Name: 实时检测和捕获共培养物中的侵袭细胞亚群 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 学习使用实时细胞分析技术检测和捕获共培养物中的侵袭性癌细胞亚群。该方法通过监测电阻抗变化评估基质或免疫细胞对肿瘤侵袭的影响，为癌症治疗策略提供依据。

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我们感谢犹他大学亨斯迈癌症研究所的 Alana Welms 博士为我们提供了患者来源的异种移植瘤（HCI-010）。本研究得到了美国国立卫生研究院基金 R01CA205632、R21CA226542 的资助，以及安捷伦科技公司部分资助的支持。

该研究经乔治城大学机构审查委员会（IRB # 2002-022）审核，并被认定为&#34;豁免&#34;。新鲜获取的骨髓组织采集自已去标识化的废弃健康人骨髓收集滤器。
1. 新型腔室设计（图2）
<ol>
	<li>打开一个新的双室细胞分析仪板，将带有电极的上室放置一旁备用。</li>
	<li>使用铣床将细胞分析仪板U形底部孔的底部削去2 mm。</li>
	<li>使用紫外光固化胶将一片尺寸为2 cm × 7 cm、孔径为0.2 µm的聚醚砜（PES）膜粘附在削平后的孔底部。静置30分钟，确保胶完全固化且呈惰性。</li>
	<li>使用铣床沿两侧切出两个纵向狭缝（1.5 mm × 5.6 mm），以便与新制作的第三室的凸缘卡合。</li>
	<li>使用铣床制作一个第三个多碳酸酯室，其整体尺寸与细胞分析仪板相同，为72 mm × 18 mm（材料表）。</li>
	<li>制作深度为4.8 mm、直径为4.75 mm的孔，以复制细胞分析仪板的16孔设计，每孔可容纳90 µL体积。</li>
	<li>在侧面制作两个三角形凸缘，使该室能够卡入第1.4步中创建的原始狭缝。三角形的水平边为1.5 mm，垂直边为1.4 mm，斜边为2.052 mm。</li>
	<li>在短边处制作一个直径为50.8 mm、高度为1.397 mm的旋钮，以嵌入原始板的凹槽中（图2，中图）。</li>
	<li>每个孔使用一个0.9 mm厚的橡胶垫圈，以实现密封配合。</li>
</ol>
2. 细胞培养（MDA-MB-231、DCIS、DCIS-Δ4、J2-成纤维细胞）
<ol>
	<li>用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤贴壁细胞培养物（约 70% 汇合度）。</li>
	<li>加入 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液使细胞脱落。</li>
	<li>用含血清的细胞培养基中和胰蛋白酶溶液，并取部分细胞悬液计数细胞。 
	&#8203;注意：具体的细胞培养基见表 1。</li>
</ol>
3. 患者来源异种移植瘤的解离
<ol>
	<li>使用无菌手术刀将新鲜的肿瘤组织块（1 cm2）切碎成细小的匀浆。</li>
	<li>将组织匀浆放入一个50 mL锥形管中，加入20 mL DMEM F12培养基，培养基中添加3 mg/mL胰蛋白酶和2 mg/mL胶原酶。</li>
	<li>在37 °C条件下，以150 RPM的转速在恒温振荡器中孵育20分钟。</li>
	<li>在500 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>加入20 μL DMEM F12培养基（含2% FBS）重悬细胞，300 × g 离心5分钟，弃去上清液。重复洗涤两次。</li>
	<li>用1 mL PDX培养基（表1）重悬细胞，进行细胞计数。</li>
</ol>
4. 骨髓细胞提取
<ol>
	<li>用 25 mL 1× PBS 冲洗骨髓（BM）收集滤器。 
	注意：本研究中，向医院使用过的骨髓收集滤器中加入 PBS，以收集滤器中残留的骨髓。</li>
	<li>将冲洗所得的骨髓缓慢加入含有 25 mL 密度梯度介质的 50 mL 锥形管中，注意尽量保持两层液体分离。</li>
	<li>在 18 °C 下以 800 × g 离心 20 分钟。</li>
	<li>离心后吸除上层液体（脂肪/血浆），并将密度梯度介质上方含有骨髓细胞的白色层转移 5 mL 至 15 mL 锥形管中。 
	&#8203;注意：也可将 5 mL 移液器插入上层，直至接触中间层（骨髓），然后缓慢吸取中间层，过程中不移动移液器。</li>
	<li>用 1× PBS 加满 15 mL 锥形管（约 10 mL），在 300 × g 下离心 15 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，剩余的白色沉淀即为骨髓细胞。</li>
	<li>若沉淀中观察到红细胞，加入 5 mL 红细胞裂解液（材料表），室温静置 5 分钟。在 300 × g 下离心 5 分钟后弃去上清液。</li>
	<li>加入 10 mL 1× PBS 洗涤细胞，在 300 × g 下离心 5 分钟&#160;并弃去上清液。重复红细胞裂解步骤（步骤 4.7），直至沉淀呈白色。</li>
</ol>
5. 细胞接种与组装
<ol>
	<li>将三个无菌腔室均放入组织培养超净台中。</li>
	<li>找到下层腔室短边上的凸钮。调整下层腔室方向，使凸钮朝向操作者。</li>
	<li>在下层腔室的每个孔中加入90 μL培养基，含30,000–50,000个细胞。避免产生气泡。这些为基质细胞，可分泌因子，但不会被上层腔室的电极检测到。</li>
	<li>在两个下层腔室孔中使用含5%胎牛血清的培养基作为细胞迁移的阳性对照；使用不含血清的培养基作为阴性对照。</li>
	<li>将含有细胞的下层腔室在超净台中静置10–15分钟，使细胞沉降。 
	注意：若细胞为贴壁细胞或悬浮生长，建议执行此步骤。</li>
	<li>将下层腔室旋转90°，并将中间腔室置于其上，使下层腔室的凸钮插入中间腔室的凹槽中。 
	注意：组装后，下层腔室的凸钮与中间腔室的蓝点应位于相对的两端。</li>
	<li>垂直向下按压，直至组件长边两侧均发出“咔哒”声。</li>
	<li>在中间腔室的所有孔中加入160 μL&#160;无血清培养基。</li>
	<li>加样后应可见呈圆顶状的弯月面；若不可见，应根据移液器校准调整最终体积。避免产生气泡。</li>
	<li>将上层腔室电极面朝下放置于中间腔室上，确保中间腔室与上层腔室的蓝点对齐。</li>
	<li>垂直向下按压，直至组件长边两侧均发出“咔哒”声。</li>
	<li>向上层腔室中加入25–50 μL&#160;无血清培养基。</li>
	<li>将组装好的腔室系统安装至组织培养孵箱中的多功能细胞分析仪上，静置30分钟后再测量背景值。 
	注意：此平衡时间对于阵列稳定至关重要，可同时用于准备待加入上层腔室的细胞系。</li>
	<li>测量背景值（见第6节），然后将组件放回组织培养超净台中。</li>
	<li>在上层腔室的每个孔中加入100 μL&#160;无血清培养基，含30,000–50,000个细胞。这些细胞在成功穿过膜后将被电极检测到。 
	注意：为获得最大响应信号，建议在进行检测前6–18小时将细胞培养于无血清或低血清培养基中。</li>
	<li>将组件在超净台中静置30分钟，然后再安装至多功能细胞分析仪上进行阻抗测量。</li>
</ol>
6. 背景与阻抗测量
<ol>
	<li>将阵列放入多功能细胞分析仪的支架中。</li>
	<li>打开细胞分析软件，并选择要使用的支架。</li>
	<li>点击 消息 标签，确认显示连接正常，以确保阵列已正确放置在支架中，且电极与传感器对齐良好。</li>
	<li>点击 实验记录 标签，并尽可能填写有关实验的详细信息。</li>
	<li>点击 布局 标签，并填写阵列布局的描述。</li>
	<li>点击 时间表 标签，从 步骤 菜单中添加两个步骤：一个背景测量步骤（一次扫描）和一个测试步骤（共100次扫描，每15分钟一次，总计25小时）。</li>
	<li>当阵列在多功能细胞分析仪的培养箱中放置30分钟后，点击 运行 按钮以开始背景测量。此时将弹出一个窗口，提示选择用于保存数据的文件夹。</li>
	<li>背景测量完成后，将阵列从支架中取出，并放回细胞培养超净台中。</li>
	<li>按照步骤5.13所述，向顶室中加入细胞，并将组件保留在组织培养超净台中30分钟，使细胞沉降。</li>
	<li>将阵列重新放入多功能细胞分析仪中，并检查 消息 标签是否显示连接正常。</li>
	<li>点击 运行 按钮以开始阻抗测量。</li>
	<li>点击 绘图 标签以监控信号进展。</li>
	<li>如果在25小时之前达到实验终点，请从 执行 下拉菜单中点击 中止 步骤。</li>
	<li>要导出数据，可右键点击图表，从列表格式中选择 复制 ，然后将数据粘贴至电子表格中。 
	&#8203;注意：数据可导出为细胞指数或Δ细胞指数。也可选择导出图表和/或布局信息。</li>
</ol>
7. 细胞脱离与收集
<ol>
	<li>在多功能细胞分析仪上实时监测迁移速率，以确定感兴趣的终止时间点（6–18 小时）。 
	注意：终止时间点取决于细胞的侵袭速率以及何时获得相对于阴性对照明显可辨的侵袭信号。</li>
	<li>达到目标时间点后，将装置从多功能细胞分析仪上取下，并置于组织培养操作台中。</li>
	<li>准备适量的 1.5 mL 微量离心管，用于收集目标孔中的细胞。</li>
	<li>将装置放入一个 10 cm 培养皿中，以防止小室脱开时液体洒出。</li>
	<li>向内按压中间小室长边两侧的弹性卡扣，直至听到“咔哒”声。</li>
	<li>拆卸上层小室，并将其倒置放入一个新的 10 cm 培养皿中。</li>
	<li>使用带有 13 mm 刀片的细胞刮刀，收集所有承载相同实验条件（即细胞类型、药物处理等）的孔中的细胞。 
	注意：实验设计时应确保每种实验条件至少设置两个重复孔，以实现相对于阴性对照具有统计学意义的变化。</li>
	<li>将刀片用 1× 磷酸盐缓冲液冲洗或蘸洗，以将收集的细胞转移至 1.5 mL 微量离心管中。</li>
	<li>在 500 × g 条件下离心 5 分钟，沉淀细胞。</li>
	<li>继续培养所收集的细胞（见第 8 节），或进行终点分析，例如单细胞 RNA 测序。 
	&#8203;注意：对于批量 RNA 测序，应使用适用于低细胞数的 RNA 提取试剂盒。</li>
</ol>
8. 三维细胞扩增与回收
注意：由于收集的细胞数量较少，建议使用细胞外基质（ECM）以三维形式接种细胞，以提高细胞存活率。不过，此时也可选择二维培养，特别是当所用细胞来自已建立的细胞系时。
<ol>
	<li>在4 °C条件下过夜解冻一份基底膜基质。使用前将基底膜基质置于冰上保存。</li>
	<li>向收集的活细胞沉淀中加入25 μL&#160;冷的基底膜基质，轻轻吹打混匀。避免产生气泡。</li>
	<li>将细胞与基底膜基质的混合物加入小尺寸组织培养孔底部（例如96孔板），形成圆顶状。尽量不要接触孔壁。在37 °C孵育20分钟后，轻轻逐滴加入100 μL&#160;培养基。</li>
	<li>回收细胞时，吸除培养基，并向每孔加入100 μL&#160;分散酶（dispase）。</li>
	<li>在室温下孵育10分钟，期间偶尔吹打混匀。</li>
	<li>将细胞及溶解的基底膜基质转移至1.5 mL微量离心管中，加入1 mL 1× PBS，以300 × g离心5分钟，弃去上清液。重复洗涤一次。</li>
	<li>吸除上清液。对沉淀中的细胞进行传代或进行终点分析。</li>
</ol>

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</ol>

乔治城大学已就本论文所述的某些方法申请了专利。G.M.S、A.W、L.D 和 M.P 被列为该专利申请的发明人，并声明此项可能的利益冲突。

我们改进了双室微阵列的设计，增加了一个第三室，用于在存在基质细胞的情况下实时监测细胞侵袭。我们观察到共培养的成纤维细胞对侵袭性和非侵袭性癌细胞产生不同的影响，表明该微阵列可用于区分对共培养基质细胞所分泌因子响应不同的癌细胞亚群。该阵列还被用于监测内皮细胞向基质组织中的侵袭，这是在具有不同侵袭潜能的癌细胞存在下，血管朝向促血管生成刺激物出芽过程中的关键步骤。这些实验表明，该微阵列在癌细胞或其他细胞的分离方面具有广泛的用途。
建议优化每个小室中接种的细胞数量。根据我们的经验以及制造商的建议，每个小室接种30,000至50,000个细胞为最佳。由于该阵列可同时共培养两种细胞类型，其中一种可能是基质细胞的原代培养物，因此建议监测不同培养基对细胞活力维持的影响。我们发现，在监测前对细胞进行饥饿处理可减少重复样本之间的变异。如果无血清培养条件对细胞有害，可采用低血清浓度和较短的饥饿时间。在下层小室中加入少量血清（1%–2%）可能对基质细胞（原代细胞）的存活至关重要，但务必设置适当对照条件以利于数据分析（例如，含或不含基质细胞的2%血清条件）。如果侵袭率较低，可增加每种实验条件下使用的孔数，以提...

细胞侵袭是一个重要过程，可使细胞在间质细胞提供的环境信号刺激下穿越基底膜屏障。该过程在免疫反应、伤口愈合、组织修复以及恶性肿瘤的发展多个阶段中至关重要，后者可从局部病灶进展为侵袭性及转移性癌症1。早期开发的用于测量细胞群体侵袭潜能的检测方法通常只能提供单一终点测量值，或需要预先标记侵袭性细胞2。目前，微电子与微流控技术的结合已被用于检测细胞生物学的多个方面，例如通过活细胞在微电极上的电学阻抗来评估其活性、运动性和贴附性3,4。阻抗测量可实现无标记、非侵入性且定量的细胞状态评估3。本文描述了一种基于Abassi等人开发的实时细胞分析（RTCA）系统设计的三室阵列5。该三室阵列可用于共培养条件下细胞侵袭行为的评估，并可回收侵袭后的细胞以进行进一步分析或扩增。
在细胞分析系统中，细胞穿过涂覆于多孔膜上的细胞外基质，侵袭至屏障另一侧的叉指电极阵列。随着侵袭性细胞随时间持续贴附并占据该电极阵列，电学阻抗随之发生平行变化。当前系统包括一个16孔的细胞侵袭与迁移（CIM）板，该板具有两个腔室。RTCA-DP（双功能）仪器（以下简称双功能细胞分析仪）包含用于阻抗测量的传感器，以及用于分析和处理阻抗数据的集成软件。基线阻抗值取决于孔中培养基的离子强度，并随细胞贴附至电极而发生变化。阻抗的变化取决于细胞数量、细胞形态以及细胞与电极贴附的程度。在加入细胞前对仅含培养基的孔进行的测量被视为背景信号。当细胞贴附并铺展于电极上达到平衡后，从后续阻抗测量值中减去该背景值。电极上细胞状态的一个无量纲参数称为细胞指数（Cell Index, CI），其计算方式如下：CI =（平衡后阻抗值 - 无细胞时阻抗值）/ 标称阻抗值6。在比较不同细胞系的迁移速率时，可使用Delta CI来比较细胞状态，从而消除因初始几次测量中贴附程度差异所带来的影响。
新设计的三室阵列在现有设计基础上改进而成，采用双功能细胞分析系统中带有电极的上室。经过改良的中室和下室经过适配，可将整个装置装入双功能细胞分析仪中，利用集成软件进行阻抗测量与分析。与现有的双室CIM板（以下简称细胞分析板）相比，新设计的两大主要改进在于：i）能够回收并分析存在于异质细胞混合物中的侵袭性细胞亚群；ii）可评估共培养的基质细胞或免疫细胞所分泌因子对细胞侵袭的影响（图1）。
该技术可用于研究具有不同侵袭能力的细胞亚群，包括：(a) 侵袭性癌细胞，其可侵入周围组织或血管、淋巴管，或在远端器官的转移定植部位发生外渗；(b) 免疫系统细胞，其可侵入组织以清除病原体或病变细胞；(c) 内皮细胞，其在组织重塑或伤口愈合过程中侵入组织以形成新的血管；以及 (d) 肿瘤微环境中的间质细胞，其可支持癌细胞并与其共同侵袭。该方法能够包含可调节细胞运动性和侵袭性的间质相互作用。本文展示的可行性研究以该改良阵列为基础，以癌细胞侵袭及其与间质的相互作用为模型系统，包括内皮细胞对癌细胞差异信号的响应性侵袭。该方法可进一步推广，用于分离癌细胞及其他细胞类型，例如免疫细胞亚群、成纤维细胞或内皮细胞。我们以已建立的侵袭性与非侵袭性乳腺癌细胞系作为概念验证模型进行了测试。此外，我们还利用患者来源的异种移植瘤（PDX）细胞，研究其在人骨髓来源免疫细胞作用下的侵袭行为，以验证该方法未来在临床诊断环境中的应用可行性。PDX 是指将患者肿瘤组织植入免疫缺陷或人源化小鼠模型中，以研究原始患者肿瘤的生长、进展及治疗方案7,8。

<table><tbody><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Thermofisher</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>粘合剂</td><td>Norland Optical Adhesive</td><td>NOA63</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td></td></tr><tr><td>霍乱毒素（来自霍乱弧菌）</td><td>Thermofisher</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>CIM-板</td><td>Agilent</td><td>5665817001</td><td>细胞分析板</td></tr><tr><td>胶原酶（来自产气荚膜梭菌）</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>中性蛋白酶（Dispase）</td><td>StemCell</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Thermofisher</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），热灭活</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermofisher</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>马血清（HS）</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>人表皮生长因子（EGF）</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>人脐静脉内皮细胞（HUVEC）</td><td>LONZA (RRID:CVCL_2959)</td><td>C-2517A</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC 培养基</td><td>LONZA</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITSX）（100倍浓缩液）</td><td>Thermofisher</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>人重组胰岛素锌溶液</td><td>Sigma</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>J2 成纤维细胞</td><td>Stemcell (RRID:CVCL_W667)</td><td>100-0353</td><td></td></tr><tr><td>LymphoPrep</td><td>Stemcell</td><td>7851</td><td>用于单个核细胞分离的密度梯度介质</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>基底膜基质</td></tr><tr><td>MCFDCIS.com 细胞（DCIS）</td><td>RRID:CVCL_5552</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 细胞</td><td>RRID:CVCL_0062</td><td></td><td></td></tr><tr><td>铣床</td><td></td><td></td><td>Bridgeport Series 1 Vertical</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（1×）</td><td>Thermofisher</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>聚醚砜（PES）膜</td><td>Sterlitech</td><td>PCTF029030</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解液</td><td>Stemcell</td><td>7800</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 微量试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>RTCA DP 分析仪</td><td>Agilent</td><td>3X16</td><td>双用途细胞分析仪</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr></tbody></table>

共培养物中侵袭性细胞亚群的实时检测与捕获

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

癌细胞的侵袭和转移扩散是癌症致死的主要原因。早期开发的用于测量癌细胞群体侵袭潜能的检测方法通常仅提供单一的终点测量值，无法区分具有不同侵袭能力的癌细胞亚群。此外，肿瘤微环境包含多种固有的间质细胞和免疫细胞，这些细胞会改变并参与癌细胞的侵袭行为。在组织中发生侵袭的过程同样存在于免疫细胞亚群中，例如在组织重塑和血管生成过程中，免疫细胞亚群通过侵袭来抵御微生物或清除实质组织和内皮细胞中的病变细胞。利用阻抗生物传感器实时监测细胞侵袭的实时细胞分析技术（Real-Time Cellular Analysis, RTCA）相比传统的终点检测方法是一大进步：该技术可实现对侵袭过程的连续动态监测，从而揭示在终点检测中被忽略的侵袭速率差异。基于现有的RTCA技术，我们通过增加一个额外的腔室对双室阵列进行了扩展，该腔室可容纳间质细胞和/或免疫细胞，从而能够长期监测共培养的间质或免疫细胞所分泌因子影响下的侵袭速率。除此之外，该独特设计还允许在任意时间点拆卸腔室，进而分离出最具侵袭性的癌细胞或其他存在于异质性肿瘤分离物中的细胞亚群。这些最具侵袭性的癌细胞及其他细胞亚群是恶性肿瘤进展为转移性疾病的关键驱动因素，其分子特征对于深入的机制研究、开发用于检测这些细胞的诊断探针以及评估其潜在弱点至关重要。因此，可在实验中引入小分子或大分子药物，用于评估靶向癌细胞和/或间质细胞亚群的治疗策略，以期抑制（如癌细胞）或增强（如免疫细胞）其侵袭行为。

使用新设计的三室装置，在存在或不存在成纤维细胞等基质细胞的情况下检测了细胞的侵袭能力。当在底部腔室中接种经照射的瑞士3T3成纤维细胞（J2品系）时，MDA-MB-231细胞的侵袭能力增强，这允许两种细胞系之间交换可溶性因子。有趣的是，当3T3-J2细胞的数量增加一倍时，MDA-MB-231细胞的侵袭进一步增加图3A）。另一方面，MCFDCIS 细胞的一种侵袭性克隆（DCIS-Δ4）的侵袭率9 似乎受到与3T3-J2细胞交叉对话的抑制（图3B该数据表明，三室阵列可用于测量基质（本例中为成纤维细胞）对细胞侵袭的不同影响，具有实用价值。
接下来，为了监测内皮细胞在侵袭性（MDA-MB-231）10,11 或非侵袭性（DCIS）12 癌细胞信号刺激下运动性和侵袭...

我们介绍一种实时检测和捕获侵袭性细胞亚群的方法。该实验设计通过监测细胞电阻抗的变化，采用实时细胞分析技术。可在复杂组织中捕获侵袭性癌细胞、免疫细胞、内皮细胞或间质细胞，并评估共培养的影响。

癌细胞的侵袭和转移扩散是导致癌症患者死亡的主要原因。早期开发的用于测量癌细胞侵袭潜能的实验方法……

该技术能够鉴定在共培养的基质细胞分泌因子影响下具有不同侵袭能力的细胞。该技术可评估共培养的基质细胞或免疫细胞所分泌因子对细胞侵袭的影响，同时允许回收并分析存在于异质细胞混合物中的侵袭性细胞亚群。该技术可确定哪些肿瘤含有导致转移的侵袭性细胞亚群。捕获并分析侵袭性癌细胞可能为治疗决策提供依据。开始细胞培养时，用1×磷酸盐缓冲液洗涤汇合度约为70%的贴壁细胞培养物。然后加入0.05%胰蛋白酶和EDTA溶液以消化细胞。使用含有血清的细胞培养基中和胰蛋白酶溶液，并取部分细胞悬液进行细胞计数。将三个无菌培养 chamber 置于组织培养超净台中。找到下室短边上的旋钮，并将下室调整至旋钮朝向实验操作者的方向。从下室每孔加入90微升培养基中含30,000至50,000个细胞，加样时避免产生气泡。在两个下室中使用添加5%胎牛血清的培养基作为细胞迁移的阳性对照，使用不含血清的培养基作为阴性对照。在生物安全柜中静置10至15分钟后，将下层腔室旋转90度。然后将中间腔室置于其上方，使下层腔室的凸钮滑入中间腔室的凹槽中。垂直向下按压腔室，直至装置的每一侧长边均发出咔嗒声。向中间层的所有孔中加入 160 微升无血清培养基。加样后应可见弯月面呈圆顶状，然后将上层腔室电极朝下放置于中间层上，使中间层与上层腔室上的蓝色圆点对齐。垂直向下按压腔室，直至组装体的每一侧长边均发出咔嗒声。向顶室中加入 20 至 50 微升无血清培养基。将组件安装在组织培养孵育箱中的多功能细胞分析仪上，等待 30 分钟后测量背景值。打开细胞分析仪软件，选择要使用的支架，然后点击消息选项卡，确保显示“Connections okay”，以确认芯片已正确放置于支架中，且电极与传感器对齐良好。单击实验记录选项卡，并填写有关实验的所有可能信息。然后单击布局选项卡，填写阵列布局的描述。接着单击时间表选项卡，从步骤菜单中添加两个步骤：一个包含一次扫描的背景步骤，以及一个包含100次扫描的测试步骤。将阵列放入多功能细胞分析仪的培养箱中孵育30分钟后，点击播放按钮开始背景测量。背景测量完成后，将阵列从支架中取出，并放回细胞培养超净台中。然后在顶部小室的每个孔中加入100微升无血清培养基，其中含有30,000至50,000个细胞。这些是电极在细胞成功迁移通过膜后将检测到的细胞。组装完成后，在通风橱中静置30分钟，然后将其安装到多功能细胞分析仪上进行阻抗测量。将阵列重新放回多功能细胞分析仪中，并查看消息标签页是否显示“连接正常”的提示信息。单击播放按钮开始阻抗测量，然后单击绘图标签以监测信号进展。如果在25小时之前达到终点，请从执行下拉菜单中单击中止步骤。要导出数据，可右键单击图表，从列表中选择复制，然后将数据粘贴到电子表格中。在多功能细胞分析仪上实时监测细胞迁移速率，以确定感兴趣的终止时间点。达到目标后，将装置从多功能细胞分析仪上取下，并置于组织培养操作台中。准备适量的1.5毫升微量离心管，用于收集目标孔中的细胞。将组装好的装置放入一个10厘米的培养皿中，以防止腔室分离时液体溢出。向内按压中间腔室长边两侧的柔性卡扣，直至听到咔哒声，然后拆下上层腔室并将其倒置放入一个新的10厘米培养皿中。使用带有13毫米刀头的细胞刮板，从所有承载相同实验条件的孔中收集细胞。用1×磷酸盐缓冲液冲洗或浸蘸刀片，以收集细胞至1.5毫升微量离心管中。随后在500 × g离心5分钟，沉淀细胞，然后扩增所收集的细胞或进行终点分析，例如单细胞RNA测序。在有或无基质细胞存在条件下对细胞侵袭能力的评估显示，当在下室中接种经照射的Swiss-3T3成纤维细胞J2株以促进两种细胞系之间因子交换时，MDA-MB-231细胞的侵袭能力增强。有趣的是，当3T3 J2细胞数量增加一倍时，MDA-MB-231细胞的侵袭能力增强。另一方面，MCFDCIS细胞的一个侵袭性克隆DCIS-Delta Four的侵袭速率似乎受到与3T3 J2细胞相互作用的抑制，这表明三室阵列在测量间质不同效应方面具有重要应用价值。本案例中，成纤维细胞对细胞侵袭的影响。人脐静脉内皮细胞在响应 MDA-MB-231 细胞分泌的因子时表现出更强的侵袭性，而导管原位癌（DCIS）细胞分泌的因子则无此作用，这与侵袭性肿瘤能够招募内皮细胞以促进血管形成并进一步扩散至循环系统的能力一致。在与人骨髓免疫细胞共培养时，来自患者来源的异种移植瘤细胞从上室的侵袭能力增强。有趣的是，在下室中加入 2% 血清并与人骨髓免疫细胞共同存在，对患者来源的异种移植瘤细胞的侵袭至关重要。可通过在孔板中包被细胞外基质来模拟基底膜屏障。可在孔板培养基中加入治疗剂，以监测其对侵袭的影响。

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体外共培养系统重现癌症-免疫循环

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共培养物中侵袭性细胞亚群的实时检测与捕获

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