Name: 三尖瓣瓣叶的层显微切割，用于双轴力学表征和微观结构定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 学习三尖瓣瓣叶的层显微切割技术，用于双轴力学表征和胶原定量分析。该方法可分离各组织层并直接比较其力学与微观结构特性，为心血管生物力学研究提供新视角。

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本研究工作得到了美国心脏协会科学家发展基金（16SDG27760143）和长老会健康基金会的资助。KMC 部分得到了俄克拉荷马大学（OU）本科生研究机会计划和荣誉研究学徒计划的支持。DWL 部分得到了美国国家科学基金会研究生研究奖学金（GRF 2019254233）以及美国心脏协会/儿童心脏基金会博士前奖学金（奖项编号 #821298）的支持。谨此对上述所有资助表示衷心感谢。

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<li>Sommer, G., Regitnig, P., Költringer, L., Holzapfel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biaxial+mechanical+properties+of+intact+and+layer-dissected+human+carotid+arteries+at+physiological+and+supraphysiological+loadings%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Biaxial mechanical properties of intact and layer-dissected human carotid arteries at physiological and supraphysiological loadings.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (3), 898-912 (2009).</li>
<li>Holzapfel, G. A., Sommer, G., Gasser, C., Regitnig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+layer-specific+mechanical+properties+ofhuman+coronary+arteries+with+intimal+thickening%2C+and+related+constitutive+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Determination of the layer-specific mechanical properties ofhuman coronary arteries with intimal thickening, and related constitutive modelling.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (5), 2048-2058 (2005).</li>
<li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiaxial+mechanical+response+and+constitutive+modeling+of+esophageal+tissues%3A+Impact+on+esophageal+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Multiaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 9 (12), 9379-9391 (2013).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

该方案的关键步骤包括：（i）分层显微解剖，（ii）组织包埋，（iii）定位标记物放置，以及（iv）pSFDI装置设置。其中，适当的分层显微解剖是本方法最重要且最具挑战性的环节。在开展使用该技术的研究之前，解剖操作者应长期练习显微解剖技术，并熟练掌握全部三种腱索瓣叶（TV leaflets）的处理。操作者应确保所获取的复合层组织样本足够大（&#62;3.3 mm），且厚度均匀。应通过组织学方法确认每次解剖均能实现准确的层次分离。
进行组织安装时，必须将组织固定在双轴测试仪上，确保组织平整，无任何人为拉伸或皱褶。这些误差将导致力学数据不准确。由于复合层更薄，因此更容易出现此类误差。在粘贴标记点时，必须确保标记点位于组织中央三分之一区域内，且彼此之间不发生粘连。标记点位置不当将导致组织拉伸程度的量化结果不准确。最后，pSFDI投影光的亮度必须谨慎选择，并在完整组织及其复合层的测量过程中保持不变。若亮度发生变化，则无法对完整组织与其复合层的pSFDI结果进行比较。
本文所述方法的灵活性主要体现在双轴力学表征方面，而大多数问题的出现则集中在基于...

三尖瓣位于心脏的右心房与右心室之间。在整个心动周期中，三尖瓣通过前瓣叶（TVAL）、后瓣叶（TVPL）和隔瓣叶（TVSL）的周期性开闭，调控血液的单向流动。这些瓣叶结构复杂，具有四层不同的解剖结构——心房层（A）、疏松层（S）、纤维层（F）和心室层（V）——每层均含有独特的微观结构成分。心房层和心室层中的弹性纤维有助于组织在机械负荷后恢复至未变形的几何形态1。相比之下，纤维层含有致密的波浪状胶原纤维网络，赋予瓣叶承受负荷的能力2。疏松层主要由糖胺聚糖组成，被认为可在心脏瓣膜功能过程中促进瓣叶各层之间的剪切滑动3。尽管这三种瓣叶均具有相同的解剖层次，但各层的厚度及成分比例存在差异，从而影响不同瓣叶特有的力学行为。
研究人员已通过平面力学表征、组织形态学评估以及胶原纤维结构的光学表征等方法，探索了三尖瓣（TV）瓣叶的特性。例如，平面双轴力学表征通过在组织上施加相互垂直的位移并记录相应的力，以模拟生理载荷条件。由此获得的力-位移（或应力-伸长率）数据表明，所有三个三尖瓣瓣叶均表现出非线性、方向特异性的力学行为，且在径向组织方向上表现出更为明显的瓣叶特异性响应4,5,6。这些瓣叶特异性行为被认为源于采用常规组织学技术观察到的微观结构特性差异6,7。此外，二次谐波产生成像6、小角度光散射8和偏振空间频率域成像7&#160;(pSFDI) 旨在深入理解这些微观结构特性，已揭示出胶原纤维取向和纤维屈曲在不同瓣叶之间存在特异性差异，这些差异对观察到的组织层面力学行为具有重要意义。这些研究显著推进了我们对组织微观结构及其在组织层面行为中作用的理解。然而，在实验上建立组织力学特性与潜在微观结构之间的关联方面，仍有许多问题有待解决。
近期，本实验室采用显微解剖技术将三尖瓣（TV）小叶分层为两层复合结构（A/S层和F/V层），并对这两层进行了力学表征9。先前的研究突出了各层之间力学性能的差异，有助于揭示分层微结构如何影响组织的力学行为。尽管该研究增进了我们对三尖瓣小叶微结构的理解，但该技术仍存在若干局限性。首先，复合层的力学性能未与完整组织直接比较，导致对力学-微结构关系的理解尚不完整。其次，未对复合层的胶原纤维架构进行分析。第三，由于难以从其余两个三尖瓣小叶中获取复合层，研究仅限于三尖瓣前叶（TVAL）的各层。本文所述方法提供了一个整体性表征框架，克服了上述局限性，实现了对三尖瓣小叶及其复合层的全面表征。
本文介绍了一种显微解剖技术，可将三尖瓣（TV）的三个瓣叶分离为其组成层次（A/S层和F/V层），以进行双轴力学性能和微观结构表征10,11,12。该迭代式实验流程包括：（i）对完整瓣叶进行双轴力学测试和偏振空间频率域成像（pSFDI）表征；（ii）采用一种新颖且可重复的显微解剖技术，可靠地获取TV的各组成层次；（iii）对TV组成层次进行双轴力学测试和pSFDI表征。在力学测试中，组织样本受到不同力比的双轴拉伸载荷作用。随后，利用pSFDI技术测定在不同加载状态下胶原纤维的取向与排列情况。pSFDI能够保持胶原纤维的天然结构，支持载荷依赖性分析，并避免了传统方法中为分析胶原纤维结构而必需的组织固定或透明处理步骤（如二次谐波成像或小角度光散射技术）。最后，采用标准组织学技术制备样本，以观察组织的微观结构。这一迭代式、整体化的研究框架，实现了三尖瓣瓣叶与其组成层次在力学性能和微观结构特性上的直接比较。

<table><tbody><tr><td>中性缓冲10%福尔马林溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Alconox清洗剂</td><td>Alconox</td><td></td><td>清洁化合物</td></tr><tr><td>BioTester - 双轴拉伸测试仪</td><td>CellScale生物材料测试公司</td><td></td><td>1.5 N 负荷传感器容量</td></tr><tr><td>切割垫</td><td>Dahle</td><td>B0027RS8DU</td><td></td></tr><tr><td>去离子水</td><td>不适用</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细尖工具</td><td>HTI INSTRUMENTS</td><td>NSPLS-12</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>Scientific Labwares</td><td>16122</td><td></td></tr><tr><td>粗头镊子</td><td>Scientific Labwares</td><td>161001078</td><td></td></tr><tr><td>细头镊子</td><td>Scientific Labwares</td><td>16127</td><td></td></tr><tr><td>LabJoy</td><td>CellScale生物材料测试公司</td><td>版本 10.66</td><td></td></tr><tr><td>激光位移传感器</td><td>Keyence</td><td>IL-030</td><td></td></tr><tr><td>液态氰基丙烯酸酯胶水</td><td>Loctite</td><td>2436365</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>版本 2020a</td><td></td></tr><tr><td>微型剪刀</td><td>HTI Instruments</td><td>CAS55C</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Belmaks</td><td>360758081051Y4</td><td></td></tr><tr><td>偏振空间频率域成像装置</td><td>不适用</td><td></td><td>自制设备，使用数字光投影仪、线性偏振片、旋转偏振片支架和电荷耦合器件相机组装而成。&lt;br/&gt; 更多细节请参见 doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699)。</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>THINKPRICE</td><td>TP-SCALPEL-3010</td><td></td></tr><tr><td>单刃工业剃须刀片（外科级碳素钢）</td><td>VWR International</td><td>H3515541105024</td><td></td></tr><tr><td>外科标记笔</td><td>LabAider</td><td>LAB-Skin-6</td><td></td></tr><tr><td>T型销钉</td><td>Business Source</td><td>BSN32351</td><td></td></tr><tr><td>石蜡板</td><td>不适用</td><td></td><td>自制，使用造型蜡和烤盘制作</td></tr><tr><td>称量舟</td><td>Pure Ponta</td><td>mdo-azoc-1030</td><td></td></tr></tbody></table>

三尖瓣瓣叶分层显微切割用于双轴力学表征与微观结构定量分析

Layer Microdissection of Tricuspid Valve Leaflets for Biaxial Mechanical Characterization and Microstructural Quantification

三尖瓣（TV）调控着未氧合血液从右心房单向流入右心室。三尖瓣由三个瓣叶构成，每个瓣叶具有独特的力学行为。通过研究其四个解剖层次——心房层（A）、疏松层（S）、纤维层（F）和心室层（V），可进一步理解这三个三尖瓣瓣叶之间的差异。尽管这四个层次在所有三个三尖瓣瓣叶中均存在，但它们在厚度和微观结构成分上的差异进一步影响了各自特有的力学行为。
本方案包含四个步骤，以阐明各层之间的特异性差异：（i）表征完整三尖瓣瓣叶的力学性能及胶原纤维结构行为；（ii）分离三尖瓣瓣叶的复合层（A/S层和F/V层）；（iii）对分离后的复合层进行相同的表征；（iv）执行 事后 组织学评估。该实验框架能够直接比较完整的三尖瓣（TV）组织与其各个组成层。因此，利用本方案可获取有关三尖瓣瓣叶微结构和生物力学功能的详细信息。这些信息有望用于构建三尖瓣的计算模型，以期为三尖瓣疾病的临床治疗提供指导。

显微解剖将获得厚度相对均匀的A/S和F/V样本，可将其安装至（商用）双轴测试装置上。对完整小叶及两个解剖分层进行组织学分析，可验证组织是否沿海绵层与纤维层之间的边界被正确分离（图7）。此外，可利用ImageJ软件分析组织学显微图像，以测定各组织层的厚度及组分质量分数。当解剖所得A/S样本过小而无法固定于双轴测试仪时，即视为解剖失败。此类情况最常发生在剥离过程中A/S发生撕裂，或因腱索过厚导致F/V层出现孔洞。
位移控制的力学测试及后续处理可生成描述组织非线性力学行为的应力-应变数据（图8）。样品通常具有各向异性，其中周向组织方向的力学响应比径向组织方向更刚硬。表格 1）。这些低抗拉性和高抗拉性能可通过附加的分析技术进行定量测定。6,14综合评估双轴力比率的范围可进一步揭示组织的方向...

本方案描述了三尖瓣瓣叶的双轴力学表征、基于偏振空间频域成像的胶原定量以及显微解剖方法。所提供的方法阐明了瓣叶各层如何共同影响整体瓣叶的功能特性。

三尖瓣（TV）调节未氧合血液从右心房单向流入右心室。三尖瓣由三个……组成

该方法可分离出不同组织层对整体组织行为的贡献，从而为组织微结构提供新的认识。我们的显微解剖与测试框架使我们能够直接比较心脏瓣膜瓣叶与其自身复合层之间的力学性能和微结构特性。显微解剖技术较难掌握，因此强烈建议在正式开展研究前尽可能多地进行练习。首先，准备所需的材料：石蜡板、去离子水、移液器、解剖刀、显微剪、细镊子、弯头镊子、粗镊子和大头针。将组织从双向力学测试仪上取下，并使用激光位移传感器测量其厚度。然后将组织放置在石蜡板上。检查组织心室面是否存在粗大的腱索插入。拍摄照片以作参考。将组织平铺在蜡板上，使心房面朝上。为将组织固定在板上，需在组织每个角的外侧斜向插入一根针，使组织轻微绷紧。确保针位于组织穿刺孔的外侧，在进行切片显微切割时组织保持方正且不发生移位。如有必要，可在解剖过程中于组织侧边加插针以进一步拉伸组织。移除玻璃珠定位标记。用移液管将去离子水滴加到组织表面，使其以类似气泡的方式完全覆盖组织。为形成初始角，选择固定标本的一个角，避开脆弱区域中较大的弦索插入部位。然后，沿用于力学测试的安装孔，用手术刀轻轻拖过组织表面，切割动脉/静脉（A/S）层。切口边缘开始分离，暴露出下方的脂肪/血管（F/V）层。使用钝头细镊子，用力沿切口摩擦，以进一步分开其边缘。如果A/S层的切口未开始分离，可用解剖刀轻轻沿原切口再次划过。作第二条与第一条切口垂直的切口。若两个切口未连通，则将细镊子插入分隔两切口的小块组织下方。然后，小心使用剪刀剪开组织。用细镊子沿角部的切口轻轻摩擦，直至组织与F/V层分离。一旦有小块组织分离，立即用大镊子夹住，并轻轻拉动，以进一步分离复合层。继续剥离组织，同时用较大的镊子夹住组织以防止A/S复合层发生意外撕裂，并摩擦切口直至到达为角部所做两个切口的末端。如果第一个角在分离过程中出现严重问题，可尝试选择另一个角作为起始点。随后，制作第二个角时，将第一个角的两个切口延伸：将手术刀尖置于每个切口的底部，轻轻沿组织表面拖动，使延伸的切口与原始切口相连，并继续沿着齿状结构或缝线孔行进。继续延伸切口，同时揉搓切缝，将上层复合的A/S层向后剥离，直至完成一侧。观察到组织将沿一条切口完全分离。接着，在已完全剥离的一侧末端，垂直创建第二个角。在避免大范围弦状插入的同时，延长其余切口。仅当排除弦状插入能够获得足够大的前庭/耳蜗（A/S）样本用于实验表征时，才在A/S分离区域排除弦状插入。采用与处理第一个角时相同的揉搓和牵拉技术，继续分离A/S层和F/V层。一旦组织出现撕裂或破孔，应立即停止分离操作。为防止镊子被卡住，可将剪刀插入形成的任何破孔中，并从中心向外剪除组织。若破损沿分离缝出现，则应从另一边缘开始重新分离组织。分离组织时，注意观察可能出现的层间连接，这些连接会阻碍组织的进一步分离。可见这些连接为细而坚韧的条索状结构，需使用剪刀小心剪断。操作时应避免在A/S层中造成破孔，或向下剪入F/V层。继续此操作，直至分离出尽可能大的A/S层样本。使用手术笔标记样本的方向。最后，用剪刀沿剩余组织边缘的分离缝线处剪开。将分离的A/S复合层平放在切割垫上。如有必要，使用手术刀修整组织边缘，制成适合进行双向力学测试的方形组织。将A/S层置于去离子水中，直至准备进行测试。标记保留在石蜡板上的 F/V 层的方向。在 A/S 层被去除的区域中，切出尽可能大的正方形，然后将其放入去离子水中。对完整小叶及分离的两层组织进行组织学分析，以验证组织是否沿海绵层与纤维层之间的边界被正确分离。利用ImageJ软件对组织学显微图像进行分析，测定各组织层的厚度及组分质量分数。通过位移控制的力学测试及后续数据处理，获得了三尖瓣前瓣、三尖瓣后瓣和三尖瓣隔瓣的膜张力-拉伸曲线数据，描述了该组织的非线性力学行为。偏振空间频率域成像数据生成了胶原纤维取向和光学各向异性程度的彩色图谱。具体而言，这些彩色图谱提供了对整个组织样本中胶原纤维结构的全面理解。需要注意的是，复合层在从固定的组织上分离后会发生收缩。尽可能采集最大量的样本，以确保有足够的组织用于后续检测。

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三尖瓣瓣叶的层显微切割，用于双轴力学表征和微观结构定量

细胞外基质的刚度显著影响黏附细胞的多种行为。基质刚度在组织内存在空间上的差异，并在多种疾病状态下发生改变。本文中，我们建立了利用原子力显微镜微压痕技术来表征正常及纤维化小鼠肺组织中刚度空间变化的方法。...

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超声心动图常用于无创性地表征和量化心脏结构与功能的变化。本文介绍一种基于超声成像的分析算法，可提供心肌微结构的增强替代测量指标，并可利用开放获取的图像分析软件进行操作。...

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我们描述了使用数字图像相关技术来表征经受单轴拉伸试验的血管组织样本表面局部应变场的方法。这些测量有助于精确量化样本的力学响应，并建立本构应力-应变关系。...

利用数字图像相关技术表征血管组织样本上的局部应变

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小鼠瓣膜性心脏病全面表型特征的超声心动图方法与方案

本方案包括对房室瓣叶进行力控制、位移控制和应力松弛双向力学测试的表征。通过本方案获得的结果可用于构建本构模型，以在有限元模拟框架下仿真功能性瓣膜的力学行为。...

房室心瓣的双轴力学表征

本文介绍了一种相关性工作流程，用于切除、加压、固定和成像小鼠肺动脉瓣，以确定其宏观构象及局部细胞外基质结构。...

小鼠肺动脉瓣相关成像的手术与样本处理

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离体心脏小梁收缩过程中的明场、荧光与光学相干断层成像同步观察 Ex Vivo

快速的心肌和心脏舒张对于正常生理功能至关重要。目前已知机械舒张机制依赖于应变率。本方案概述了实验数据的采集与分析方法，以进一步研究舒张过程的机械调控机制。...

利用完整心脏小梁进行松弛的机械控制

本方案展示了在显微镜引导下分离小鼠肺静脉并进行免疫荧光染色的方法。我们制备包含左心房、肺静脉及相应肺组织的样本，并对心肌肌钙蛋白T和连接蛋白43进行染色。...

小鼠肺静脉心肌袖的显微解剖与免疫荧光染色

本文描述了合成声带模型的制备方法。这些模型为真人尺寸，可模拟人类声带的多层结构。实验结果表明，这些模型能够在与肺部压力相当的压力下自发振荡，并表现出与人类声带相似的流致振动响应。...

合成多层自振式声带模型的制备

学习三尖瓣瓣叶的层显微切割技术，用于双轴力学表征和胶原定量分析。该方法可分离各组织层并直接比较其力学与微观结构特性，为心血管生物力学研究提供新视角。

三尖瓣瓣叶分层显微切割用于双轴力学表征与微观结构定量分析

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