活斑马鱼幼虫的眼睛去除以检查视觉系统的神经支配依赖性生长和发育

所以我的实验室有兴趣了解眼睛和大脑是如何一起生长的。这项技术使我们能够研究视网膜输入如何影响大脑的生长和发育。手术从活的幼虫斑马鱼身上切除一只眼睛，然后观察视神经结构，使我们能够比较同一动物内和动物之间的神经支配和去神经支配的构造叶。

将这种技术与现代分子方法相结合，可以为神经发育，再生和退化背后的机制提供新的见解。首先，将阴极和阳极线连接到电源。将阴极线末端的鳄鱼夹连接到部分拉直的回形针上，然后将回形针插入氢氧化钾溶液中，将其连接到罐子的侧面。

将阳极线的鳄鱼夹连接到针座的颈部。将功率调至约20伏，并将钨丝浸入氢氧化钾溶液中，以一定角度将导线从溶液中拉出，以电解方式将导线磨成细尖。在解剖显微镜下检查针尖，以确保其足够锋利。

当尖锐的针头通过轻轻触摸培养皿来弯曲时，会产生弯曲针尖。在手术当天，使用宽口径玻璃牧场移液器将10至15只幼虫转移到装满新鲜E3的35毫米培养皿中。向幼虫中加入三到五滴麻醉剂。为了确定幼虫是否得到充分的麻醉，请寻找缺乏触摸反应。

如果幼虫在三分钟后对触摸仍然有反应，再添加两到三滴麻醉剂，然后重新评估。为了固定幼虫进行手术，将一只幼虫带到只有少量E3的窄口径玻璃牧场移液器中。接下来，将约200微升熔化的1%低熔点或LMP琼脂糖放入含有幼虫的移液器中并混合，以确保幼虫悬浮在LMP琼脂糖中。将35毫米培养皿的盖子面朝上放在解剖显微镜下，然后将幼虫和琼脂糖喷射到倒置的培养皿盖上。

传播琼脂糖，使幼虫位于液滴的中心。使用钝钨针，快速但轻轻地操纵幼虫，使其横向，一只眼睛朝上。等待几分钟，让琼脂糖凝固。

沿着眼眶的边缘，使用精细电解磨的钨针的尖端刺穿眼睛周围的皮肤。然后从眼睛的颞腹侧将针的边缘滑入眼睛下方。使用受控压力将眼睛从眼窝中释放出来。

继续用针的一侧在背侧和前部按压眼睛，最终穿过视神经并释放眼睛。或者，您可以使用非常精细的手术镊子通过捏住视神经并将眼睛从内侧推到外侧来移除眼睛。成功去除眼睛后，用MMR溶液覆盖琼脂糖，通过将钨针轻轻刷在头部周围然后在其身体周围，同时用镊子稳定培养皿盖，将每个幼虫从琼脂糖中释放出来。

手术后，将幼虫置于补充有抗生素的MMR溶液中，直到第二天，然后将幼虫返回到E3并将它们饲养到实验的终点。幼虫绝症麻醉后，用4%多聚甲醛固定。将固定的幼虫悬浮在解剖显微镜下的密封板上的PBS液滴中。

通过将两个钨针穿过套管来横向固定它们，其中一个引脚位于覆盖AGM区域的着色区域后面，另一个引脚与蛋黄延伸的末端对齐。用锋利的钨针和细镊子取下眼睛。有时可以将针头穿过下颌戳到另一侧，然后取出另一只眼睛。

使用钨针从耳朵的颞侧到腹侧划伤。在运动中的相同动作中，将针头后部带到下颌，轻轻地向前拉动，直到耳朵和下颌被移除。通过将针头戳入下颌来移除另一只眼睛和耳朵。

使用镊子拉出腹侧器官和剩余的蛋黄。最后，在后脑和脊髓交界处附近的背颅皮肤上做一个浅切口。用镊子抬起皮肤，将其拉至端脑前部和周围。

用镊子去除任何剩余的组织。解开幼虫并转移到PBS中放入1.5毫升微量离心管中。用真空润滑脂将腔室载玻片固定在100毫米培养皿的盖子中。

将免疫染色和加工的幼虫转移到孔板或凹陷载玻片上，用解剖显微镜观察它们。将幼虫安装在1%LMP琼脂糖柱中的腔室载玻片上。使用玻璃经过移液器，将一个幼虫放在腔室载玻片上，尽可能少地沉积PBS。

使用相同的移液管用融化和温热的1%LMP琼脂糖覆盖幼虫。将LMP琼脂糖移液到柱中，然后尽可能对称地定位幼虫，背表面可见。切除眼睛后，在视神经鞘中观察到视网膜轴突的进行性变性。

手术后两天，RFP标记的轴突表现出快速瓦勒变性的标志，例如炙炙和碎片化。如箭头所示，在构造器右侧的神经疙内外均注意到RFP阳性点状物。到手术后四天，右颅叶的碎片轴突和RFP标记的轴突碎片显着减少，表明死亡和退化轴突的清除相对较快。

通过解剖皮肤和结缔组织的眼睛，下巴，耳朵和颅骨来暴露大脑。理想情况下，大脑在这个过程中保持完整。然而，当皮肤或下颌的颅盖被移除时，前脑的某些部分，特别是嗅球，可能会受损或完全切除。

此外，有时在刺穿或捏住皮肤以将其从大脑中拉出时，构造的侧壁被切开。没有两个样本是完全相同的。因此，您需要能够根据需要通过切除眼睛和大脑解剖来做出微妙的调整。

患者和锋利的工具是成功的关键。该技术可以通过细胞和分子方法进行跟进，例如体内活细胞成像或RNA测序，以获得对视神经结构生长和发育的分子和细胞机制的新见解。