Name: 使用200 KV透射电子显微镜常规收集高分辨率冷冻电镜数据集 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学习使用200 kV透射电子显微镜获取高分辨率冷冻电镜数据集的标准操作流程，涵盖样品制备、光路对准、自动化数据采集及成像区域选择等关键步骤，适用于apoferritin和proteasome等标准样品。

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<ol><li>Wang, J., Hua, T., Liu, Z. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+features+of+activated+GPCR+signaling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural features of activated GPCR signaling complexes.</a> Current Opinions in Structural Biology. 63, 82-89 (2020).</li>
<li>Chen, S., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+AMPA+receptor+-+auxiliary+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of AMPA receptor - auxiliary protein complexes.</a> Current Opinions in Structural Biology. 54, 104-111 (2019).</li>
<li>Kühlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanisms+of+F-Type+ATP+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanisms of F-Type ATP synthases.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 515-549 (2019).</li>
<li>Laverty, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+human+%CE%B11%CE%B23%CE%B32+GABA+A+receptor+in+a+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the human α1β3γ2 GABA A receptor in a lipid bilayer.</a> Nature. 565 (7740), 516-520 (2019).</li>
<li>Liu, F., Zhang, Z., Csanády, L., Gadsby, D. C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+the+Human+CFTR+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of the Human CFTR ion channel.</a> Cell. 169 (1), 85-95 (2017).</li>
<li>Wrapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+2019-nCoV+spike+in+the+prefusion+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.</a> Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).</li>
<li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+distributions+of+SARS-CoV-2+spike+proteins+on+intact+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions.</a> Nature. 588, 498-502 (2020).</li>
<li>Yan, R., Zhang, Y., Li, Y., Xia, L., Guo, Y., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+recognition+of+SARS-CoV-2+by+full-length+human+ACE2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the recognition of SARS-CoV-2 by full-length human ACE2.</a> Science. 367 (6485), 1444-1448 (2020).</li>
<li>Walls, A. C., Park, Y. -J., Tortorici, M. A., Wall, A., McGuire, A. T., Veesler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function%2C+and+antigenicity+of+the+SARS-CoV-2+spike+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein.</a> Cell. 180, 281-292 (2020).</li>
<li>Chiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+nanoparticle-based+vaccines+protect+hamsters+against+SARS-CoV-2+after+a+single+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Multivalent nanoparticle-based vaccines protect hamsters against SARS-CoV-2 after a single immunization.</a> Communications Biology. 4 (1), 597(2021).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li>
<li>Bai, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+atoms+by+single-particle+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Seeing atoms by single-particle Cryo-EM.</a> Trends in Biochemical Sciences. 46 (4), 253-254 (2021).</li>
<li>Koh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+cryo-EM+at+200kV+enabled+by+Selectris-X+and+Falcon+4%5BTitle%5D)+AND+%22Microscience+Microscopy+Congress+2021%22%5BJournal%5D)">High-resolution cryo-EM at 200kV enabled by Selectris-X and Falcon 4.</a> Microscience Microscopy Congress 2021. , Abstract 212 (2021).</li>
<li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+better-than-3-%C3%85+resolution+by+single-particle+cryo-EM+at+200+keV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Achieving better-than-3-Å resolution by single-particle cryo-EM at 200 keV.</a> Nature Methods. 14 (11), 1075-1078 (2017).</li>
<li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+structure+determination+of+sub-100+kDa+complexes+using+conventional+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM.</a> Nature Communications. 10 (1), 1032(2019).</li>
<li>Wu, M., Lander, G. C., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-2+Angstrom+resolution+structure+determination+using+single-particle+cryo-EM+at+200+keV%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology+X%22%5BJournal%5D)">Sub-2 Angstrom resolution structure determination using single-particle cryo-EM at 200 keV.</a> Journal of Structural Biology X. 4, 100020-100029 (2020).</li>
<li>Mori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-Glycoside+metabolism+in+the+gut+and+in+nature%3A+Identification%2C+characterization%2C+structural+analyses+and+distribution+of+C-C+bond-cleaving+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">C-Glycoside metabolism in the gut and in nature: Identification, characterization, structural analyses and distribution of C-C bond-cleaving enzymes.</a> Nature Communications. 12 (1), 6294(2021).</li>
<li>Hamdi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2.7+%C3%85+cryo-EM+structure+of+vitrified+M.+musculus+H-chain+apoferritin+from+a+compact+200+keV+cryo-microscope%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">2.7 Å cryo-EM structure of vitrified M. musculus H-chain apoferritin from a compact 200 keV cryo-microscope.</a> PLoS One. 15 (5), 0232540(2020).</li>
<li>Abbott, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMDB+web+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">EMDB web resources.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 61 (1), 1-12 (2018).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSPARC%3A+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Gómez-Blanco, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Scipion+for+stream+image+processing+at+Cryo-EM+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Using Scipion for stream image processing at Cryo-EM facilities.</a> Journal of Structural Biology. 204 (3), 457-463 (2018).</li>
<li>Tegunov, D., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cryo-electron+microscopy+data+preprocessing+with+Warp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp.</a> Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).</li>
<li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appion%3A+an+integrated%2C+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li>
<li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+outcomes+when+optimizing+%27standard%27+sample+preparation+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM.</a> Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+D%2C+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).</li>
<li>Bloch, M., Santiveri, M., Taylor, N. M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+Cryo-EM%3A+Cryo-grid+optimization+and+data+collection+with+protein+in+detergent%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane protein Cryo-EM: Cryo-grid optimization and data collection with protein in detergent.</a> Methods in Molecular Biology. 2127, 227-244 (2020).</li>
<li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leginon%3A+New+features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Leginon: New features and applications.</a> Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).</li>
<li>Schorb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>Alewijnse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+managing+large+CryoEM+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Best practices for managing large CryoEM facilities.</a> Journal of Structural Biology. 199, 225-236 (2017).</li>
<li>Baldwin, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Big+data+in+cryoEM%3A+automated+collection%2C+processing+and+accessibility+of+EM+data%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Big data in cryoEM: automated collection, processing and accessibility of EM data.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 1-8 (2018).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron-event+representation+data+enable+efficient+cryoEM+file+storage+with+full+preservation+of+spatial+and+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22International+Union+of+Crystallography+Journal%22%5BJournal%5D)">Electron-event representation data enable efficient cryoEM file storage with full preservation of spatial and temporal resolution.</a> International Union of Crystallography Journal. 7, 860-869 (2020).</li>
<li>Weis, F., Hagen, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+high+throughput+and+high+quality+for+cryo-electron+microscopy+data+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+D%2C+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection.</a> Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 76 (8), 724-728 (2020).</li>
<li>Zhou, H., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+icosahedral+virus+structures+by+electron+cryomicroscopy+at+subnanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Protein+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of icosahedral virus structures by electron cryomicroscopy at subnanometer resolution.</a> Advances in Protein Chemistry. 64, 93-124 (2005).</li>
<li>DeRosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+high-resolution+data+for+curvature+of+the+Ewald+sphere%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Correction of high-resolution data for curvature of the Ewald sphere.</a> Ultramicroscopy. 81 (2), 83-98 (2000).</li>
<li>Wolf, M., DeRosier, D. J., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ewald+sphere+correction+for+single-particle+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Ewald sphere correction for single-particle electron microscopy.</a> Ultramicroscopy. 106 (4-5), 376-382 (2006).</li>
<li>Leong, P. A., Yu, X., Hong Zhou, Z., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+for+the+ewald+sphere+in+high-resolution+single-particle+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Correcting for the ewald sphere in high-resolution single-particle reconstructions.</a> Methods in Enzymology. 482, 369-380 (2010).</li>
<li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 42166(2018).</li>
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Sagar Khavnekar 报告无利益冲突。其他作者为赛默飞世尔科技公司 MSD-EM 部门的员工。

本方案假设所用透射电子显微镜（TEM）的光学系统处于良好对中状态。对于本方案中使用的200 kV TEM，此类镜筒对中工作由经验丰富的服务工程师在显微镜安装或重大维护操作后完成、验证并保存。这些对中设置可随时在显微镜用户界面（UI）中调用。用户可使用显微镜UI中的直接对中程序重新微调关键参数。某些对中参数（如电子枪倾斜和电子枪平移）较为稳定，无需用户每日调整。建议显微镜主管每半年检查并重新对中（如需要）电子枪倾斜与平移一次。另一方面，某些对中步骤至关重要，必须在每次数据采集前按照上述方案进行（例如物镜像散和无彗差对中）。如果分析软件中的自动无彗差（Autocoma）功能无法收敛，应验证并调整电子束倾斜枢轴点和/或旋转中心，并确认C2光阑的正确居中。随后应运行自动消像散（Autostigmate）功能，因为物镜消像散器也用于彗差校正。应反复执行这些对中步骤，直至自动消像散&#160;和自动无彗差功能在首次迭代时均能成功完成。如有必要，可选择另一区域（例如无冰的支撑碳膜），调整欠焦量，延长图像采集时间，以优化所获图像的信噪比，以及提高傅里叶变换图像中多个萨恩环的可见度。
现代冷冻电镜显微镜产生的数据量巨大，单个数据集通常超过1 TB，以实现高分辨率三维结构重建，特别是对于低对称性的蛋白质而言。在每个科研项目中，冷冻电镜的数据和结果通常还需结合正交方法获得的数据与结果，以全面理解结构与功能之间的关系。收集数据的组织、将其传输至图像处理流程，以及在合作者之间共享最终的冷冻电镜重建结果，这些都对新采用冷冻电镜技术的研究人员提出了额外要求，即必须建立本地IT基础设施。数据管理软件（如Athena）可实现由注册用户操作的任何连接仪器或软件所获取数据的集中存储。存储的数据及元数据可通过简单的网页浏览器界面供多位用户访问，用户在项目中可具有不同角色（如所有者、合作者或查看者），并根据其登录凭证及实验设置中的数据共享定义获得相应的访问权限。实验流程的数字化为合作者之间共享数据和元数据提供了便利，避免了不必要的重复，提高了工作流程的效率和可追溯性。数据管理软件中项目、实验和工作流程的通用且可定制的结构设计具有普适性，支持将采用互补方法的正交实验进行定制化整合，统一纳入单一项目数据库中。
在冷冻电镜载网上选择合适的数据采集区域，对于成功获取高分辨率数据集至关重要。使用传统冷冻制样设备（如Vitrobot，一种全自动玻璃化冷冻系统）制备的冷冻电镜载网，其表面通常会呈现出冰层厚度的梯度分布（图4）。这种梯度可能具有优势，因为载网上存在不同冰层厚度的区域；然而，仍需按照上述方案中所述方法，识别出适合数据采集的理想冰层厚度区域。理想的冷冻电镜载网应尽可能减少转移过程中引入的冰污染，并包含足够数量具有完整孔状支持膜的载网方格。不建议在存在裂纹或破损区域的载网方格上采集数据，因为这些区域在电子束照射下会产生显著更强的整体漂移，从而影响所采集图像的质量。过量的晶状冰可能堵塞大部分支持膜孔洞，和/或干扰自动对焦，此类载网方格也应避免使用。冰层较薄的载网方格通常在Atlas预设模式下成像时表现出较大的玻璃态冰区域以及许多明亮的孔洞。靠近载网条的区域出现较厚的冰层是正常现象，且无需担忧，因为在“孔洞选择”步骤中，这些区域的孔洞将被自动排除。单个载网方格中若存在多个空孔，可能表明周围孔洞中的玻璃态冰极薄，其中的颗粒可能已受损或完全缺失。通常情况下，建议在载网的不同区域选择具有多种冰层厚度的方格进行初步筛选和评估，以确定哪些区域具备最佳的高分辨率数据采集条件，并展现出理想的颗粒密度和取向分布。对于本研究中使用的apoF和20S蛋白酶体样品，可观察到冰层最薄的区域为这些样品进行高分辨率成像的最佳区域。
使用数据采集&#160;软件在所有选定的网格方格中自动选择孔位时，建议在每个网格方格中对一个代表性孔位执行模板运行任务，以检查并确保未选择过厚、过薄或意外非玻璃态的冰层区域用于数据采集。在数据采集过程中，可利用EQM监测所采集图像的关键质量指标，例如图像漂移和CTF拟合情况。随后可根据图像质量跳过质量较差的区域，从而优化数据采集。然而，即使CTF拟合达到高分辨率的图像，仍可能包含颗粒取向高度偏好，或因冰层过薄导致颗粒变性的图像。对采集的图像进行实时颗粒挑选和二维分类，可进一步提供有关成像颗粒结构数据质量的信息，揭示完整颗粒在冰层中的优势取向，或（部分）变性颗粒结构的不一致性。因此，计算类别平均图像有助于进一步优化合适的数据采集区域，该策略已在其他软件包中实现并得到验证23,28。
用于数据采集的成像参数设置（如放大倍数、电子剂量率和离焦范围）需根据多个标准进行选择，包括目标分辨率、蛋白质尺寸、样品浓度、期望的显微镜通量等。对于本实验中使用的直接电子探测器相机，电子剂量率选择在每像素每秒4-5个电子的范围内。-通过选择适当的光斑尺寸和强度来维持平行照明。如图所示 表1，可在“孔/等心高”预设中使用不同的SPOT尺寸，以确保在数据采集过程中，图像具有足够的信噪比用于孔的居中。放大倍数应选择为使像素尺寸至少比冷冻电镜三维重构的目标分辨率小2-3倍。然而，放大倍数越高（即像素尺寸越小），图像的视场越小，每幅图像中的颗粒数越少，最终导致需要更长的数据采集时间，以获得足够数量的颗粒用于高分辨率三维重构。对于apoF样品，我们采用0.43 Å的像素尺寸，因为样品浓度足够高，图像中颗粒密度较高，且目标为达到2 Å以下的重构分辨率。对于20S蛋白酶体样品，我们采用0.68 Å的像素尺寸，以在采集的图像中覆盖更大的视场。通常对于200 kV透射电子显微镜，冷冻电镜图像的欠焦范围为0.8至2.0 µm。然而，由于使用能量滤波器可提高图像对比度和信噪比，数据采集可更接近于焦点进行，从而因像差更小、CTF包络函数衰减更少，更好地保留图像中的高分辨率信息。我们也不使用物镜光阑，因为光阑可能引入额外的图像像差，而使用能量滤波器已能充分增强图像对比度。对于apoF和20S蛋白酶体样品，我们使用的欠焦值设置为0.5 µm、0.7 µm和0.9 µm。对于较小的蛋白质（&#60;200 kDa），我们采用了离焦量设置&#160;-0.5 µm、-0.7 µm 和 -0.9 µm&#160;以提高颗粒的对比度，便于在三维重构的3D refinement步骤中更易进行颗粒挑选和初始粗略对齐，从而获得约2.5 Å分辨率的三维图谱（未发表结果）。
我们此前已证实，在高端 300-kV 透射电子显微镜（TEM）上采集的冷冻电镜（cryo-EM）图像中，使用能量过滤器成像可提高信噪比（SNR）11。事实上，当电子穿过样品时，会发生两种主要类型的相互作用：i）弹性散射电子保持其能量，并通过相位衬度机制与未散射的入射电子束发生干涉，从而参与成像；ii）非弹性散射电子在样品中损失部分能量，主要对图像噪声产生贡献。因此，通过使用窄能量狭缝滤除能量低于入射电子束和弹性散射电子的非弹性散射电子，可显著提高信噪比（SNR）。然而，在高分辨率冷冻电镜数据集的长时间（12 小时以上）自动化数据采集过程中，必须使用足够稳定能量过滤器（例如 Selectris 或 Selectris-X），才能有效应用非常窄（10 eV 或更小）的能量狭缝。
在与300 kV透射电子显微镜（TEM）相同条件下，使用200 kV TEM显微镜获取的冷冻电镜（Cryo-EM）图像由于CTF包络函数衰减更快，其高分辨率下的信噪比（SNR）较低（特别是&#60;4 Å时）。因此，使用200 kV TEM时，需要更多的颗粒数量（从而需要采集更多的图像）才能达到特定分辨率。此外，在2–3 Å分辨率范围内，200 kV图像的景深（10–25 nm）也比300 kV图像约小20%35，这意味着在通常为20–50 nm厚的冰层中，较少的颗粒会完全处于焦点内，除非在三维重构后期对每个颗粒独立优化离焦值，否则这些颗粒无法对计算所得三维重构图中的所有高分辨率特征产生有效贡献。对于较大的颗粒（如二十面体病毒颗粒或其他大分子复合物），其尺寸可能超过高分辨率下的景深范围，从而在标准三维重构算法中因对Ewald球面进行平面近似而引入相位误差36。这些误差可通过已在常用冷冻电镜图像处理软件包中实现的先进算法进行校正37,28,39。由于200 kV数据的Ewald球面曲率大于300 kV数据，因此在使用200 kV TEM时，Ewald球面校正需在相对较低的分辨率下和/或针对相对较小的大分子复合物进行。另一方面，当冰层较薄（20–50 nm），且显著薄于200–300 keV电子的平均自由程（220–280 nm）时，200 kV图像中颗粒的对比度更高。这种更高的对比度有助于改善单个颗粒的全局正确对齐，尤其对于散射信号较弱的小型蛋白质（其结构尚未明确）以及尚未建立良好三维参考模型的情况尤为有利。
本文以20S蛋白酶体为例，证明了在使用200 kV透射电子显微镜（TEM）时，通过能量过滤器同样可以提高图像的对比度和质量。在使用相同数量颗粒的情况下，采用20 eV狭缝收集的数据重建分辨率达到2.26 Å，而使用完全打开的能量狭缝所收集的数据仅重建到2.34 Å分辨率。最佳的重建结果来自使用10 eV狭缝收集的数据，其分辨率达到了2.14 Å。这些结果与理论预测一致：过滤掉非弹性散射电子可提高所采集图像的信噪比（SNR），从而在给定颗粒数量的情况下促进冷冻电镜（cryo-EM）三维重构实现更高分辨率，如表4所总结。这些结论进一步通过从各数据集计算得到的B因子得到验证，B因子结果表明能量过滤后的数据集图像质量更高。
因此，我们可以得出结论：尽管300 kV透射电子显微镜（TEM）在冷冻电镜重构中能够提供最高的通量和最高的分辨率，但200 kV TEM显微镜同样能够获得用于高分辨率冷冻电镜重构的高质量数据集。本文表明，使用配备能量过滤器和直接电子探测器的200 kV TEM，可进一步提升所获取图像的质量，从而缩短整体结构解析时间。本方案详细描述了利用该设备常规获取高分辨率冷冻电镜数据所需的全部步骤，揭示大分子三维结构的精细结构细节，这对于理解结构生物学中的关键结构-功能关系以及基于结构的药物设计至关重要。

确定蛋白质结构对于理解参与关键细胞过程（如细胞代谢、信号转导或宿主-病原体相互作用）的蛋白质复合物的分子架构、功能及调控机制至关重要。冷冻电子显微镜（cryo-EM）已发展成为一种强大技术，能够解析许多传统结构生物学方法（如X射线衍射和核磁共振波谱）难以处理的蛋白质及其复合物的三维结构。特别是，cryo-EM已被证明是研究膜蛋白的首选方法，这类蛋白难以结晶或难以用传统结构技术所需的数量进行制备，该技术为理解重要的细胞受体和离子通道的结构与功能提供了新的见解1,2,3,4,5。最近，cryo-EM在抗击新冠疫情中发挥了重要作用，通过在分子水平上解析SARS-CoV-2感染机制，阐明了新冠疾病的起源，并为快速开发高效疫苗和治疗药物奠定了基础6,7,8,9,10。
通常，高分辨率生物大分子结构的测定采用高端300 kV透射电子显微镜（TEM），结合冷冻电镜单颗粒分析（SPA）技术，以揭示其构象及相互作用。近年来，当常见的基准冷冻电镜样品——脱铁铁蛋白（apo-ferritin）在配备冷场发射电子枪（E-CFEG）、直接电子探测器和能量过滤器的300 kV TEM上被重构至原子分辨率（1.2 Å）时，单颗粒分析技术达到了新的里程碑11,12。在此分辨率下，能够明确解析结构中各个原子的位置、单个氨基酸侧链的构象，以及氢键和其他相互作用，这为基于结构的新靶点药物发现以及现有候选药物的优化开辟了新的可能性。
中端200 kV透射电子显微镜（TEM）通常用于在高端TEM显微镜进行最终高分辨率数据采集前的样品筛选和优化，尤其是在规模较大的冷冻电镜设施中。通常情况下，成像样品的分辨率可达3–4 Å范围，足以满足转移至高端300 kV TEM进行最终数据采集的要求。因此，使用200 kV TEM的数据采集通常不会进一步优化以追求尽可能高的分辨率。此外，许多重要的生物学问题在该分辨率下已可得到解答并发表，因为此时所有氨基酸侧链均已清晰可辨，配体结合位点的占据情况也可被可靠确定13。已有研究表明，对于多种样品，200 kV TEM的分辨率可突破3 Å14,15,16,17,18。在200 kV下获取的图像中，成像颗粒本身具有更高的固有对比度，尽管在高分辨率区域的信号衰减较300 kV图像更为明显，但这一特性甚至可能有助于颗粒更精确的初始对齐。需要指出的是，冷冻电镜重构图谱所达到的分辨率也受到样品结构柔性和构象异质性的限制，这对200 kV和300 kV的重构结果均有影响。事实上，使用300 kV系统获得的冷冻电镜重构图谱中，处于3–4 Å分辨率范围的数量远多于更高分辨率的结果19。由于200 kV TEM显微镜结构更简单且占用空间更小，因此对于通过冷冻电镜技术解析生物大分子结构而言，这类显微镜是一种成本较低的理想选择，同时仍可保持对存储在显微镜自动进样系统中的多个样品进行长时间自动化数据采集的能力。
要获得可用于高分辨率结构解析的冷冻电镜数据集，需要对显微镜光学系统进行精确校准。光路校准按顺序系统性地从电子源开始，依次进行聚光镜系统、物镜以及配备电子探测器的能量过滤器的校准。通常情况下，并不需要执行完整的校准流程。当需要校准时，用户可通过显微镜用户界面（Direct Alignments控制面板）中的半自动化程序进行操作，每一步均有上下文相关的帮助窗口提供详细说明。一旦显微镜完成全面校准，电子光学系统将保持稳定，校准参数在至少几个月内无需更改。只有最敏感的几项校准，例如样品平面的平行照明、物镜像散和无彗差校准，必须在每次数据采集开始前进行精细优化。数据采集过程中，可使用多种软件包（如EPU Quality Monitor、cryoSPARC Live20、Relion21、Scipion22、WARP23 或 Appion24）实时监测所采集数据的质量。
除了显微镜的精确校准外，获得高质量且高度纯化的样品（具有最小的构象和组成异质性）也是采集高分辨率数据集并解析高分辨率结构的先决条件。有关典型实验流程、常见挑战及可能解决方案的更多细节，可参见其他专注于该主题的综述文献25,26,27。本质上，关键在于找到冷冻电镜载网上冰层足够薄的区域，以保留高分辨率信息，并且单个颗粒以随机取向均匀分布且无重叠。然而，典型的冷冻电镜载网冰层厚度往往不均一，因此寻找并选择最佳成像区域至关重要。目前已有多种方法可用于估计载网上的冰层厚度，这些功能包含在专用于自动化采集冷冻电镜数据集的软件包中，例如 EPU&#160;2、Leginon28 或 SerialEM29。
快速且灵敏的直接电子探测器的出现使得图像能够以电影形式采集为多个分帧，从而实现了对电子束诱导运动的校正，显著提高了图像处理和最终三维重构所用数据的质量和数量30。与此同时，自动化和高通量的数据采集产生了包含数千张图像/电影的海量数据集，给数据存储和访问带来了挑战。对于服务于数十至数百名用户的大型冷冻电镜设施而言，尤其需要在既定的冷冻电镜流程中实施有序的数据管理，实现有效的数据追踪与共享31,32。
本研究描述了一种利用200 kV Glacios透射电子显微镜常规采集高分辨率冷冻电镜数据集的实验方案。文中介绍了显微镜光学系统的必要校准步骤，以及冷冻电镜样品的评估方法和适合高分辨率数据采集区域的选择流程。同时展示了在Athena——一个数据管理平台中，如何组织采集到的数据及其与样品信息相关的元数据，该平台有助于对样品信息和采集数据进行审查。利用小鼠脱铁铁蛋白样品，成功获得了分辨率为1.6 Å的三维重构结果13。根据所述实验方案，我们还对嗜热酸浆菌（Thermoplasma acidophilum）的20S蛋白酶体实现了分辨率为2.1 Å的三维密度图重构。

<table><tbody><tr><td>AutoGrid 圆环</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1036173</td><td>标准电镜载网用 AutoGrid 圆环，每包 100 个。</td></tr><tr><td>C-Clip</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1036171</td><td>每包 100 个夹子，用于将标准电镜载网固定在 AutoGrid 圆环内。&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>数据管理平台</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1160939</td><td>Glacios 基础配置的组成部分；包含 Athena 软件</td></tr><tr><td>EPU 质量监控模块</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1179770</td><td></td></tr><tr><td>EPU 软件</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1025080</td><td>Glacios 基础配置的组成部分</td></tr><tr><td>Ethane 3.5</td><td>Westfalen</td><td>A06010110</td><td>用于制备液态乙烷的乙烷气体（纯度至少为 N35，即 99.95% 体积分数）</td></tr><tr><td>Falcon 4 200kV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1166936</td><td>直接电子探测器</td></tr><tr><td>Glacios</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1149551</td><td>200 kV 透射电子显微镜</td></tr><tr><td>GloQube Plus 电镜载网辉光放电系统及表面改性系统</td><td>Quorum</td><td>N/A</td><td>亦可通过 Thermo Fisher Scientific 购得（货号 1160602）</td></tr><tr><td>QuantiFoil 载网</td><td>Quantifoil</td><td>N/A</td><td>R-2/1，300 目；碳支持膜载网</td></tr><tr><td>Relion</td><td>MRC 分子生物学实验室</td><td>N/A</td><td>开源软件：&lt;br/&gt; https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/</td></tr><tr><td>Selectris 配 Falcon&lt;br/&gt; 4（适用于 200 kV）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1191753</td><td>能量过滤器</td></tr><tr><td>Selectris X 配 Falcon&lt;br/&gt; 4（适用于 200 kV）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1191755</td><td>能量过滤器</td></tr><tr><td>UltrAuFoil 载网</td><td>Quantifoil</td><td>N/A</td><td>R-1.2/1.2，300 目；金支持膜载网</td></tr><tr><td>Vitrobot Mk. IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1086439</td><td>自动化玻璃化冷冻系统</td></tr><tr><td>Whatman 595 滤纸</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AA00420S</td><td></td></tr></tbody></table>

使用200 kv透射电子显微镜常规采集高分辨率冷冻电镜数据集

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

冷冻电子显微镜（cryo-EM）在过去十年中已成为蛋白质结构测定的常规方法，在已发表的结构数据中所占比例日益增加。透射电子显微镜（TEM）技术与自动化方面的最新进展，显著提高了数据采集速度和图像质量，同时降低了获得亚3 Å分辨率冷冻电镜图谱所需的专业技术门槛。尽管大多数高分辨率结构是利用先进的300 kV冷冻透射电镜系统获得的，但配备能量过滤器的200 kV冷冻透射电镜系统同样能够解析出高分辨率结构。此外，显微镜校准与数据采集的自动化，结合实时图像质量评估，降低了系统的操作复杂性，并确保显微镜始终处于最优设置状态，从而提高了高质量图像的产出率及整体数据采集通量。本实验方案展示了在200 kV冷冻透射电子显微镜上实施最新技术进展与自动化功能的具体方法，并说明如何采集可用于三维结构重构的足够数据 从头合成 原子模型构建。我们重点关注实现此类高分辨率冷冻电镜数据集常规采集所需遵循的最佳实践、关键变量及常见问题。特别详细评述了以下核心主题：i）显微镜校准的自动化，ii）数据采集区域的合理选择，iii）高质量、高通量数据采集的最优光学参数，iv）能量过滤器的调谐以实现零损失成像，以及 v）数据管理与质量评估。通过脱铁铁蛋白（apo-ferritin）的实例展示最佳实践的应用，该样品经重建达到1.6 Å分辨率，并演示了使用能量过滤器提升可实现分辨率的效果。 Thermoplasma acidophilum 使用配备能量过滤器和直接电子探测器的200 kV透射电子显微镜，将20S蛋白酶体重构至2.1 Å分辨率。

数据管理平台提供了一个单一的软件平台，用于高效、结构化地存储来自多个实验流程的采集图像、数据及相关元数据。在创建的项目中，每个定义的实验均由一个工作流程组成，该工作流程包含客户自定义的步骤，用于记录样本信息、采集数据及相关元数据，且不受任何限制，从而为各种可能的实验和所有使用场景提供最大程度的灵活性和可用性（图1，图2）。数据管理平台还具备实验室笔记功能，可用于展示工作流程步骤，包括带有中间结果的图像处理过程，所有这些内容均可与项目关联，为数据分析以及报告和论文的撰写提供尽可能完整的记录。
<img alt="项目工作流程图；步骤：从生物化学到论文撰写；冷冻电镜流程；数据输出。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：数据管理平台中数据与元数据可能组织方式的示例。 每个项目可包含多个实验，例如冷冻电镜或质谱分析（参见实验方案步骤2.3）。每个实验可包含多个用户自定义的工作流程（参见实验方案步骤2.5），每个工作流程由多个可配置的步骤组成（参见实验方案步骤2.7）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="生物化学与成像工作流程图，包括筛选和处理步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：数据管理平台中已打开项目工作流程的视图。该图展示了工作流程中已打开步骤的相关元数据和备注。左侧的图标栏可快速访问数据管理平台的不同选项和菜单。左侧面板包含已保存工作流程的列表（此处仅显示一个已保存的工作流程“Exp2_ApoF_EFTEM_Grid7”）以及一个用于添加新工作流程的蓝色按钮。中央面板显示已打开工作流程中的各个步骤，此处以单粒子分析（SPA）工作流程为例展示。右上角的蓝色按钮可在已打开的工作流程中添加额外步骤。右侧面板用于记录工作流程的元数据或用户输入的备注，可包含文本、表格和图像。文本支持多种格式化选项。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
使用传统冷冻电镜载网制备设备（如Vitrobot）制备的冷冻电镜载网，其表面通常会呈现冰层厚度梯度。部分载网在手动操作和/或夹入自动载网环载体后可能发生损坏（弯曲）。图3展示了Atlas概览中不同载网的示例。冰层过厚或已损坏的载网应排除在后续研究之外。
<img alt="显示衍射图案、网格形成、光学分析方法的显微镜图像；100μm比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：Atlas概览中观察到的不同网格图集。（A）冰层过厚的劣质网格，（B）弯曲且冰质差并伴有冰污染的网格，（C）具有理想冰层梯度的可接受网格，（D）具有良好薄冰层和较小冰层梯度的典型网格。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
选择无损伤且冰层厚度适宜的网格区域对于采集高分辨率数据集至关重要。即使在单个网格区域内，冰层厚度也可能存在差异，因此必须从每个选定的网格区域中仅挑选冰层最薄的孔洞。图4展示了一个支撑膜完整且中心区域冰层较薄的合适网格区域。该网格区域适用于设置筛选条件，以在所有选定的网格区域中自动挑选冰层较薄的孔洞，因为它包含了不同冰层厚度的区域以及无冰的空白孔洞，这对于在“孔洞选择”任务中设定冰层滤波的合适强度范围极为有用。
<img alt="冰的质量过滤图；用于材料表征的电子显微镜网格分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：一个具有冰厚度梯度的网格方格示例，中心为无冰的网格孔，靠近网格条处为厚冰。 冰的质量过滤可用于选择孔洞内具有理想冰厚度的强度范围，这些孔洞在网格方格中被相应地选中（绿色覆盖的孔洞）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
使用所述方案对川香组提供的小鼠脱铁铁蛋白（apo-ferritin, apoF）样品进行测试，获得了基准结果11。apoF是一种富含α-螺旋的蛋白质，可形成高度稳定的八面体笼状结构。其高稳定性和高对称性使其成为高分辨率冷冻电镜成像与图像处理的理想样品。因此，apoF已成为评估冷冻电镜仪器性能的标准样品11,12,13。取一管含15 mg/mL纯化apoF的冻存样品，置于冰上解冻，并在10,000 ×g条件下离心10分钟以澄清。将上清液用含20 mM HEPES（pH 7.5）和150 mM NaCl的缓冲液稀释至5 mg/mL。取3 µL稀释后的样品滴加于经辉光放电处理的R-1.2/1.3型、300目金载网上，孵育30秒。随后滤纸吸去多余液体5秒，立即将载网浸入由液氮冷却的液态乙烷中进行速冻。速冻过程使用全自动玻璃化系统完成，环境湿度为100%，温度为4 °C。所有载网均装入自动载网夹后，载入200 kV冷冻透射电镜中。以每小时约300张电影图像的速度共收集约3000张电影图像。数据处理采用文献所述方法11，并作如下修改：i）使用Relion 4-beta版本替代Relion 3.1；ii）使用先前apoF重构结果的二维分类平均图作为参考模板，进行自动化颗粒挑选；iii）初始三维模型由先前apoF重构结果经低通滤波至15-Å分辨率后生成。本数据集未进行光学分组，因为所采用的AFIS流程34已被证实能高效且可靠地最小化由电子束倾斜引起的相位偏移，从而不会限制数据质量以达到报道的分辨率水平。经过贝叶斯抛光和CTF精修后的三维精修，获得了分辨率为1.68 Å的三维密度图。进一步通过埃瓦尔德球校正，分辨率提升至1.63 Å。数据收集与处理参数概览见表2，最终重构的密度图见图5，傅里叶壳层相关（FSC）曲线见补充图8。
表2：用于脱辅基铁蛋白三维重构的数据采集与图像处理参数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/Table%202-63519R2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
<img alt="蛋白质的冷冻电镜结构与原子分辨率图解，展示其分子构型。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：脱铁铁蛋白的冷冻电镜重构。（左图）在1.6 Å分辨率下重构的脱铁铁蛋白（apoF）冷冻电镜密度图的三维渲染图。（右图）重构密度图在单个氨基酸侧链水平的详细视图。氨基酸侧链的密度清晰可辨，原子模型可明确地构建于该密度图中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
使用能量过滤器在单颗粒冷冻电镜（SPA）重构中的效果和优势通过来自 T. acidophilum的原核20S蛋白酶体进行了评估。原核20S蛋白酶体也被用作标准的冷冻电镜样品，因其代表了具有D7对称性的蛋白酶体复合物的稳定催化核心。载网的制备方法是将4.5 µL纯化的T. acidophilum 20S蛋白酶体样品加到经辉光放电处理的200目R 2/1铜载网上。样品使用全自动玻璃化系统在4 °C和100%湿度条件下，以20的 blot 力度和4.5 s的 blot 时间，在液态乙烷/丙烷混合物中进行玻璃化冷冻。
使用相同冷冻电镜载网上的相似载网方格，通过不同能量过滤器狭缝宽度依次收集了三组不同的数据集，顺序如下：i) 狭缝完全打开（未插入狭缝），ii) 20 eV 狭缝，iii) 10 eV 狭缝。载网方格通过分析软件中的冰层质量筛选功能进行选择。数据收集和数据处理的所有其他参数均保持一致。每组数据集采集时长为15小时，共采集4000个电影文件，并按照文献11所述方法使用Relion 3.1进行处理，唯一修改之处是采用拉普拉斯高斯粒子挑选算法，从完整数据集中生成初始2D分类平均图，用于基于参考的粒子挑选。每组数据集均随机选取相同数量（102,200个）的粒子用于最终迭代及3D重构。数据处理参数详见下表（表3），以获得最终重构的EM电子密度图（如图6所示），其FSC曲线见于补充图9。这些数据集均未进行光学分组或埃瓦尔德球面校正。
表3：用于嗜酸热原体（T. acidophilum）20S 蛋白酶体三维重构的数据采集与图像处理参数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/Table%203-63519R2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表4：冷冻电镜三维重构达到的分辨率与B因子总结 T. acidophilum 使用不同能量狭缝宽度的数据集研究20S蛋白酶体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/Table%204-63519R2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载此表格。</a>
<img alt="冷冻电镜结构分析；显示未过滤和10 eV狭缝数据的电子显微镜图像，分子模型。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63519/63519fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：能量过滤对冷冻电镜图像的影响。 （A）使用或不使用10 eV狭缝在不同离焦值下采集的冷冻电镜图像。（B）带有分段亚基的20S蛋白酶体冷冻电镜图谱概览。（C）拟合原子模型的20S蛋白酶体图谱的局部放大视图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/63519fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：使用在100倍至165,000倍全放大范围内均可见的六角冰晶，对分析软件中不同光学预设（红椭圆）之间的图像位移进行校准（黄椭圆）。（顶部）数据采集与孔/等中心高度预设之间的校准，（中部）孔/等中心高度与网格方格预设之间的校准，（底部）网格方格与图谱预设之间的校准。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure01_rev01_EPUalign-Final.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：分析软件中的自动消像散功能（黄色椭圆）。（左图）采集的图像。（右图）采集图像的傅里叶变换，显示同心的索恩环及其在径向光束中的CTF拟合结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure02_rev01_EPUastigmatism-Final.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图3：分析软件中用于彗差校正的Autocoma功能的用户界面（黄色椭圆）。 图像面板显示了在不同电子束倾斜角度下采集的傅里叶变换图像及其CTF拟合结果，这些用于计算彗差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure03_rev01_EPUcoma-Final.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图4：能量滤波器调谐的用户界面。 能量滤波器等色性良好调谐示例，所有参数（以绿色文字显示）均在规格范围内。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure04_rev01_Sherpa_isochromacity%20-final.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图5：能量滤波器调谐的用户界面。 能量滤波器放大倍率畸变的良好调谐示例，所有参数（以绿色文字显示）均在规格范围内。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure05_rev01_Sherpa_mag-distortions-Final.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图6：能量滤波器调谐的用户界面。 能量滤波器色差畸变的良好调谐示例，所有参数（以绿色文本显示）均在规格范围内。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure06_rev01_Sherpa_chrom-distortions-Final.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图7：EPU质量监控器的DataViz面板，展示所收集的冷冻电镜数据集的数据质量概览。 该面板中的图表汇总了所有采集的图像/电影数据，显示了若干关键质量指标的数值（点状图）和分布情况（柱状图），例如CTF拟合置信度（蓝色）、离焦值（橙色）和像散（绿色）。用户可在DataViz面板顶部设置参数过滤条件，以选择部分采集的图像/电影数据。应用过滤后，可将选中的图像/电影导出，用于Relion或CryoSpark等其他图像处理软件的进一步处理。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure07_rev01_DataViz.tif" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图8：根据Relion 4-beta报告的脱辅基F（apoF）最终重构结果在1.6 Å分辨率下的FSC曲线。 蓝色曲线显示了由两个互斥的半数据集独立精修得到的两个掩膜3D图谱之间的FSC。根据0.143黄金标准FSC阈值，由完整数据集重建的最终3D图谱分辨率为1.6 Å。橙色曲线显示了相位随机化后掩膜3D重构图谱的FSC。FSC曲线的迅速下降表明所使用的掩膜在约2 Å分辨率以上并未对原始重构图谱（蓝色曲线）的FSC产生显著影响。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure08_rev01_FSC_apoF.tif" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图9：使用不同能量过滤器狭缝宽度对T. acidophilum 20S蛋白酶体进行最终重构的FSC曲线（由Relion 3.1报告）。 蓝色曲线显示了分别来自每套数据两个半数据集独立精修所得的掩膜3D图谱之间的FSC。依据“黄金标准”FSC阈值0.143，最终从各完整数据集重建的3D图谱分辨率分别为2.3 Å、2.2 Å和2.1 Å。红色曲线显示了相位随机化后掩膜图谱的FSC。红色FSC曲线迅速下降，表明所使用的掩膜在约3 Å分辨率以上并未对原始重构图谱的FSC产生显著影响。绿色曲线显示了未掩膜3D图谱的FSC，由于受到整个重构3D体积中噪声的影响，其下降早于掩膜3D图谱的FSC。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63519/SuppFigure09_rev02_T20S_FSCs.tif" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
数据可用性： 冷冻电镜密度图已存入电子显微镜数据银行，登录编号如下：脱铁铁蛋白：EMD 14173，EMPIAR-10973；20S 蛋白酶体：EMD 14467，EMPIAR-10976。

使用200 kV透射电子显微镜（TEM）也可获得大分子的高分辨率冷冻电镜图谱。本方案介绍了实现精确光学对中、数据采集策略以及成像区域选择的最佳实践，这些步骤对于利用200 kV TEM成功获取高分辨率数据集至关重要。

使用200 kV透射电子显微镜常规采集高分辨率冷冻电镜数据集

冷冻电子显微镜技术（cryo-EM）在过去十年中已成为蛋白质结构测定的常规方法，随着……

冷冻电镜（Cryo-EM）已成为测定蛋白质及其复合物结构的标准技术。本方案描述了如何利用中等范围的200 kV透射电子显微镜（TEM）获得高分辨率Cryo-EM数据集的最佳实践。Cryo-EM能够在接近天然溶液条件下，同时解析多种构象状态和功能状态的蛋白质结构，这是其他结构生物学技术难以实现的。获得的结构信息可用于阐明蛋白质功能的分子机制，也可用于基于结构的药物设计。例如，近期一篇关于淀粉样纤维结构的研究论文揭示了一种重要配体的多个结合位点。然而，在本实验方案中，我们采用脱铁铁蛋白和蛋白酶体的标准样品，以演示获取高分辨率冷冻电镜数据的关键步骤。近年来，冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）的操作已变得更加简便，尤其是由于引入了先进的自动化功能。然而，在首次使用时，我们建议您接受经验更丰富的用户进行培训。在此基础上，该技术的掌握进程将相对较快。演示该实验操作的是赛默飞世尔科技公司的高级应用科学家 Adrian Koh。在液氮条件下，将自动网格插入自动装载盒中。将装有自动网格的装载盒插入经液氮冷却的转移胶囊内。将样品舱进一步插入显微镜，然后在显微镜用户界面中点击“Dock”按钮，将样品舱中的样品盒载入显微镜的自动进样器中。点击“Inventory”按钮以检查已加载样品盒中自动载网的存在情况。随后点击“Load”和“Unload”按钮，将自动载网插入透射电镜成像用的镜筒中。选择图谱选项卡，然后点击“新建会话”按钮以打开一个新会话。填写会话名称和数据存储位置等详细信息，然后点击“应用”按钮。通过勾选相应网格编号旁边的复选框，选择感兴趣的网格。单击“开始”按钮，以全自动方式收集所有选定网格的图谱集。当采集完成后，单击网格标签以查看获取的图谱集。选择 EPU 选项卡，然后在左侧面板中进入“新建会话”以创建新会话。选择“新建会话”选项以使用当前的光学预设设置。填写会话名称。选择会话的手动类型，以便在后续实验流程中手动控制用于数据采集的单个孔和网格区域的选择。选择更快的采集模式，以使用无像差的图像偏移进行数据采集。然后输入保存元数据的位置。单击“应用”按钮以创建新会话。在左侧面板中选择方形选择任务，以显示采集到的网格图谱。识别具有完整支撑膜、无损伤、薄玻璃态冰和膜孔、网格方格内结晶冰污染可忽略不计且网格方格及单个膜孔内亮度梯度最小的网格方格。在完整图谱或高质量 tile 图像中选择用于数据采集的网格方格。右键单击感兴趣的网格方格，选择整体选中任务。单击自动对中按钮，自动移动至第一个选定的网格方格。调整对中高度，并获取网格方格图像以寻找载网孔。单击“查找孔洞”按钮以在图像中查找箔片上的孔洞。单击“移除孔洞”按钮并关闭网格条按钮，以取消选择靠近网格条的孔洞。调整冰过滤器亮度直方图中的阈值范围，以剔除冰层过厚以及完全空的孔洞。在网格方格图像中的孔位上单击右键，选择“移动载物台至位置”→“在此处移动载物台”。在左侧面板中选择模板定义任务。单击“采集”按钮以获取整幅图像。将图像偏移后的延迟时间设置为0.5秒，将台面偏移后的延迟时间设置为5秒。点击“查找并居中孔洞”按钮，使图像中的孔洞居中。选择“添加采集区域”按钮，并在图像上点击已居中孔洞中的位置，以确定高倍成像采集的位置。单击“添加自动对焦区域”按钮，然后在图像上点击选择位于中心孔附近支撑膜上的位置，以进行图像自动对焦。单击绿色的“采集区域”以在软件窗口顶部区域的离焦列表中设置一系列离焦值。完成自动对焦相关参数设置后，选择“居中后”选项，以便在每个AFIS簇开始时自动执行对焦。选择“物镜”选项以实现更快的自动对焦并减少载物台漂移。在孔选择任务中，单击“准备所有方格”按钮，系统将根据此第一个网格方格中设置的参数，自动配置数据采集及其他所有选定的网格方格。选择模板定义任务，采集一幅新图像，通过右键单击将载物台移动至碳膜上的洁净区域，并选择菜单选项“将载物台移至此处”。选择“自动功能”选项卡。在设置所需的离焦量并进行迭代后，切换到自动聚焦预设，然后单击“开始”按钮以运行自动聚焦功能。选择“自动消像散”任务，切换到“Thon环”预设，然后按下“开始”按钮。选择 Autocoma 任务并按下开始按钮。将载物台移动至网格方格断裂的区域。通过拍摄一张自动对焦图像来确认该区域的透光性。打开 Sherpa 用户界面，选择能量滤波应用。点击 Center 按钮和零损失选项，以居中零损失能量滤波狭缝。在等色性选项中点击 Tune 按钮。单击几何畸变和色差畸变中的“调节放大倍数和调节畸变”选项。转到 EPU 选项卡，选择自动采集任务，然后单击“开始运行”按钮以启动全自动数据采集。该图显示了冷冻电镜载网，其表面冰层厚度呈梯度变化。被排除在进一步研究之外的载网包括冰层过厚的劣质载网，以及存在弯曲、冰层质量差且被污染的载网；而符合要求的载网则是具有理想冰层梯度的载网，以及具有均匀薄冰层和较小冰层梯度的典型载网。该图展示了重建的脱铁铁蛋白冷冻电镜三维结构图。由于其高度的稳定性和对称性，脱铁铁蛋白成为高分辨率冷冻电镜成像与图像处理的理想基准样品。贝叶斯精修、CTF 精修以及埃瓦尔德球校正获得了分辨率为 1.63 埃的三维重构图。该图展示了去辅基铁蛋白冷冻电镜图在单个氨基酸侧链水平上的详细视图。氨基酸侧链的密度清晰可辨，原子模型可在图中明确构建。此处图像显示了从同一块冷冻电镜载网、相似的载网方格区域采集的两组不同离焦值下的数据集，其中一组使用全开狭缝，另一组使用10电子伏特狭缝，结果表明10电子伏特狭缝显著提高了图像对比度。下图展示了作为标准冷冻电镜样品的20S蛋白酶体冷冻电镜图谱的总体结构，以及其分割后的亚基。放大视图中叠加了拟合的原子模型，代表具有D7对称性的蛋白酶体复合物的稳定催化核心。该方案包含两个关键步骤：一是寻找含有均匀颗粒且玻璃态冰较薄的区域；二是设置平行照明以进行数据采集。随着蛋白质的高分辨率重构已达到两到三埃的分辨率，人们能够更深入地理解疾病的分子机制，并优化药物研发的先导化合物。过去，若要研究生物现象的结构基础，必须进行结晶。而如今借助冷冻电镜（Cryo-EM），这一限制已不复存在。因此，通过冷冻电镜技术，我们使科学家能够在结构层面上研究更广泛的生物现象。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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使用 Leginon 进行样品台倾斜的单颗粒冷冻电镜数据采集

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使用200 kV透射电子显微镜常规采集高分辨率冷冻电镜数据集

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