共培养物中侵袭性细胞亚群的实时检测与捕获

该技术能够鉴定在共培养的基质细胞分泌因子影响下具有不同侵袭能力的细胞。该技术可评估共培养的基质细胞或免疫细胞所分泌因子对细胞侵袭的影响，同时允许回收并分析存在于异质细胞混合物中的侵袭性细胞亚群。

该技术可确定哪些肿瘤含有导致转移的侵袭性细胞亚群。捕获并分析侵袭性癌细胞可能为治疗决策提供依据。开始细胞培养时，用1×磷酸盐缓冲液洗涤汇合度约为70%的贴壁细胞培养物。

然后加入0.05%胰蛋白酶和EDTA溶液以消化细胞。使用含有血清的细胞培养基中和胰蛋白酶溶液，并取部分细胞悬液进行细胞计数。将三个无菌培养 chamber 置于组织培养超净台中。

找到下室短边上的旋钮，并将下室调整至旋钮朝向实验操作者的方向。从下室每孔加入90微升培养基中含30,000至50,000个细胞，加样时避免产生气泡。在两个下室中使用添加5%胎牛血清的培养基作为细胞迁移的阳性对照，使用不含血清的培养基作为阴性对照。

在生物安全柜中静置10至15分钟后，将下层腔室旋转90度。然后将中间腔室置于其上方，使下层腔室的凸钮滑入中间腔室的凹槽中。垂直向下按压腔室，直至装置的每一侧长边均发出咔嗒声。

向中间层的所有孔中加入 160 微升无血清培养基。加样后应可见弯月面呈圆顶状，然后将上层腔室电极朝下放置于中间层上，使中间层与上层腔室上的蓝色圆点对齐。垂直向下按压腔室，直至组装体的每一侧长边均发出咔嗒声。

向顶室中加入 20 至 50 微升无血清培养基。将组件安装在组织培养孵育箱中的多功能细胞分析仪上，等待 30 分钟后测量背景值。打开细胞分析仪软件，选择要使用的支架，然后点击消息选项卡，确保显示“Connections okay”，以确认芯片已正确放置于支架中，且电极与传感器对齐良好。

单击实验记录选项卡，并填写有关实验的所有可能信息。然后单击布局选项卡，填写阵列布局的描述。接着单击时间表选项卡，从步骤菜单中添加两个步骤：一个包含一次扫描的背景步骤，以及一个包含100次扫描的测试步骤。

将阵列放入多功能细胞分析仪的培养箱中孵育30分钟后，点击播放按钮开始背景测量。背景测量完成后，将阵列从支架中取出，并放回细胞培养超净台中。然后在顶部小室的每个孔中加入100微升无血清培养基，其中含有30,000至50,000个细胞。

这些是电极在细胞成功迁移通过膜后将检测到的细胞。组装完成后，在通风橱中静置30分钟，然后将其安装到多功能细胞分析仪上进行阻抗测量。将阵列重新放回多功能细胞分析仪中，并查看消息标签页是否显示“连接正常”的提示信息。

单击播放按钮开始阻抗测量，然后单击绘图标签以监测信号进展。如果在25小时之前达到终点，请从执行下拉菜单中单击中止步骤。要导出数据，可右键单击图表，从列表中选择复制，然后将数据粘贴到电子表格中。

在多功能细胞分析仪上实时监测细胞迁移速率，以确定感兴趣的终止时间点。达到目标后，将装置从多功能细胞分析仪上取下，并置于组织培养操作台中。准备适量的1.5毫升微量离心管，用于收集目标孔中的细胞。

将组装好的装置放入一个10厘米的培养皿中，以防止腔室分离时液体溢出。向内按压中间腔室长边两侧的柔性卡扣，直至听到咔哒声，然后拆下上层腔室并将其倒置放入一个新的10厘米培养皿中。使用带有13毫米刀头的细胞刮板，从所有承载相同实验条件的孔中收集细胞。

用1×磷酸盐缓冲液冲洗或浸蘸刀片，以收集细胞至1.5毫升微量离心管中。随后在500 × g离心5分钟，沉淀细胞，然后扩增所收集的细胞或进行终点分析，例如单细胞RNA测序。在有或无基质细胞存在条件下对细胞侵袭能力的评估显示，当在下室中接种经照射的Swiss-3T3成纤维细胞J2株以促进两种细胞系之间因子交换时，MDA-MB-231细胞的侵袭能力增强。

有趣的是，当3T3 J2细胞数量增加一倍时，MDA-MB-231细胞的侵袭能力增强。另一方面，MCFDCIS细胞的一个侵袭性克隆DCIS-Delta Four的侵袭速率似乎受到与3T3 J2细胞相互作用的抑制，这表明三室阵列在测量间质不同效应方面具有重要应用价值。本案例中，成纤维细胞对细胞侵袭的影响。

人脐静脉内皮细胞在响应 MDA-MB-231 细胞分泌的因子时表现出更强的侵袭性，而导管原位癌（DCIS）细胞分泌的因子则无此作用，这与侵袭性肿瘤能够招募内皮细胞以促进血管形成并进一步扩散至循环系统的能力一致。在与人骨髓免疫细胞共培养时，来自患者来源的异种移植瘤细胞从上室的侵袭能力增强。有趣的是，在下室中加入 2% 血清并与人骨髓免疫细胞共同存在，对患者来源的异种移植瘤细胞的侵袭至关重要。

可通过在孔板中包被细胞外基质来模拟基底膜屏障。可在孔板培养基中加入治疗剂，以监测其对侵袭的影响。