三尖瓣瓣叶的层显微切割，用于双轴力学表征和微观结构定量
February 10th, 2022
该协议描述了双轴力学表征，基于偏振空间频域成像的胶原定量以及三尖瓣小叶的显微解剖。提供的方法阐明了小叶层如何促进整体小叶行为。
这种方法可以分离组织层对整体组织行为的贡献，为组织微观结构提供新的见解。我们的显微切割和测试框架使我们能够直接将心脏瓣膜传单的机械和微观结构特性与其自身的复合层进行比较。显微解剖可能很难掌握，因此，强烈建议在开始研究之前尽可能多地练习。
首先，收集所需的材料，蜡板，去离子水，移液器，手术刀，微剪刀，薄镊子，弯曲镊子，厚镊子和针。从双轴测试仪上卸下组织，并使用激光位移传感器测量其厚度。将纸巾放在蜡板上。
检查组织的室侧是否有大的脊索插入。拍照留念。将纸巾平放在蜡板上，心房朝上。
要将纸巾固定在板上，在每个角落放置一个远离组织的针脚，使其稍微拉紧组织。确保销钉位于安装组织时齿形孔的外部，并且组织是方形的，并且在层显微切割过程中不会移动。如有必要，在解剖过程中沿着组织侧面放置针脚以进一步拉伸组织。
取下玻璃珠基准标记。用移液管将去离子水放在组织表面上，使其以气泡状方式完全覆盖组织。要制作初始角，请选择固定试样的一角，避免在脆弱区域插入大片。
然后，通过沿着安装孔将手术刀轻轻拖到组织表面上进行机械测试来切割A / S层。切口的边缘开始拉开，露出下面的F / V层。用钝而薄的镊子，沿着切口牢固地摩擦以进一步分离其边缘。
如果 A/S 层中的切口没有开始拉开，请用手术刀再次在同一切口上轻轻描摹。垂直于第一个切口进行第二个切口。如果两个切口没有连接，则在分离两个切口的小区域下运行薄镊子。
然后，小心地用剪刀剪开纸巾。用薄镊子沿着角落的切口摩擦，直到组织与F / V层分离。一旦分离出一小块组织，用大镊子抓住它并轻轻拉动它以进一步分离复合层。
继续剥离组织，同时用较大的镊子抓住它，以防止不必要的撕裂和撕裂A / S复合层，并摩擦接缝直到它到达为角落做的两个切口的末端。如果第一个角在分离方面存在重大问题，请尝试使用其他角作为起点。然后，要制作第二个角，通过将手术刀尖端放在每个切口的底部并沿着组织表面轻轻拖动它来扩展为第一个角所做的两个切口，以便切口延伸连接到原始切口并继续沿着齿孔或缝合孔。
继续延伸切口并向后剥离顶部的复合A / S层，同时摩擦接缝直到一面完成。观察组织将沿着一个切口完全分离。接下来，创建垂直于完全剥离的一侧末端的第二个角。
延长剩余的切口，同时避免大的脊索插入。仅当这种排除允许足够大的A / S标本用于实验表征时，才从A / S分离区域中排除chorda插入。继续使用第一个角采用的摩擦和拉动技术来分离 A/S 和 F/V 层。
如果形成撕裂或孔洞，请立即停止分离组织。为了防止镊子被抓住，请将剪刀放在任何形成的孔中，并将组织从中心切开。如果缺陷沿着分离的接缝形成，则开始沿着另一条边缘分离组织。
寻找分离组织时可能出现的层间连接，并防止进一步的组织分离。请注意，这些是细而坚固的股线，必须用剪刀小心切开。避免在 A/S 层中形成孔或向下切入 F/V 层。
继续此过程，直到分离出最大可能的 A/S 层样本。使用手术笔标记样品的方向。最后，用剪刀沿着分离缝切除剩余的组织边缘。
将分离的 A/S 复合层平放在切割垫上。如有必要，使用手术刀拉直组织的边缘，并创建适合双轴力学测试的方形组织形状。将A / S层放入去离子水中，直到准备好进行测试。
标记蜡板上残留的 F/V 层的方向。将尽可能大的正方形切除去除 A/S 图层的区域。然后，将其放入去离子水中。
对完整小叶和两个解剖层的组织学分析验证了组织是否沿着海绵体和纤维化之间的边界正确分离。组织学显微照片用于使用ImageJ软件确定组织层厚度和组成质量分数。位移控制的力学测试和后处理产生了三尖瓣前叶、三尖瓣后叶和三尖瓣隔叶的膜张力与拉伸数据的关系，描述了组织的非线性力学行为。
偏振空间频域成像数据产生了胶原纤维取向和光学各向异性的彩色图。具体而言，这些彩色图提供了对整个组织标本中胶原纤维结构的全面了解。重要的是要注意，一旦它们与固定的组织分离，复合层就会收缩。
收集尽可能大的样本，以确保有足够的组织用于后续测试。
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概述
本协议描述了一种用于三尖瓣瓣膜的双轴机械特性表征和胶原蛋白定量的方法。它提供了有关瓣膜层如何对整体瓣膜行为的贡献的见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 心血管生物学
- 组织力学
背景
- 了解心脏瓣膜力学对心血管健康至关重要。
- 显微解剖技术可以揭示组织层的贡献。
- 胶原蛋白定量有助于评估组织特性。
- 机械测试提供了关于组织行为的见解。
研究目的
- 分离组织层对整体行为的贡献。
- 比较心脏瓣膜的机械和微观结构特性。
- 增强对心脏瓣膜微观结构的理解。
所用方法
- 三尖瓣瓣膜的双轴机械测试。
- 用于胶原蛋白定量的偏振空间频率域成像。
- 组织层的显微解剖以进行详细分析。
- 使用特定工具（如手术刀和镊子）进行解剖。
主要结果
- 成功测量了不同组织层的单独贡献。
- 机械性能在不同层之间存在显著差异。
- 胶原蛋白定量提供了关于组织结构的见解。
- 方法允许直接比较复合层。
结论
- 该研究增强了对心脏瓣膜力学的理解。
- 显微解剖技术需要练习才能达到熟练水平。
- 获得的见解可以为未来的心血管研究提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
Layer-specific mechanical and microstructural quantification of tricuspid valve leaflets addresses a critical gap in understanding tissue-level determinants of valve function and failure. This protocol enables direct comparison of intact and dissected leaflet layers, supporting predictive modeling and mechanistic de-risking in early cardiovascular device and therapeutic development. The approach enhances portfolio decision-making by providing high-resolution data for computational model validation and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of tissue-layer contributions to overall valve mechanics for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by quantifying layer-specific biomechanical and microstructural properties.
- Provides data to refine computational models, increasing predictive confidence in target selection.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated tissue samples for reproducible mechanical and imaging assays.
- Standardizes measurement of membrane tension and collagen architecture across tissue layers.
- Enables quantitative outputs for downstream screening of biomaterials or device-tissue interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microstructural and biomechanical data with disease-relevant tissue models for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement of valve repair or replacement strategies by clarifying tissue mechanics.
- Provides a framework for biomarker discovery linked to tissue integrity and function.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-fidelity tissue data for model development, assay validation, and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on the role of specific leaflet layers in valve function and pathology.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative mechanical and microstructural readouts for assay development.
- Analytics: Provides membrane tension-stretch curves and collagen orientation maps for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by aligning tissue mechanics with disease states.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable protocol for tissue characterization across cardiovascular research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in tissue-based research.
- Operational Value: Standardizes tissue dissection and testing for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage risk in device or therapeutic development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on validated tissue mechanics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection and tissue handling for reproducible results.
- Needs access to biaxial mechanical testers, imaging systems, and histological analysis tools.
- Demands cross-team standardization of dissection and measurement protocols.
- May require adaptation for different valve types or species-specific tissues.
- Sample size and tissue integrity can limit downstream testing and analysis.
