Name: 活斑马鱼幼虫的眼睛去除以检查视觉系统的神经支配依赖性生长和发育 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学习斑马鱼幼虫单侧眼球摘除技术，用于研究视网膜输入对视顶盖发育的影响。该方法可在同一动物体内比较神经支配与去神经支配的顶盖叶，为神经发育、再生和退行性研究提供重要实验基础。

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本工作的经费主要由里德学院为KLC提供的启动资金、海伦·斯塔福德研究奖学金为OLH提供的资助以及里德学院科学研究奖学金为YK提供的支持。该项目始于Steve Wilson实验室，是与HR的合作项目，HR的研究由惠康信托学生奖学金（2009–2014）资助。我们感谢Máté Varga、Steve Wilson及Wilson实验室的其他成员对本项目初期的讨论与建议，特别感谢Florencia Cavodeassi和Kate Edwards，她们最早向KLC传授了如何在琼脂糖中包埋胚胎以及进行斑马鱼脑解剖的技术。我们还感谢Greta Glover和Jay Ewing在组装我们的钨针尖修磨装置方面提供的帮助。

本研究中的方法均依照里德学院和伦敦大学学院机构动物护理与使用委员会的指南和批准进行。有关本研究中使用的斑马鱼品系的详细信息，请参见材料表。
1. 准备材料和工具
<ol>
	<li>配制溶液。
	<ol>
		<li>通过稀释60倍浓缩储备液（300 mM NaCl、10.2 mM KCl、20 mM CaCl2-二水合物、20 mM MgCl2-六水合物，溶于去离子水中，经高压灭菌后室温保存）来制备胚胎培养基（E314）。将160 mL的60倍浓缩E3加入10 L去离子水中。室温保存。</li>
		<li>在E3中配制1%低熔点（LMP）琼脂糖。将1 g LMP琼脂糖加入100 mL E3中，在微波炉中高火加热1–2分钟至完全溶解。将熔化的琼脂糖分装至1.7 mL微量离心管中，4 °C保存。使用前在水浴中加热溶解，并置于40 °C加热块中保温备用。</li>
		<li>通过稀释10倍浓缩储备液（1 M NaCl、20 mM KCl、10 mM MgSO4、20 mM CaCl2-二水合物、50 mM HEPES，用10 M NaOH调节pH至7.5，经高压灭菌后室温保存）来配制Marc's改良林格液（MMR15）等渗溶液。将10 mL 10倍浓缩MMR加入90 mL去离子水中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照制造商说明浇注Sylgard培养板，并静置干燥数天16。</li>
	<li>电解抛光钨针（方案修改自17）。
	<ol>
		<li>首先，通过向带螺旋盖的广口玻璃瓶中加入200 mL去离子水，缓慢搅拌加入20 g KOH颗粒，配制10%（w/v）KOH溶液。 
		注意：该腐蚀性溶液具有强烈放热性。操作时应佩戴手套和护目镜，并在通风橱内搅拌。</li>
		<li>截取一段2–3 cm长的钨丝，插入针头夹持器中。</li>
		<li>将阴极和阳极导线连接至电源。将阴极导线末端的鳄鱼夹连接到部分拉直的回形针上，并将回形针插入KOH溶液中，固定在瓶壁一侧。</li>
		<li>接着，将阳极&#160;导线的鳄鱼夹连接到针头夹持器的颈部。开启电源（约20 V），将钨丝浸入KOH溶液中，并以一定角度缓慢提起，通过电解作用将钨丝尖端抛光成细尖。 
		注意：反应过程中回形针处会产生气泡。</li>
		<li>在解剖显微镜下检查针尖，确保其足够锋利。</li>
		<li>用去离子水冲洗针头，彻底去除残留KOH。预先制备多根针头，并妥善保存，以备后续幼鱼手术和解剖使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备用于直立式共聚焦显微镜观察斑马鱼样本的带腔载玻片。
	<ol>
		<li>准备玻璃载玻片和双组分环氧树脂（见材料表）。按照产品说明书混合环氧树脂，在玻璃载玻片上涂布成厚环状或矩形结构。将载玻片置于通风橱中至少固化干燥24小时后使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 胚胎采集与培养
<ol>
	<li>在傍晚/晚上早些时候，将所需基因型的成年雄性和雌性鱼配对放入繁殖盒中。次日早晨，在它们产卵后，用网筛收集新受精的卵，并转移至100 mm培养皿中的E3培养液中。</li>
	<li>将胚胎在约27.5 °C、14小时光照/10小时黑暗的条件下培养，直至手术当天。每天或根据需要更换E3培养液。</li>
	<li>从受精后5天（dpf）或手术后一天开始，每天使用装有收获的轮虫的滴管喂养幼鱼一次。幼鱼摄食数小时后，更换E3培养液以清除残留的轮虫和代谢废物。 
	&#8203;注意：手术当天不要喂食幼鱼。</li>
</ol>
3. 准备幼虫以进行手术
<ol>
	<li>手术当天，使用宽口玻璃巴斯德移液管将10-15条幼鱼转移至盛有新鲜E3培养液的35 mm培养皿中。</li>
	<li>向培养皿中加入3-5滴0.4% w/v三卡因溶液（0.4 g三卡因溶于210 mM Tris，pH 9；必要时将终溶液pH调至7.418），使终浓度约为0.0015% w/v三卡因，以麻醉幼鱼。通过轻触观察幼鱼是否无反应，判断其是否已充分麻醉。若约3分钟后仍对触碰有反应，再添加2-3滴0.4% w/v三卡因溶液，并重新评估。 
	注：在此发育阶段，可在解剖显微镜下同时观察血流、心率及运动情况。</li>
	<li>将麻醉后的斑马鱼幼鱼包埋于含E3培养液的1%低熔点琼脂糖中以固定。
	<ol>
		<li>首先，将35 mm培养皿的皿盖倒置放在解剖显微镜下。然后，用窄口玻璃巴斯德移液管吸取少量E3培养液，并吸入一条幼鱼。</li>
		<li>接着，将约200 µL已融化且温热（约40 °C）的1%低熔点琼脂糖吸入同一移液管中，与幼鱼混合。最后，将幼鱼和琼脂糖混合物挤出至倒置的培养皿盖上。</li>
		<li>使用钝头钨针迅速而轻柔地调整幼鱼位置，使其呈侧卧位，一只眼睛朝上。静置等待琼脂糖凝固（约5分钟）。 
		&#8203;注：若幼鱼未处于侧卧位时琼脂糖已凝固，需将其从琼脂糖中释放（见步骤5描述），并放回含E3和三卡因的培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 摘除眼球
<ol>
	<li>琼脂糖凝固后，将幼虫侧向放置，用一根极细的、电解 sharpened 的钨针尖端沿眼球边缘刺破眼周皮肤。</li>
	<li>接着，从眼球的颞侧腹面将针的边缘（而非针尖）滑入眼球下方，施加可控压力，使眼球脱离眼窝。</li>
	<li>使用极细的外科镊子夹住视神经，从内侧向外侧推动并摘除眼球。或者，也可持续用针的侧面从背侧和前侧压迫眼球，最终切断视神经并释放眼球。 
	&#8203;注意：若手术过程中意外刺破眼球以外的组织，应通过快速断头法迅速且人道地处死幼虫。</li>
</ol>
5. 实验终点前的术后护理
<ol>
	<li>成功摘除眼睛后，用 MMR 溶液覆盖琼脂糖。</li>
	<li>用钨针轻轻在幼体头部周围刷动，再沿其身体刷动，同时用镊子固定培养皿盖，从而将每条幼体从琼脂糖中释放出来。</li>
	<li>将单眼幼体转移至含有添加了 1:100 稀释青霉素/链霉素混合液的 MMR 溶液的 35 mm 培养皿中。在约 27.5 °C 条件下，以 14 小时光照/10 小时黑暗的周期培养胚胎。 
	&#8203;注意：添加抗生素的等渗 MMR 溶液最初有助于幼体愈合和存活。每个培养皿最多可容纳 15 条恢复中的幼体。</li>
	<li>次日，将幼体重新放回 E3 溶液中。从手术后的下午开始，每天使用装满收获的轮虫的滴管喂养幼体（约 6 dpf 及以上）。幼体进食数小时后，更换 E3 溶液以清除残留的轮虫和代谢废物。</li>
</ol>
6. 固定幼虫
<ol>
	<li>当幼虫发育至所需分析阶段时，使用致死剂量的三卡因（终浓度约 0.4%）进行麻醉，直至其心脏停止跳动。</li>
	<li>每管取最多 30 条幼虫置于 1.5 mL 微量离心管中。吸除多余的 E3 培养基，加入 0.5–1 mL 固定液（含 4% 多聚甲醛（PFA）和 4% 蔗糖的磷酸盐缓冲液（PBS））以固定组织。于 4 °C 下孵育过夜。</li>
	<li>次日用 PBS 洗涤幼虫：移除固定液后，用 PBS 冲洗幼虫 3–4 次。固定后的幼虫可在 4 °C 下保存最多 7 天，之后进行解剖。</li>
</ol>
7. 解剖幼虫以暴露大脑（改编自15）
<ol>
	<li>在解剖显微镜下，将固定的幼体悬浮于Sylgard培养皿中的PBS液滴中。通过脊索插入两根钨针（通常为长度小于2 cm的旧钨针）从侧面固定幼体，其中一根钨针置于覆盖主动脉-性腺-中肾（AGM）区域的色素区后方，另一根与卵黄囊延伸末端对齐。 
	注意：应尽可能减少钨针插入次数，因为每次穿刺都会使组织变得更加脆弱。</li>
	<li>使用非常锋利的钨针和针尖镊子，按顺序依次去除眼、耳、下颌、消化道和背侧颅骨皮肤，以暴露脑组织。
	<ol>
		<li>首先，采用类似于第4步中手术摘除眼球的技术去除眼球。然后拔出固定针，将幼体翻转至另一侧，以便接触另一只眼并重复操作。或者，也可将针从下颌穿至对侧，在不拔针的情况下移除眼球。 
		注意：若需分析该组织，此时可收集眼球（方法类似于19）。</li>
		<li>接着，用钨针从耳部的颞侧向腹侧划动。在同一动作中，将针移至下颌后方，并轻轻向前牵拉，直至耳和下颌被去除。</li>
		<li>使用镊子将腹侧器官及任何残留的卵黄组织拉出。</li>
		<li>最后，在后脑与脊髓交界处附近的背侧颅骨皮肤上做一个浅切口。用镊子提起皮肤，并向前方环绕端脑方向牵拉。若此操作困难，可从后脑的初始切口开始，先将皮肤向侧方、再向腹侧和前方牵拉，注意避免刮伤视顶盖的侧缘。 
		注意：由于中脑是研究目标，后脑可被切断；但过深的切口可能导致头部完全分离。</li>
		<li>用镊子清除任何残留组织。拔出固定针，将样本转移至1.5 mL离心管中的PBS溶液中。 
		&#8203;注意：为便于整体染色实验中的观察，应保留尾部与脑组织相连。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 脑组织脱水与保存
<ol>
	<li>从脑组织中移除 PBS，加入 1 mL 含 0.1% TritonX-100 的 PBS 溶液（PBST）。室温孵育 5–10 分钟。</li>
	<li>移除 PBST，替换为 50:50 的甲醇:PBST 溶液。室温孵育 5–10 分钟。</li>
	<li>用 100% 甲醇（MeOH）在室温下洗涤脑组织两次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在 -20 °C 条件下，将脑组织保存于 100% MeOH 中至少 16 小时，之后进行免疫组织化学或其他整体染色实验。 
	&#8203;注意：脑组织可在 -20 °C 的 MeOH 中保存长达 2 年。</li>
</ol>
9. 免疫组织化学
注意：有关斑马鱼多种实用整体染色技术的成熟方案可参见 ZFIN20。本文稿提供了单眼与双眼幼鱼的比较示例，这些幼鱼使用抗体进行免疫染色，抗体分别识别红荧光蛋白（RFP）——在 Tg[atoh7:RFP] 品系中视神经轴突表达该蛋白（图2）——或磷酸化组蛋白H3（PH3）——可标记有丝分裂细胞（图3）。以下总结了适用于整体胚胎和幼鱼的标准免疫组织化学方案。
<ol>
	<li>首先，在室温下通过梯度甲醇：PBST 溶液对幼虫大脑进行再水化处理：将样本在 50:50 甲醇：PBST 溶液中孵育 5 分钟，随后在 30:70 甲醇：PBST 溶液中孵育 5 分钟，最后用 PBST 溶液洗涤 3 次。</li>
	<li>为使脑组织通透，将脑组织在补充有蛋白酶K（PK）的PBST中孵育，PK终浓度为20 µg/ml，37 °C孵育30分钟。将PK以10 mg/mL的分装量储存于-20 °C，使用前解冻。</li>
	<li>去除PK溶液，用PBST冲洗脑组织，每次15分钟，共洗3次，以除去残留的酶。</li>
	<li>将透化的脑组织在 4% PFA 中 25 °C（或室温）孵育 20 分钟，重新固定。随后，移除 PFA，并用 PBST 漂洗脑组织 3 次，每次 15 分钟，以洗去残留的固定剂。</li>
	<li>用新配制的免疫阻断缓冲液（IB缓冲液，含10%正常山羊血清和1% DMSO的PBST）替换最后一次PBST漂洗液，室温孵育至少1小时。</li>
	<li>将一抗用 IB 缓冲液稀释至适当浓度（例如., RFP 抗体稀释比例为 1:500，PH3 抗体稀释比例为 1:300。</li>
	<li>从脑组织中移除IB缓冲液，替换为一抗稀释液。将样本置于4 °C、以轻微摇动的水平摇床中孵育过夜。确保离心管稳固地侧向放置。</li>
	<li>次日早晨，用微量移液器移除一抗溶液，用PBST冲洗数次，然后在室温下用PBST洗涤脑组织，每次30分钟，共4次。 
	注意：如果在 4 °C 下保存，一抗稀释液可在约 7 天内重复使用一次。</li>
	<li>用 IB 缓冲液冲洗脑组织，同时将二抗按适当浓度稀释于 IB 缓冲液中（例如., 1:500（Alexa Fluor 568 标记的抗兔抗体）</li>
	<li>移除 IB 缓冲液，替换为二抗稀释液。将试管侧放于旋转摇床上，4 °C 轻柔振荡孵育过夜。</li>
	<li>次日早晨，移除二抗溶液，用PBST冲洗，然后在室温下用PBST洗涤脑组织，每次30分钟，共4次。</li>
	<li>用 DAPI 或 ToPro3（在 PBST 中按 1:5,000 稀释，4 °C 过夜）进行复染。</li>
	<li>次日早晨，将幼虫大脑转移至PBS中，并继续进行下述的封片与成像步骤。</li>
</ol>
10. 封片与成像
<ol>
	<li>用真空脂将带腔室的载玻片固定在100 mm培养皿的盖子上。</li>
	<li>将免疫染色并处理后的幼虫转移至多孔板或凹玻片中，以便在解剖显微镜下观察。</li>
	<li>将幼虫以1%低熔点琼脂糖（LMP agarose）柱的形式固定在带腔室的载玻片上。
	<ol>
		<li>使用玻璃巴斯德吸管将一条幼虫置于带腔室的载玻片上，尽量减少PBS的带入。用同一吸管将熔融的1% LMP琼脂糖（约40 °C）覆盖在幼虫上。</li>
		<li>用钝头钨针或镊子将琼脂糖拉成柱状，并尽可能对称地调整幼虫位置，使其背侧朝上可见。</li>
		<li>对剩余幼虫重复此操作。</li>
		<li>待琼脂糖凝固后，加入数滴PBS覆盖，并将其置于共聚焦显微镜的载物台上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将物镜与样品对齐，使用透射光聚焦显微镜，并用适当的激光激发样品。 
	注：本示例中分别使用405 nm和568 nm波长的激光激发DAPI和RFP。</li>
	<li>通过移动滑块调节增益、偏移和激光功率，使其相对于信号强度和所用探测器处于适当水平。检查每个通道的直方图，并点击图像上方的饱和指示器状态按钮，评估曝光程度，确保无像素饱和且信噪比较高。有关斑马鱼细胞及亚细胞分辨率成像的最佳共聚焦参数示例，参见21。</li>
	<li>使用鼠标滚轮确定样品的最上层和最下层，设定z平面堆栈的上下限。点击设定图像采集的上下限，然后点击立即运行按钮触发z堆栈采集。 
	注：根据脑组织固定对称性的不同，9 dpf斑马鱼幼鱼脑组织的总z轴深度约为150–200 µm。</li>
	<li>处理图像并进行着色时应考虑色盲可访问性（例如，双色图像使用蓝色与橙色或品红色与绿色）。可在图像采集软件或图像处理软件（如Adobe Photoshop）中设置查找表（lookup tables）。</li>
	<li>在Photoshop中处理以8位TIFF（Tagged Image File Format）格式保存的原始显微照片时，依次执行以下步骤：(i) 将图像模式转换为RGB；(ii) 在图像 | 调整菜单中选择曲线选项；(iii) 将相应颜色通道的输出滑动至0或255，以获得所需颜色。例如，要获得绿色信号，选择红色通道并将其输出滑至0；然后选择蓝色通道，也将其输出滑至0。类似地，要获得品红色信号，选择绿色通道并将其输出滑至0；红色和蓝色通道保持不变。 
	注：在免费的Gnu图像处理程序（GIMP）中也可执行类似操作。</li>
	<li>使用ImageJ22中的细胞计数插件（位于插件菜单的分析下）手动量化表达特定标记物的细胞数量。有关在ImageJ中进行细胞计数的使用示例，可参考多种教程，包括23。</li>
	<li>在统计软件（如RStudio）中生成数据的图形化表示（参见补充数据中的.Rmd文件）。</li>
</ol>

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<li>Gnuegge, L., Schmid, S., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+activity-deprived+zebrafish+mutant+macho+reveals+an+essential+requirement+of+neuronal+activity+for+the+development+of+a+fine-grained+visuotopic+map%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Analysis of the activity-deprived zebrafish mutant macho reveals an essential requirement of neuronal activity for the development of a fine-grained visuotopic map.</a> The Journal of Neuroscience. 21 (10), 3542-3548 (2001).</li>
<li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astyanax+surface+and+cave+fish+morphs%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Astyanax surface and cave fish morphs.</a> EvoDevo. 11 (1), 14(2020).</li>
<li>Sieger, D., Peri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+studying+microglia%3A+The+first%2C+the+popular%2C+and+the+new%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Animal models for studying microglia: The first, the popular, and the new.</a> Glia. 61 (1), 3-9 (2013).</li>
<li>Svahn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ramified+microglia+from+early+macrophages+in+the+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum.</a> Developmental Neurobiology. 73 (1), 60-71 (2013).</li>
<li>Herzog, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+clearance+of+cellular+debris+by+microglia+limits+secondary+neuronal+cell+death+after+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Rapid clearance of cellular debris by microglia limits secondary neuronal cell death after brain injury in vivo.</a> Development. 146 (9), (2019).</li>
<li>Chen, J., Poskanzer, K. E., Freeman, M. R., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-imaging+of+astrocyte+morphogenesis+and+function+in+zebrafish+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Live-imaging of astrocyte morphogenesis and function in zebrafish neural circuits.</a> Nature Neuroscience. 23 (10), 1297-1306 (2020).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述技术展示了研究斑马鱼脊椎动物视觉系统发育的多种方法之一。其他研究人员已发表过分离胚胎视网膜并进行基因表达分析19，或在视顶盖中可视化神经元活动的方法30。本文提供了一种探索视网膜输入差异如何影响视顶盖中细胞行为的方法。
为确保摘除眼球手术成功以及幼体术后存活，必须保证幼体健康，并使用1%琼脂糖进行充分麻醉和固定。此外，镊子和钨针必须非常锋利且洁净。手术前后24小时内不喂食幼体，其存活率最高；而在含抗生素的MMR培养液中饲养幼体可加快愈合过程。重要的是，MMR具有较高的离子强度，尤其是较高的钙离子浓度，有助于促进伤口愈合14。然而，长时间暴露于较高盐浓度环境可能降低存活率，这一点在胚胎期斑马鱼中已有报道31。最关键的步骤之一是固定，以确保后续脑组织解剖的成功，而成功的脑组织解剖对于免疫染色样本图像的数据分析至关重要。使用新配制的含4%蔗糖的4%多聚甲醛（被亲切地称为“甜固定液”）通常有助...

本方法旨在研究视网膜输入如何影响斑马鱼脑中视觉处理中枢——视顶盖的生长与发育。通过摘除一只眼睛，随后比较视顶盖的两侧结构，可在同一标本内观察并归一化视顶盖的变化，从而实现多个标本间的有效比较。将现代分子生物学方法与该技术相结合，将有助于揭示视觉系统生长与发育的机制，以及轴突退变与再生的内在机理。
感觉系统——视觉、听觉和躯体感觉——从外部器官收集信息，并将这些信息传递至中枢神经系统，从而在中脑形成对外部世界的“图谱”1,2。对于包括许多鱼类在内的几乎所有脊椎动物而言，视觉是占主导地位的感觉模式。视网膜是眼球中的神经组织，通过主要由感光细胞、双极细胞和视网膜神经节细胞（RGCs）构成的神经回路来获取信息，其中RGCs是视网膜的投射神经元。RGCs具有长长的轴突，这些轴突沿视网膜内表面延伸至视神经乳头，在此处聚集成束并共同穿过大脑，最终终止于中脑背侧的视觉处理中枢。这一结构在鱼类和其他非哺乳类脊椎动物中称为视顶盖，与哺乳动物的上丘同源3。
视顶盖是位于背侧中脑的双侧对称多层结构。在斑马鱼和大多数其他鱼类中，视顶盖的每个半球仅接收来自对侧眼睛的视觉输入，因此左视神经终止于右侧视顶盖半球，而右视神经终止于左侧视顶盖半球4（图1）。与哺乳动物相应的上丘类似，视顶盖整合视觉信息与其他感觉输入，包括听觉和躯体感觉，调控视觉注意力的转移以及扫视等眼球运动1,5,6。然而，与哺乳动物的上丘不同，视顶盖持续从位于视顶盖半球内侧和尾侧边缘附近的一个特化的干细胞生态位——即视顶盖增殖区——产生新的神经元和胶质细胞7。视顶盖及其他中枢神经系统区域中增殖性前体细胞的维持，在一定程度上促成了斑马鱼中所记录的显著再生能力8。
先前对盲眼或单眼鱼类大脑的研究表明，视顶盖的大小与其接收到的视网膜神经支配量呈正比9,10,11。在成年洞穴鱼中，其眼睛在早期胚胎发育阶段即发生退化，其视顶盖明显小于亲缘关系相近但具有视力的表层鱼类9。在胚胎发育期间，若将洞穴鱼内源晶状体替换为表层鱼的晶状体，可阻止其眼睛退化。当这些单眼洞穴鱼生长至成年时，受到神经支配的视顶盖半叶所含细胞数量比未受支配的半叶多出约10%9。类似地，在经化学处理以在同一斑马鱼幼体中产生不同大小眼睛的实验中，视顶盖中接受更多神经支配的一侧体积更大且含有更多的神经元10。对成年金鱼进行视神经压榨实验的结果表明，神经支配可促进细胞增殖，当神经支配被破坏时，视顶盖细胞的增殖水平下降11。
近期多项研究证实并拓展了这些经典工作，提供了数据表明，由神经支配引发的细胞增殖至少在一定程度上受到BDNF-TrkB信号通路的调控12,13。关于视顶盖的生长与发育，仍存在许多未解的问题，包括发育中的感觉系统如何应对损伤和轴突退化、哪些细胞与分子信号使视网膜输入能够调控视顶盖的生长、这些机制在何时被激活，以及与神经支配相关的细胞增殖和分化是否使视网膜与其靶组织能够协调生长速率并确保精确的视网膜拓扑映射。此外，通过手术方法（如下文所述）对斑马鱼视觉系统进行探究，还可回答有关活动依赖性发育的更广泛的问题。
为了研究神经活动（特别是视觉输入）改变细胞存活和增殖的细胞与分子机制，本方法在单个斑马鱼幼体中直接比较了有神经支配和去神经支配的视顶盖叶（图1）。该方法可用于记录视网膜神经节细胞（RGC）轴突在视顶盖中的退变过程，并验证有丝分裂细胞的数量与神经支配相关。
<img alt="斑马鱼幼体眼球摘除示意图，侧视图与背视图，神经支配，发育研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63509/63509fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：单侧眼球摘除前后斑马鱼幼体的示意图。（A）在解剖显微镜下观察到的5 dpf幼体示意图。每个幼体被包埋于低熔点琼脂糖中，并呈侧向定位，随后使用带有锋利钩状尖端的钨针将朝上的眼球（本例中为左眼）挖出。（B）经（A）所示手术后9 dpf幼体的背侧视图示意图。仅显示了来自右眼的三条高度简化的视网膜神经节细胞（RGC）轴突，其去束化并与左侧视顶盖叶中的神经元形成连接。缩写：dpf = 受精后天数；dps = 手术后天数；RGC = 视网膜神经节细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63509/63509fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;设备与耗材：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>繁殖盒</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>道康宁高真空润滑脂</td><td>Sigma 或同等供应商</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>锥形瓶（125 mL）</td><td></td><td></td><td>用于配制含抗生素的Marc's改良Ringer液，以供手术后孵育使用。</td></tr><tr><td>精细镊子 - Dumont #5</td><td>精细科学工具（FST）</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德吸管</td><td>DWK Lifescience</td><td>63A53 &amp;& 63A53WT</td><td>用于移液胚胎和幼鱼。</td></tr><tr><td>用于显微镜观察的载玻片</td><td>VWR 或同等供应商</td><td>48311-703</td><td>标准玻璃显微镜载玻片可从多家不同的实验室供应商订购。</td></tr><tr><td>玻璃器皿，包括量瓶和量筒</td><td></td><td></td><td>用于配制和储存溶液。</td></tr><tr><td>2组分环氧树脂</td><td>ACE Hardware 或其他 Gorilla Glue 或同等产品的供应商</td><td>0.85 oz 注射器</td><td>https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793</td></tr><tr><td>微量离心管（1.7 mL）</td><td>VWR 或同等供应商</td><td>22234-046</td><td></td></tr><tr><td>镀镍针夹（17 cm 长度）</td><td>精细科学工具（FST）</td><td>26018-17</td><td>用于在磨尖钨丝及进行手术/解剖时固定钨丝。</td></tr><tr><td>尼龙网茶漏或等效物</td><td>速卖通或同等平台</td><td></td><td>用于在斑马鱼产卵后收集卵；https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html</td></tr><tr><td>回形针</td><td></td><td></td><td>用于钨针 sharpening 装置。</td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Fischer Scientific 或同等供应商</td><td>50-190-0267</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>Fischer Scientific 或同等供应商</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>移液管泵</td><td>SP Bel-Art 或同等产品</td><td>F37898-0000</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾（KOH）</td><td>Sigma</td><td>909122</td><td>用于钨针 sharpening 装置。在通风橱中，通过将 KOH 颗粒加入去离子水中，配制 10% w/v 的 KOH 溶液。</td></tr><tr><td>电源（可变电压）</td><td></td><td></td><td>用于钨针尖 sharpening 装置。任何可调电压的电源均可使用（甚至可用于凝胶电泳的电源）。</td></tr><tr><td>Sylgard 184 弹性体试剂盒</td><td>道康宁</td><td>3097358</td><td></td></tr><tr><td>钨丝（直径 0.125 mm）</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>TGW0515</td><td>锐化钨针以去除眼睛并解剖幼鱼。</td></tr><tr><td>可变温度加热模块</td><td>The Lab Depot 或同等供应商</td><td>BSH1001 或 BSH1002</td><td>设定为40-42 &amp;deg;实验前 C 阶段。</td></tr><tr><td>宽口玻璃罐带盖（例如，干净的果酱罐或萨尔萨酱罐）</td><td></td><td></td><td>用于钨针 sharpening 装置。</td></tr><tr><td>带鳄鱼夹引线的导线</td><td></td><td></td><td>用于钨针 sharpening 装置。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微镜：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td></td><td></td><td>任何类型均可使用，但首选带有可调节透射光的镜面底座。</td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦显微镜</td><td></td><td></td><td>建议使用高数值孔径（NA）、20-25倍的水浸物镜。&lt;br/&gt; 此处使用显微镜控制和图像采集软件（尼康的 NIS-Elements），但任何共聚焦显微镜均可适用。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;手术与解剖用试剂：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>用于 Marc's 改良 Ringer 液 (MMR) 和胚胎培养基 (E3)。</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td>对于马可氏改良林格液（MMR）。</td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td>在胚胎培养基（E3）或Marc's改良Ringer液（MMR）中配制1%溶液。</td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Sigma</td><td>1374248</td><td>用于胚胎培养基（E3）。</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td>对于马可氏改良林格液（MMR）。</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>19210</td><td>将8%（w/v）的储存液用2倍浓缩的PBS（由10倍浓缩PBS储存液稀释而成）稀释。</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma</td><td>P4333-20ML</td><td>在马氏改良林格液中按1:100稀释。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）片剂</td><td>诊断生物系统</td><td>DMR E404-01</td><td>用去离子水配制10倍浓缩液，经高压灭菌后室温保存。使用时稀释至1倍工作浓度。</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td>用于 Marc 的改良 Ringer 液 (MMR) 和胚胎培养基 (E3)。</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>用于 Marc's 改良 Ringer 液（MMR）和胚胎培养基（E3）。</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td>配制10 M溶液，并用于将MMR的pH值调节至7.4。</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Pentair</td><td>100G #TRS1</td><td>配方：https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;免疫组织化学试剂：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexafluor 568 标记的二抗用于检测兔 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11011</td><td>以1:500稀释比例用于整体免疫组织化学。</td></tr><tr><td>DAPI 或 ToPro3</td><td>Invitrogen</td><td>1306 或 T3605</td><td>用DMSO配制1 mg/mL的溶液；用于复染时按1:5,000稀释。</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>免疫阻断缓冲液的一种成分。</td></tr><tr><td>甲醇（MeOH）</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>将甲醇与PBST等水溶液混合是放热反应。请至少提前数小时配制甲醇/PBST溶液，或在使用前置于冰上冷却。</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-062Z</td><td>免疫阻断缓冲液的一种成分。可分装为 1-10 mL 体积，于 -20 ℃ 保存。 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>检测磷酸化组蛋白 H3 的一抗</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>以1:300稀释比例用于整体免疫组织化学。</td></tr><tr><td>检测红色荧光蛋白（RFP；可检测dsRed衍生物）的一抗</td><td>MBL International</td><td>PM005</td><td>以1:500稀释比例用于整体免疫组织化学。</td></tr><tr><td>蛋白酶K（PK）</td><td>Sigma</td><td>P2308-10MG</td><td>配制10 mg/mL的PBS储存液，使用时稀释至10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>在 PBS 中配制 20%（v/v）的储存液。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;数据分析软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ（Fiji）</td><td></td><td></td><td>用于图像分析的免费软件；https://imagej.net/software/fiji/</td></tr><tr><td>RStudio</td><td></td><td></td><td>用于统计分析和数据可视化的免费软件；https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 或 GIMP</td><td></td><td></td><td>专有图像处理软件（如 Adobe Photoshop 和 Illustrator）常用于制作图表。免费替代软件是 Gnu 图像处理程序（GIMP；https://www.gimp.org/）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;斑马鱼品系。&lt;/strong&gt; 本研究使用了 AB、TU， &lt;i&gt;Tg[atoh7:RFP]&lt;/i&gt; 品系</td><td></td><td></td><td>可从以下网址获取：&amp;nbsp; 美国斑马鱼国际资源中心（https://zebrafish.org/home/guide.php）或欧洲斑马鱼资源中心（https://www.ezrc.kit.edu/）。尚未存入上述任一资源中心的特异性转基因品系，可在相关论文发表后向个别实验室申请获取。</td></tr></tbody></table>

活体斑马鱼幼鱼眼球摘除以研究视觉系统发育和生长对神经支配的依赖性

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

斑马鱼具有显著的终生生长能力和再生能力。例如，在胚胎发生期间建立的特化干细胞微环境可支持整个视觉系统（包括眼睛和脑）的持续生长。视网膜与视顶盖之间的协调生长确保了在眼睛和脑中新增神经元时，视网膜拓扑投射图的精确建立。为了研究视网膜轴突是否为调控顶盖干细胞和前体细胞的行为（如存活、增殖和/或分化）提供关键信息，有必要能够在同一只动物以及不同动物之间比较有神经支配和无神经支配的顶盖叶。
通过手术摘除活体斑马鱼幼鱼的一只眼睛，随后观察其视顶盖，可实现这一目标。配套视频演示了如何麻醉幼鱼、用电解法 sharpen 钨针，并使用这些钨针摘除一只眼睛。接着展示了如何从固定后的斑马鱼幼鱼中解剖出脑组织。最后，视频概述了免疫组织化学实验方案，并演示了如何将染色后的胚胎包埋于低熔点琼脂糖中，以用于显微镜观察。

为了确认眼球摘除是否完全，并评估视顶盖的变化，实验在 Tg[atoh7:RFP] 品系中进行，该品系使用膜定位的红色荧光蛋白（RFP）标记所有视网膜神经节细胞（RGCs），从而标记从视网膜投射并形成视神经的所有轴突24。尽管使用该品系并非绝对必要，但它能够直观地观察和可视化视神经在视顶盖神经 Neuropil 中的终止区域。其他标记视神经的方法也是可行的，例如使用亲脂性染料 DiI 或 DiO 进行轴突示踪25,26，或利用 brainbow 技术进行多光谱标记27。
如图2所示，在摘除眼睛后，视顶盖神经毡中的视网膜轴突出现进行性退变。术后两天时，RFP标记的轴突表现出快速沃勒变性（Wallerian degeneration）28的典型特征，如出...

本文介绍了如何通过手术从活体斑马鱼幼体中摘除眼球，作为研究视网膜输入如何影响视顶盖生长与发育的第一步。此外，本文还提供了幼体麻醉、固定和脑组织解剖的方法，并进一步介绍了免疫组织化学染色和共聚焦成像技术。

斑马鱼表现出显著的终生生长能力和再生能力。例如，在胚胎发生期间建立的特化干细胞微环境……

因此，我的实验室致力于研究眼睛和大脑如何协同生长。该技术使我们能够探究视网膜输入如何影响大脑的生长与发育。通过对活体斑马鱼幼鱼进行单侧眼球切除手术，随后观察其视顶盖，我们可以在同一个体以及不同个体之间比较受神经支配和去神经支配的顶盖叶。将该技术与现代分子学方法相结合，可为揭示神经发育、再生及退行的潜在机制提供新的见解。首先，将阴极和阳极导线连接至电源。将阴极导线末端的鳄鱼夹夹在一个部分拉直的回形针上，并将该回形针插入氢氧化钾溶液中，固定在容器侧壁。将阳极导线的鳄鱼夹连接到持针器的颈部。将电源调至约 20 伏，然后将钨丝浸入氢氧化钾溶液中，并以一定角度将钨丝从溶液中拉出，通过电解作用将钨丝尖端 sharpen 成精细的尖头。在解剖显微镜下检查针尖，确保其足够锋利。弯曲的针尖是通过将锋利的针尖轻轻接触培养皿而形成的。手术当天，使用宽口玻璃移液管将10至15条幼虫转移至一个盛有新鲜E3培养基的35毫米培养皿中。向幼虫中加入三到五滴麻醉剂。要判断幼虫是否已被充分麻醉，应观察其是否丧失触碰反应。如果三分钟后幼体对触碰仍有反应，则再加入两到三滴麻醉剂，并重新评估。为将幼体固定以进行手术，用一根窄口玻璃巴斯德吸管吸取一只幼体，仅保留少量E3培养液。接着，将约200 µL融化的1%低熔点（LMP）琼脂糖吸入含有幼体的吸管中，并轻轻混合，确保幼体悬浮于LMP琼脂糖中。将一个35毫米培养皿的皿盖正面朝上置于解剖显微镜下，然后将幼体与琼脂糖挤到倒置的培养皿皿盖上。将琼脂糖铺开，使幼虫位于液滴中央。使用钝头钨针快速而轻柔地调整幼虫位置，使其呈侧卧姿态，一侧眼睛朝上。静置数分钟，待琼脂糖凝固。沿着眼眶边缘，使用精细电解 sharpened 的钨针尖端刺穿眼睛周围的皮肤。然后从眼睛的颞侧腹面将针的边缘滑入眼球下方。施加可控压力，使眼球从眼窝中脱离。用针的侧面持续向上方和前方按压眼球，最终切断视神经并摘除眼球。或者，也可使用非常精细的手术镊，夹住视神经，将眼球从内侧向外侧推挤以摘除。成功摘除眼球后，用MMR溶液覆盖琼脂糖，用钨针轻轻在幼体头部周围、继而在其身体周围刷动，同时用镊子固定培养皿盖子，以使每只幼体从琼脂糖中释放出来。手术后，将幼虫置于添加了抗生素的MMR溶液中，培养至次日，随后将幼虫转移回E3溶液中，并继续培养至实验终点。幼虫经终末麻醉后，用4%多聚甲醛固定。在解剖显微镜下，将固定后的幼虫悬浮于密封保护板上的PBS液滴中。通过将两根钨针穿过脊索，从侧面固定标本，其中一根钨针置于覆盖AGM区域的色素区后方，另一根与卵黄延伸末端对齐。使用锋利的钨针和精细镊子去除眼睛。有时可将针从下颌穿至对侧，以摘除另一只眼。使用钨针从耳部的颞侧向腹侧划开。在连续动作中，将针移至下颌后方，轻轻向前牵拉，直至移除耳部和下颌。通过将针刺入下颌，戳出另一侧的眼和耳。用镊子取出腹侧器官和残留的卵黄。最后，在后脑与脊髓交界处附近的背侧颅骨皮肤上做一个浅切口。用镊子提起皮肤，向前并围绕端脑将其拉开。用镊子去除残留的组织。取下幼虫并转移至含有 PBS 的 1.5 毫升微量离心管中。用真空脂将带孔载玻片固定在 100 毫米培养皿的盖子上。将免疫染色并处理后的幼虫转移至孔板或凹玻片中，以便使用解剖显微镜观察。将幼虫用1% LMP琼脂糖柱固定在带腔室的载玻片上。使用玻璃巴斯德吸管，取一只幼虫置于带腔室的载玻片上，尽量减少PBS的带入量。使用同一支移液器将熔化并预热的1%LMP琼脂糖覆盖在幼虫上。将LMP琼脂糖以柱状滴加，然后尽可能对称地摆放幼虫，使其背侧表面可见。去除眼睛后，在视顶盖神经毡中观察到视网膜轴突进行性退化。术后两天，RFP标记的轴突表现出快速沃勒变性（Wallerian degeneration）的典型特征，例如肿胀和断裂。在视顶盖右侧的神经毡内和神经毡外均可见RFP阳性点状结构，如箭头所示。术后四天，右侧视顶盖叶中断裂的轴突及RFP标记的轴突碎片显著减少，表明正在死亡和退变的轴突被相对较快地清除。通过解剖眼部、下颌、耳部以及颅顶的皮肤和结缔组织暴露脑组织。理想情况下，脑组织在此过程中应保持完整。然而，当去除皮肤或下颌的颅顶时，前脑部分（尤其是嗅球）可能受到损伤或被完全移除。此外，在刺破或夹取皮肤以将其从脑组织上剥离时，有时会切到中脑的侧突。每个样本都不完全相同，因此在摘除眼球和解剖脑组织的过程中，需要能够根据实际情况进行细微的调整。患者和锋利的工具是成功的关键。该技术可结合细胞和分子方法进行后续研究，例如活体活细胞成像或RNA测序，以深入理解视顶盖生长与发育的分子和细胞机制。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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