使用200 KV透射电子显微镜常规收集高分辨率冷冻电镜数据集
2022年3月16日
大分子的高分辨率冷冻电镜图谱也可以通过使用200 kV透射显微镜来实现。该协议显示了设置精确光学对准、数据采集方案和成像区域选择的最佳实践，这些对于使用200 kV TEM成功收集高分辨率数据集至关重要。
冷冻电镜已成为蛋白质及其复合物结构测定的标准技术。该协议描述了如何从中档200 kV透射电显微镜获得高分辨率Cryo-EM数据集的最佳实践。冷冻电镜可以同时确定溶液中接近天然条件下的多种构象状态和功能状态的蛋白质结构，这对于其他结构技术来说是难以捉摸的。
获得的结构信息可用于阐明蛋白质功能的分子机制，以及基于结构的药物设计。例如，最近在淀粉样纤维结构方面的出版物揭示了重要配体的多个结合位点。然而，在该协议中，我们使用阿普铁蛋白和蛋白酶体的标准样品来证明获得高分辨率Cryo-EM数据的关键步骤。
在过去几年中，冷冻透射电镜的操作变得更加容易，特别是由于引入了先进的自动化功能。但是，对于第一次会议，我们建议您与更有经验的用户一起接受培训。从那里开始，技术的进步相对较快。
演示该程序的将是Adrian Koh，他是Thermo Fisher Scientific的高级应用科学家。在液氮条件下将自动格栅插入自动装载机盒中。将带有自动网格的盒插入液氮冷却的转移胶囊中。
进一步将胶囊插入显微镜，然后单击显微镜UI中的Dock按钮，将胶囊中的盒式磁带加载到显微镜的自动加载器中。单击"库存"按钮以检查已加载的盒中是否存在自动网格。然后单击"加载"和"卸载"按钮，将自动网格插入到列中以进行TEM成像。
选择 Atlas 选项卡，然后单击新建会话按钮以打开新会话。填写会话名称和数据存储位置等详细信息，然后单击"应用"按钮。通过选中相应网格编号旁边的复选框来选择感兴趣的网格。
单击"开始"按钮以启动所有选定网格的完全自动化的地图集集合。集合完成后，单击网格标签以查看获取的地图集。选择 EPU 选项卡，然后转到"新建会话"以在左侧面板中创建新会话。
选择"新建会话"选项以使用当前设置的光学预设。填写会话名称。选择会话的手动类型，以控制稍后在协议中为数据收集选择的各个孔和网格方块的选择。
选择更快的采集模式，使用无像差图像偏移进行数据采集。然后输入保存元数据的位置。单击"应用"按钮以创建新会话。
在左侧面板中选择方形选择任务以显示收集的网格图集。识别网格正方形，具有完整的支撑箔而不会损坏，薄玻璃体冰和箔孔，网格正方形中可忽略不计的结晶冰污染以及网格正方形和单个箔孔内的最小亮度梯度。选择用于数据收集的网格方块，无论是在完整的图集还是高质量的切片图像中。
右键单击感兴趣的网格方块，然后选择整个选择任务。单击"自动优心"按钮可自动移动到第一个选定的网格正方形。调整共心高度并获取网格正方形图像以查找箔孔。
单击"查找孔"按钮以查找图像中的箔孔。单击"移除孔"按钮以关闭网格条按钮以取消选择网格条附近的孔。调整冰过滤器亮度直方图中的限制，以清除所有冰太厚的孔和所有空孔。
右键单击网格正方形图像中的孔，然后选择"移动舞台到此处的位置"移动舞台。在左侧面板中选择模板定义任务。单击"采集"按钮获取整个图像。
将图像偏移后的延迟值设置为 0.5 秒，将分级后的延迟值设置为 5 秒。单击"查找并居中孔"按钮，将图像中的孔居中。选择"添加采集区域"按钮，然后单击图像以选择在中心孔中进行高放大倍率图像采集的位置。
选择"添加自动对焦区域"按钮，然后单击图像以选择支撑箔上的位置，该位置位于将执行图像自动对焦的中心孔旁边。单击绿色的"采集区域"，在软件窗口顶部的散焦列表中设置一系列散焦值。设置自动对焦特定设置后，选择选项"居中后"以在每个 AFIS 群集开始时自动对焦。
选择物镜选项，实现更快的自动对焦和更低的载物台漂移。单击孔选择任务中的"准备所有方块"按钮，可根据第一个格网方块中使用的设置自动设置数据收集和所有其他选定的格网方块。选择模板定义任务，获取新图像，通过右键单击将舞台移动到碳箔上的干净区域，然后选择菜单选项将舞台移动到此处。
选择"自动功能"选项卡。设置所需的散焦和迭代后，切换到自动对焦预设，然后单击开始按钮以运行自动对焦功能。选择"自动恢复"任务，切换到"传递环"预设，然后按"开始"按钮。
选择"自动昏迷"任务，然后按"开始"按钮 。将舞台移动到网格正方形断开的区域。通过拍摄单个自动对焦图像来确认区域的透明度。
打开夏尔巴 UI 并选择能量过滤器应用程序。单击"中心"按钮和"零损耗"选项，将零损耗能量滤波器狭缝居中。单击等色性选项中的"调谐"按钮。
单击几何和色度失真中的"调谐放大倍率和调谐失真"选项。转到 EPU 选项卡，选择"自动采集"任务，然后单击"开始运行"按钮以开始全自动数据收集。该图显示了Cryo-EM网格，该网格在网格表面上显示冰厚梯度。
从进一步调查中排除的网格是具有厚冰的坏网格和具有坏冰和污染的弯曲网格，而可接受的网格是具有良好冰梯度和具有良好薄冰和小冰梯度的典型网格。该图显示了重建的阿泊铁蛋白冷冻电镜图的最终3D渲染。高稳定性和对称性使其成为高分辨率冷冻电镜成像和图像处理的最佳基准样品。
贝叶斯抛光、CTF 细化和 Ewald 球体校正产生了 1.63 埃的分辨率图。该图显示了在单个氨基酸侧链水平上重建的阿扑铁蛋白Cryo-EM图谱的详细视图。氨基酸侧链的密度得到了很好的解决，原子模型可以在图谱中明确地构建。
这里的图像显示了从同一Cryo-EM网格收集的不同散焦值的两个不同的数据集，具有相似的网格正方形，其中狭缝完全打开，10电子伏特狭缝表明10电子伏特狭缝显着改善了图像对比度。该图显示了20S蛋白酶体Cryo-EM图谱的概述，其中分段的亚基用作标准Cryo-EM样品。其带有拟合原子模型的放大视图代表了具有D7对称性的蛋白酶体复合物的稳定催化核心。
该协议包含两个关键步骤。第一，寻找含有均匀颗粒的薄玻璃体冰的区域。第二，为数据采集设置并行照明。
通过蛋白质的高分辨率重建达到两到三埃的分辨率，您可以更好地了解疾病的分子机制并改善药物先导物。以前，如果你想研究生物现象的结构基础，结晶是必要的。今天有了冷冻电镜，这不再是必需的。
因此，通过冷冻电镜，我们使科学家能够在结构水平上研究更广泛的生物现象。
概述
本方案概述了使用200 kV透射电子显微镜获取高分辨率冷冻电镜数据集的最佳实践。重点包括精确的光学系统校准、数据采集策略以及成像区域的选择。
关键研究组成部分
科学领域
- 冷冻电子显微镜
- 结构生物学
背景
- 冷冻电镜（Cryo-EM）是测定蛋白质结构的常规技术。
- 该技术可实现对蛋白质在接近天然状态下的研究。
- 此方法能够同时捕获多种构象状态和功能状态。
- 近年来的技术进步使得冷冻透射电镜（Cryo-TEM）的操作更加简便。
研究目的
- 展示获取高分辨率冷冻电镜数据的关键步骤。
- 提供使用脱铁铁蛋白和蛋白酶体等标准样品的实验方案。
- 通过详细的结构信息促进基于结构的药物设计。
使用的方法
- 使用自动网格和液氮条件进行样品制备。
- 从选定的网格自动采集图谱。
- 手动选择网格方格以进行数据采集。
- 利用先进的自动化功能实现高效数据采集。
主要结果
- 成功从 200 kV 透射电子显微镜获取高分辨率数据集。
- 确定用于成像的最佳载网方格。
- 展示自动化与手动数据采集技术的操作方法。
- 建立适用于未来研究的可靠实验方案。
结论
- 该方案为获取高分辨率冷冻电镜（Cryo-EM）数据提供了全面的指导。
- 建议初学者在有经验的用户指导下进行培训。
- 自动化技术的进步提高了冷冻电镜操作的效率。
常见问题
行业重要性概述
采用200 kV透射电子显微镜（TEM）系统的高分辨率冷冻电镜技术，能够常规性地解析蛋白质的原子级结构，使该技术的应用不再局限于专用的300 kV平台。自动化操作与实时质量评估简化了数据采集流程，有助于在药物发现早期快速、可重复地获得结构信息。该能力显著增强了生物制药研发管线中靶点验证与先导化合物识别关键节点的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 有助于阐明蛋白质功能及疾病相关性的分子机制。
- 通过提供原子分辨率的靶标结构图谱，支持基于结构的药物设计。
- 通过直接可视化构象状态和结合状态，促进功能靶标的验证。
- 减少对结晶的依赖，拓展可研究靶标的范围。
筛选与检测方法开发
- 为下游筛选和检测开发工作流程提供经过验证的结构模板。
- 标准化成像参数和数据质量，确保实验间具有可重复性。
- 实现对配体结合和构象变化的定量评估。
- 支持可扩展、自动化的数据采集，用于高通量结构筛选。
转化与临床前研究
- 将结构输出与疾病相关模型对齐，以推动转化生物标志物的开发。
- 通过实现机制性风险降低，提供从发现到临床前验证的连续性。
- 通过明确结构-功能关系，优化经风险调整的推进决策。
流程与工作流整合
该方案将200 kV冷冻电镜技术确立为从早期发现到临床前研究的核心能力，贯穿靶点验证、先导物识别及作用机制去风险化等环节。
- 发现生物学：通过解析接近天然状态的蛋白质结构，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可重复、定量的结构数据，用于化合物评估和检测准备。
- 分析：实现对结构状态和配体相互作用的高分辨率测量及统计学比较。
- 转化研究：将原子水平的洞察与疾病模型及生物标志物策略相连接。
- 企业级复用：建立标准化、自动化的实验流程，可适用于多种蛋白质靶标和研究项目。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：通过自动化和实时质量控制，增强标准化、可重复性和通量。
- 战略价值：支持更明智的立项/终止决策，实现资本高效的项目组合管理。
- 项目组合影响：支持对结构验证靶点进行风险调整后的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备冷冻电镜操作和数据分析的专业知识，建议接受初步培训。
- 需要使用配备能量过滤器和直接电子探测器的200 kV透射电子显微镜系统。
- 高通量工作流程需要强大的数据管理和质量评估基础设施。
- 成像参数和自动化流程的标准化对于跨团队可重复性至关重要。
- 针对特定蛋白质靶标的适应可能需要优化样品制备和成像条件。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:27
Grid Loading, Mapping, and Selection of Best Cryo-EM Grids for Data Collection
2:36
Setting up a Data Collection Session in the Single Particle Analysis Software
5:44
Final Microscope Alignments Before Starting Data Collection
7:15
Results: Gallery of Grids, Cryo-EM Reconstruction of Apo-Ferritin, and Effect of Energy Filtering on Cryo-EM Images
8:56
Conclusion
