nm波长下读取吸光值（见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 肾脏细胞的分离
<ol>
	<li>将小鼠置于 CO2 气体（流速：30%-70% 体积/分钟，以达到无意识或死亡状态）的密闭容器中实施安乐死，随后进行颈椎脱位。立即开始解剖以获取双侧肾脏。将一个半肾脏置于冰上预冷的 C10 培养基中；将另一半肾脏放入 OCT 包埋剂中（步骤 3.1.1）。 
	注：C10 培养基由 RPMI 1640 培养基添加 10% 胎牛血清、1 mM 丙酮酸钠、1% 的 100× MEM 非必需氨基酸、10 mM HEPES、55 µM 2-巯基乙醇和 100 U/mL 青霉素-链霉素组成（见材料表）。</li>
	<li>将肾脏切成米粒大小（1-2 mm3 的组织块），放入含有 1 mg/mL 胶原酶和 0.2 mg/mL DNase I（见材料表）的 5 mL 消化缓冲液中，在含 10 mmol/L HEPES 的 RPMI 1640 培养基中，37 °C 持续轻柔震荡消化 1 小时。 
	注：在无菌 2 mL 离心管中加入 1 mL 消化缓冲液，并用无菌剪刀剪碎肾脏组织。</li>
	<li>加入 10 mL 含 10 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）的预冷 1× PBS，冰上孵育 10 分钟，随后涡旋振荡两次。</li>
	<li>将细胞悬液通过 100 µM 细胞筛过滤，并用 10 mL HBSS-full 洗涤。 
	注：HBSS-full 含有 5 mM EDTA、0.1% BSA 和 10 mM HEPES。</li>
	<li>在室温下以 350 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>配制 30%、37% 和 70% 的等渗 Percoll（SIP）溶液。 
	注：按 1 体积 10× PBS 与 9 体积 Percoll 混合配制 SIP（见材料表）；使用 HBSS-full 将 SIP 稀释至 30%、37% 和 70%。</li>
	<li>将细胞重悬于 5 mL 30% SIP 中，用移液器缓慢加入 5 mL 37% SIP（上层）和 5 mL 70% SIP（下层），形成梯度离心液。</li>
	<li>以 1000 × g 在室温下离心 30 分钟，离心机设置为“Up9 down0”（或刹车设为 0）。</li>
	<li>从 37%-70% 界面收集白细胞，并将其重悬于 5 mL C10 培养基中。</li>
	<li>在 4 °C 下以 350 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 3 mL FACS 缓冲液中，细胞即可用于 FACS 染色。 
	注：FACS 缓冲液含有 1× PBS 和 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）。</li>
	<li>在 4 °C 下以 350 × g 离心 5 分钟，弃去上清液（SN），保留约 50 µL。 
	注：去除上清液时，小心倾倒或用移液器将液体远离沉淀移除，或使用半自动真空泵抽吸上清液。</li>
	<li>每管加入 50 µL FcR 封闭剂（见材料表，用 1× PBS 预稀释至 1/50），混匀后避光冰上孵育 10 分钟。</li>
	<li>加入 2 mL FACS 缓冲液洗涤。</li>
	<li>在 4 °C 下以 350 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，保留约 50 µL。</li>
	<li>每管加入 20 µL 合适的荧光染料（用 1× PBS 稀释至 1/100，见材料表），冰上静置 15-30 分钟。</li>
	<li>每管加入 50 µL 抗体15 混合液：CD138-BV711（1/200 稀释于 1× PBS）和 CD45-AF700（1/200 稀释于 1× PBS）（见材料表）。</li>
	<li>避光冰上孵育 15-30 分钟，然后加入 3 mL FACS 缓冲液。</li>
	<li>在 4 °C 下以 350 × g 离心 5 分钟，抽吸去除上清液，保留约 50 µL。将细胞重悬于 200 µL 1× PBS 中，即可用于流式细胞术分析。</li>
</ol>
3. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>进行样本采集。
	<ol>
		<li>将半肾置于小型塑料冷冻模具中，并用最佳切割温度（OCT）包埋剂包埋（参见 材料表).</li>
		<li>将干冰加入聚苯乙烯泡沫箱中（参见 材料表），并将冷冻模具小心地放在干冰上，确保冷冻模具平放。 
		注意：OCT 化合物需要 3-4 分钟才能凝固并变为白色。</li>
		<li>取出冷冻模具，用铝箔纸包裹，于 -80 °C 保存备用。 
		注意：可在 -80 °C 保存至少 1 年。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对样本进行切片和固定。
	<ol>
		<li>将样品切成4 µm切片，在室温下干燥至少2-3小时，然后用预冷的丙酮（4 °C）固定10分钟。 
		注意：使用丙酮时需谨慎，丙酮操作必须在专用的化学通风橱中进行。</li>
		<li>固定载玻片后，室温晾干0.5–1小时，短期可保存于-20 °C，长期则保存于-80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对样品进行染色。
	<ol>
		<li>用冷丙酮固定载玻片 5–10 分钟。</li>
		<li>让切片恢复至室温。使用PAP笔（参见 材料表) 围绕切片区域画圈，并使其干燥。 
		注意：也可使用指甲油。此步骤可防止抗体稀释液在载玻片上扩散。</li>
		<li>将载玻片放入盛有1x Tris缓冲盐水（TBS）的考普林瓶中（参见 材料表静置20分钟，将容器置于摇床，轻轻振荡。</li>
		<li>倒掉1x TBS，加入含5% BSA和0.1% Tween 20的1x TBS溶液至充满容器。在摇床中轻轻振荡孵育20分钟。</li>
		<li>取出玻片，将玻片底部擦干。必要时，轻轻振荡玻片使其干燥。加入 100 µL 偶联抗体25 C3-FITC（1/100）和IgG2a-PE（1/100）加入切片中（参见 材料表在湿盒中室温孵育1小时。</li>
		<li>在摇床上用 1x TBS、5% BSA 和 0.1% Tween 20 洗涤切片 3 次，每次 10 分钟。</li>
		<li>摇干载玻片，用抗荧光淬灭封片剂封片（参见 材料表然后盖上盖玻片。</li>
		<li>将载玻片储存于 4 °C，直至在显微镜（如共聚焦显微镜或成像系统显微镜）下观察。使用软件对图像进行定量分析，并在比较不同区域的荧光强度时扣除背景信号。</li>
		<li>使用ImageJ软件进行图像分析（参见 材料表)，勾画出目标区域。</li>
		<li>通过点击设置标准参数 分析，然后 设置测量参数 和 测量面积 以获得结果。</li>
		<li>将测量窗口中获得的数据转移至电子表格中。 
		注意：可从图像中选择一小块区域作为背景，该区域不应有任何荧光。</li>
		<li>完成后，点击 分析 测量该区域，并再次将数据传输至之前的电子表格。</li>
		<li>对多个区域重复执行步骤 3.3.11–3.3.12。</li>
		<li>计算校正细胞荧光（CCF）作为平均荧光：CCF = 整合密度 - （选定细胞区域 × 平均背景荧光）。</li>
		<li>针对每个区域进行计算，并使用绘图与统计分析软件对数据进行分析（参见 材料表).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

狼疮性肾炎（LN）是系统性红斑狼疮（SLE）患者死亡的主要原因，而加重该疾病的因素仍不明确。本方案的应用旨在通过多种方法表征肾功能，包括蛋白尿检测、分离肾脏白细胞的流式细胞术分析以及冷冻肾脏组织切片的免疫荧光染色。
收集尿液时需要考虑的一个重要问题是，必须在一天中的相同时间和相同的地点进行收集。小鼠是夜行性动物，因此最准确的样本应在小鼠开始活跃之前的傍晚采集。选择这一时间的另一个原因是，MRL/lpr 小鼠通常在夜间大量饮水，导致尿液被稀释。因此，在不恰当的时间采集样本可能会增加尿液浓度和/或体积的变异性。此外，尽可能多地收集尿液对于获得准确的结果也非常重要。
Bradford 法可为我们提供样品中蛋白质含量的估算结果。该方法并非针对任何系统性红斑狼疮（SLE）标志蛋白，但足以反映疾病进展情况26。此外，与其他方法相比，该方法成本较低。值得注意的是，Bradford 法对时间较为敏感，因此必须在半小时内完成。若等待时间过长，样品结果往往会出现数值升高或假阳性。与市售尿液分析试纸条...

肾脏的主要功能是通过尿液排出有毒物质，同时维持水和盐的稳态1。系统性红斑狼疮（SLE）患者会出现这一功能受损，导致所谓的狼疮性肾炎（LN）。LN是免疫系统攻击肾脏的结果，引起持续性的肾脏炎症，从而丧失清除血液废物以及调节盐和液体浓度的能力。这最终将导致肾功能衰竭，可能危及生命。在肾炎过程中，循环中的B细胞、T细胞和单核细胞被募集至肾脏，分泌趋化因子、细胞因子以及可形成免疫复合物的自身抗体。这最终导致内皮细胞损伤、膜性损伤、肾小管萎缩和纤维化2。
MRL/Mp-Faslpr（MRL/lpr）狼疮易感小鼠是一种经典的动物模型，可表现出类似人类系统性红斑狼疮（SLE）的临床症状3。该模型在揭示SLE患者主要死亡原因之一——狼疮性肾炎（LN）的发病机制方面发挥了重要作用4。在人类和小鼠的SLE中，LN的特征是由于免疫复合物在肾脏沉积引发逐渐加重的炎症反应，继而激活补体系统，募集炎性细胞，并导致肾功能丧失5。免疫复合物的沉积是诱发肾脏固有细胞产生趋化因子和细胞因子的第一步，这些因子通过招募免疫细胞进一步扩大炎症反应6。本实验方案介绍了多种用于监测肾病进展的技术，可分析肾脏中的细胞浸润和免疫复合物沉积情况。
每周收集尿液可用于检测和观察狼疮发病前、发病期间及发病后的蛋白尿时间进程。蛋白尿作为一种生物标志物，可以确定狼疮性肾炎的生物学进展。该技术的其他优势在于其无创性、成本效益高且易于实施7。当肾脏功能正常时，蛋白尿水平持续保持在较低水平；然而，在MRL/lpr小鼠中，从8至9周龄开始，蛋白尿水平逐渐升高，最终达到足以引起肾功能衰竭的程度8。目前已有多种市售的试剂条和比色试剂可用于监测这一问题。然而，Bradford法在确定蛋白尿的发生及狼疮性肾炎病程方面具有成本低且非常准确的优点。该方法快速，且其试剂不受样品中可能存在的溶剂、缓冲液、还原剂和金属螯合剂的影响9,10,11。
需要考虑的一个重要方面是肾脏中的细胞浸润。这些浸润细胞通过触发分泌细胞因子等可溶性因子，加剧炎症反应，从而促进疾病发生12。为了更清楚地了解浸润中存在哪些细胞群体，一种有效的方法是分离白细胞13。本文以检测B细胞在肾脏中的浸润为例进行说明。该操作首先使用脱氧核糖核酸酶（DNase）和胶原酶进行组织消化，随后通过密度梯度离心去除碎片、红细胞和致密的粒细胞。分离B细胞（CD19+）和浆细胞（CD138+）的原因在于，狼疮性肾脏可富集这些细胞14。有研究表明，肾脏中出现小簇状聚集的B细胞可能提示克隆扩增，进而导致免疫球蛋白（Ig）的产生。浆细胞也被证实常存在于这些细胞聚集体中15。在成功分离白细胞后，可通过使用不同荧光标记抗体进行染色，再利用荧光激活细胞分选技术（FACS）分析目标细胞。
免疫荧光是一种免疫组织化学（IHC）检测方法，可用于在4 μm厚的肾组织样本中对蛋白质进行荧光可视化观察。其他IHC检测方法则取决于分析物的性质、结合化学特性及其他因素16。免疫荧光是一种快速鉴定方法，其原理是将抗原与其对应的、标记有特定荧光染料（或荧光素）的抗体结合。当受到激发时，该荧光染料会发出荧光，可被荧光显微镜检测到。该技术可用于观察补体C3和IgG2a的沉积情况17。补体级联反应的过度激活可能与失控的免疫反应及功能丧失相关18。抗双链DNA（抗-dsDNA）自身抗体在肾脏中的免疫沉积是一个重要问题19，其中IgG2a亚型已被证实与狼疮性肾炎（LN）相关20。具体而言，抗-dsDNA抗体对核物质具有更强的致病性和亲和力，可形成免疫复合物21。当存在IgG2a时，补体级联反应（包括C3）被激活，以清除这些免疫复合物22。C3和IgG2a标志物可分别定量，也可进行共定位叠加分析，以确定二者之间的相关性。
值得注意的是，血清肌酐测定是另一种可靠的检测方法，可与显微镜下血尿和肾活检联合用于诊断狼疮性肾炎（LN）23。然而，蛋白尿的存在是肾小球损伤的强烈指征。因此，在系统性红斑狼疮病程中监测蛋白尿水平有助于发现疾病发作，并补充其他狼疮诊断方法。此外，沉积在肾小球中的免疫复合物可诱发炎症反应，激活补体系统，并募集更多炎症细胞。本方案另一个值得注意的方面是肾脏中B细胞的浸润。这与浸润的T细胞共同作用，放大局部免疫反应，从而引发器官损伤。重要的是，狼疮性肾炎的分类不仅依据显微镜下观察到的肾小球形态学改变，还包括免疫荧光检测到的免疫沉积物。因此，本方案在实验室环境中提供了准确且具有成本效益的肾功能分析方法。

<table><tbody><tr><td>10倍浓度Tris缓冲盐溶液（TBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>J60764.K2</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>抗人/小鼠 C3</td><td>Cedarlane</td><td>CL7632F</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD138 BV711</td><td>Biolegend</td><td>142519</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45 AF700</td><td>Biolegend</td><td>103127</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418-100G</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜 LSM 880</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>考普林瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-212-281</td><td></td></tr><tr><td>冷冻模具</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9511236</td><td></td></tr><tr><td>密度梯度介质</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Percoll</td></tr><tr><td>DEPC 处理水</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>dsDNA-EC</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-ecdna</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>EVOS M5000 显微成像系统</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AMF5000</td><td></td></tr><tr><td>FACS 融合细胞分选仪</td><td>BD 生物科学</td><td>FACS 融合</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 - 优质，经热灭活</td><td>R&amp;研发系统</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 96孔聚苯乙烯板</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-501</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>汉克&amp;rsquo;s 平衡盐溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>罗伊氏乳杆菌 Kandler 等</td><td>ATCC</td><td>23272</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MRL/MpJ-Fas lpr /J 小鼠（MRL/lpr）</td><td>杰克逊实验室</td><td>485</td><td></td></tr><tr><td>指甲油</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>任何常规商店</td></tr><tr><td>O.C.T. 化合物</td><td>Tisse-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>PAP笔</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way 一次性包埋模具</td><td>Polysciences</td><td>R-30</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>70011069</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 20x TBS 缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>28358</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Coomassie Plus（Bradford）检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>23236</td><td>包含白蛋白标准品</td></tr><tr><td>ProLon Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32</td><td>BD 生物科学</td><td>553141</td><td>FcR封闭</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>SoftMax Pro 6.1 软件</td></tr><tr><td>无菌细胞滤网 100 &amp;micro;M</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>盐酸万古霉素</td><td>Goldbio</td><td>V-200-1</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua</td><td>Biolegend</td><td>423102</td><td>用于流式细胞术分析的荧光染料</td></tr></tbody></table>

狼疮易感型mrl/lpr小鼠蛋白尿、肾脏白细胞浸润及肾脏蛋白沉积的分析

Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice

系统性红斑狼疮（SLE）是一种自身免疫性疾病，目前尚无已知治愈方法，其特征是包括肾脏在内的多个器官出现持续性炎症。在此情况下，肾脏失去清除血液废物以及调节盐和液体浓度的能力，最终导致肾功能衰竭。女性患病率显著高于男性，尤其是育龄期女性，其发病率是男性的九倍。肾脏疾病是SLE患者死亡的首要原因。本实验方案介绍了一种快速、简便的方法，用于检测收集尿液中的排泄蛋白水平，以追踪狼疮随时间的进展。此外，还提供了一种基于细胞大小和密度选择的方法，用于分离肾脏单个核细胞，以研究白细胞在肾脏中的浸润情况。同时，建立了一种免疫组织化学方法，用于表征肾小球中的蛋白沉积以及肾小管间质区域的白细胞浸润。综合这些方法，有助于研究易患狼疮的MRL/lpr小鼠肾脏中慢性炎症的进展过程。

本方案采用多种方法评估MRL/lpr小鼠的狼疮性肾炎。首先，描述了一种用于研究随时间推移因肾功能障碍导致蛋白尿水平升高的方法。如图1所示，雌性小鼠以每日灌胃200 µL磷酸盐缓冲液（1× PBS）作为对照组，以浓度为109 cfu/mL的益生菌Lactobacillus reuteri作为处理组，每周给药两次。处理从3周龄开始，至15周龄结束。与对照组相比，接受L. reuteri处理的小鼠组蛋白尿进展更为迅速。
<img alt="MRL/lpr 雌性小鼠蛋白尿图；PBS 对照组与 L. reuteri 治疗组的统计分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63506/63506fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1<...

本实验方案描述了一种在小鼠中追踪狼疮进展的方法。另外提供了两种实验程序，用于通过肾脏中的细胞浸润和蛋白质沉积来表征狼疮性肾炎。

狼疮易感型MRL/lpr小鼠蛋白尿、肾脏白细胞浸润及肾脏蛋白沉积的分析

系统性红斑狼疮（SLE）是一种自身免疫性疾病，目前尚无已知的治愈方法，其特征是包括多个器官在内的持续性炎症，例如……

这些方法有助于研究狼疮患者肾脏相关慢性炎症的进展。我们提供了一种可靠且经济的替代方案，可用于监测狼疮的疾病进程。首先用70%乙醇喷洒超净台进行消毒，并在台面放置无菌塑料垫。然后准备枪头、1.5 毫升离心管和移液器，以收集约 20 微升尿液。取小鼠笼具，喷洒 70% 乙醇消毒后放入生物安全柜中。随后，用一只手固定小鼠，另一只手从上至下轻轻按摩其腹部区域。使用1.5毫升离心管或移液器直接收集尿液。或者，若样本以液滴形式落下，可从塑料板上收集。然后将小鼠放回笼中。将解剖得到的肾脏组织切成米粒大小，放入含有胶原酶和DNase 1的5毫升消化缓冲液中，在37摄氏度下持续轻柔振荡消化1小时，缓冲液为含HEPES的RPMI 1640培养基。加入10毫升含10毫摩尔EDTA的预冷PBS，冰上孵育10分钟。随后将悬液涡旋振荡两次。随后，将细胞悬液通过100微米滤网过滤，并用10毫升完全HBSS洗涤。之后，在室温下以350 × g离心10分钟。配制30%、37%和70%的等渗Percoll储备液，并将一层37% Percoll溶液加在70%溶液之上。将细胞重悬于5 mL的30%储备等渗Percoll溶液中。使用巴斯德移液管，缓慢在上层加入5 mL的37%溶液，底层加入5 mL的70%溶液，制备等渗Percoll梯度储备液。然后，在室温下以1000 × g离心30分钟，离心机转速设置为上行9号，下行0号。随后，从37%至70%的界面收集白细胞，并将其重悬于5 mL C10中。再次在4°C条件下以350 × g离心10分钟。然后将细胞沉淀重悬于3 mL FACS缓冲液中，并在4°C条件下以350 × g离心5分钟。然后弃去上清液，每管中保留约 50 微升总体积。每管加入 50 微升 FC 受体阻断剂。混匀后置于冰上避光孵育 10 分钟。随后，加入两毫升 fax 缓冲液进行洗涤。然后在 4°C 条件下以 350 × g 离心五分钟，并弃去上清液，保留约 50 微升总体积。接着，加入 20 微升适当的荧光染料，在冰上静置 15 至 30 分钟。每管加入 50 µL 抗体混合液，其中包含 CD138 Brilliant Violet 711 和 CD45 Alexa Fluor 700，避光冰上孵育 15 至 30 分钟。随后，每管加入 3 mL FACS 缓冲液。在 4°C 条件下以 350 × g 离心 5 分钟。用真空抽提去除上清液，保留总体积约50微升。随后，将细胞沉淀重悬于200微升PBS中。为收集样本，将半个肾脏置于小型塑料冷冻模具中，并用最佳切割温度化合物包埋。然后将干冰放入聚苯乙烯泡沫盒中，并小心地将冷冻模具置于干冰之上。接着取出冷冻模具，用铝箔包裹，并在零下80摄氏度保存备用。随后用预冷的丙酮在4微米切片上固定10分钟。固定载玻片后，室温下晾干0.5至1小时，短期可保存于-20摄氏度，长期则保存于-80摄氏度。染色时，将载玻片在冷丙酮中重新固定5至10分钟，然后使切片恢复至室温。随后，用疏水笔在切片周围画一个疏水圈，并使其干燥。然后将切片放入 Copeland 染色缸中的 TBS 溶液中，置于摇床轻柔振荡孵育 20 分钟。随后倒去 TBS 溶液，向染色缸中加入含 5% BSA 和 0.1% TW-20 的 TBS 溶液。之后将染色缸置于摇床上轻柔振荡，孵育 20 分钟。然后取出载玻片，擦净载玻片底部。向切片中加入 100 µL 标记抗体 C3 fit C 和 IgG2 APE，于湿盒中室温孵育 1 小时。在摇床上用含 5% BSA 和 0.1% Tween 20 的 PBS 洗涤切片 3 次，每次 10 分钟，然后将载玻片振干。使用抗荧光淬灭剂封片，然后加盖盖玻片。将载玻片置于4°C保存，直至在显微镜下观察。如需使用ImageJ软件进行图像分析，请勾画出目标区域。然后，单击“分析”，再选择“设置测量”并测量面积，以设定标准参数并获得结果。接下来，将测量窗口中获得的数据转移至电子表格。完成后，再次单击“分析”以测量区域，并将数据重新转移至之前的电子表格中。通过检测MRL LPR小鼠尿液中的蛋白水平随时间的变化，观察生理盐水对照组和罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）处理组的差异。接受L. reuteri处理的小鼠组表现出比对照组更严重的蛋白尿进展。对分离的肾脏白细胞进行流式细胞分析，以检测浆细胞。此外，小鼠接受了万古霉素治疗，或同时接受万古霉素和大肠杆菌双链DNA治疗。尽管预期大肠杆菌双链DNA会引发肾脏浸润，但在血浆细胞百分比方面未发现显著差异。通过免疫荧光染色在雌性MRL IPR小鼠肾组织切片中检测到补体C3和IgG2a。比较了动物房内自行繁育的小鼠与从供应商处购买的小鼠在C3和IgG2a肾沉积方面的有效环境影响因素。免疫组织化学分析未显示两组之间存在任何差异。逐层添加每层百分比浓度的ISO 20 Percoll溶液可能具有挑战性，若各层混合则需重新开始。该方法有助于流式细胞仪和体内实验，因此可以用于研究肾脏中不同细胞类型的群体。该方法使我们能够研究肾脏中的B细胞浸润，而目前文献中相关的信息尚不多。

analyses-proteinuria-renal-infiltration-leukocytes-renal-deposition

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

分析易患狼疮的MRL/lpr小鼠的蛋白尿、白细胞肾浸润和蛋白质的肾脏沉积

将bm12淋巴细胞移植到C57BL/6受体小鼠体内是系统性红斑狼疮的成熟动物模型。本文介绍如何利用该模型诱导疾病发生，并通过流式细胞术对滤泡辅助性T细胞、生发中心B细胞和浆细胞进行表征分析。...

C57BL/6小鼠中系统性红斑狼疮（SLE）的bm12可诱导模型

本文描述了通过快速眶后注射阿霉素在129S1/SvImJ小鼠中诱导实验性肾病综合征的方法。我们还使用含有抑肽酶的缓释丸对肾病小鼠进行治疗，以抑制尿液中丝氨酸蛋白酶活性并防止钠潴留。...

通过眼后注射阿霉素诱导小鼠肾病综合征及缓释抑肽酶预防液体潴留

本方案描述了应在肾小球疾病小鼠模型中进行的完整肾脏检查。这些方法可对肾小球功能进行详细的功能性、结构性和机制性分析，适用于所有肾小球疾病的小鼠模型。...

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单侧输尿管梗阻模型用于研究肾间质纤维化

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