三尖瓣瓣叶分层显微切割用于双轴力学表征与微观结构定量分析

该方法可分离出不同组织层对整体组织行为的贡献，从而为组织微结构提供新的认识。我们的显微解剖与测试框架使我们能够直接比较心脏瓣膜瓣叶与其自身复合层之间的力学性能和微结构特性。显微解剖技术较难掌握，因此强烈建议在正式开展研究前尽可能多地进行练习。

首先，准备所需的材料：石蜡板、去离子水、移液器、解剖刀、显微剪、细镊子、弯头镊子、粗镊子和大头针。将组织从双向力学测试仪上取下，并使用激光位移传感器测量其厚度。然后将组织放置在石蜡板上。

检查组织心室面是否存在粗大的腱索插入。拍摄照片以作参考。将组织平铺在蜡板上，使心房面朝上。

为将组织固定在板上，需在组织每个角的外侧斜向插入一根针，使组织轻微绷紧。确保针位于组织穿刺孔的外侧，在进行切片显微切割时组织保持方正且不发生移位。如有必要，可在解剖过程中于组织侧边加插针以进一步拉伸组织。

移除玻璃珠定位标记。用移液管将去离子水滴加到组织表面，使其以类似气泡的方式完全覆盖组织。为形成初始角，选择固定标本的一个角，避开脆弱区域中较大的弦索插入部位。

然后，沿用于力学测试的安装孔，用手术刀轻轻拖过组织表面，切割动脉/静脉（A/S）层。切口边缘开始分离，暴露出下方的脂肪/血管（F/V）层。使用钝头细镊子，用力沿切口摩擦，以进一步分开其边缘。

如果A/S层的切口未开始分离，可用解剖刀轻轻沿原切口再次划过。作第二条与第一条切口垂直的切口。若两个切口未连通，则将细镊子插入分隔两切口的小块组织下方。

然后，小心使用剪刀剪开组织。用细镊子沿角部的切口轻轻摩擦，直至组织与F/V层分离。一旦有小块组织分离，立即用大镊子夹住，并轻轻拉动，以进一步分离复合层。

继续剥离组织，同时用较大的镊子夹住组织以防止A/S复合层发生意外撕裂，并摩擦切口直至到达为角部所做两个切口的末端。如果第一个角在分离过程中出现严重问题，可尝试选择另一个角作为起始点。随后，制作第二个角时，将第一个角的两个切口延伸：将手术刀尖置于每个切口的底部，轻轻沿组织表面拖动，使延伸的切口与原始切口相连，并继续沿着齿状结构或缝线孔行进。

继续延伸切口，同时揉搓切缝，将上层复合的A/S层向后剥离，直至完成一侧。观察到组织将沿一条切口完全分离。接着，在已完全剥离的一侧末端，垂直创建第二个角。

在避免大范围弦状插入的同时，延长其余切口。仅当排除弦状插入能够获得足够大的前庭/耳蜗（A/S）样本用于实验表征时，才在A/S分离区域排除弦状插入。采用与处理第一个角时相同的揉搓和牵拉技术，继续分离A/S层和F/V层。

一旦组织出现撕裂或破孔，应立即停止分离操作。为防止镊子被卡住，可将剪刀插入形成的任何破孔中，并从中心向外剪除组织。若破损沿分离缝出现，则应从另一边缘开始重新分离组织。

分离组织时，注意观察可能出现的层间连接，这些连接会阻碍组织的进一步分离。可见这些连接为细而坚韧的条索状结构，需使用剪刀小心剪断。操作时应避免在A/S层中造成破孔，或向下剪入F/V层。

继续此操作，直至分离出尽可能大的A/S层样本。使用手术笔标记样本的方向。最后，用剪刀沿剩余组织边缘的分离缝线处剪开。

将分离的A/S复合层平放在切割垫上。如有必要，使用手术刀修整组织边缘，制成适合进行双向力学测试的方形组织。将A/S层置于去离子水中，直至准备进行测试。

标记保留在石蜡板上的 F/V 层的方向。在 A/S 层被去除的区域中，切出尽可能大的正方形，然后将其放入去离子水中。

对完整小叶及分离的两层组织进行组织学分析，以验证组织是否沿海绵层与纤维层之间的边界被正确分离。利用ImageJ软件对组织学显微图像进行分析，测定各组织层的厚度及组分质量分数。通过位移控制的力学测试及后续数据处理，获得了三尖瓣前瓣、三尖瓣后瓣和三尖瓣隔瓣的膜张力-拉伸曲线数据，描述了该组织的非线性力学行为。

偏振空间频率域成像数据生成了胶原纤维取向和光学各向异性程度的彩色图谱。具体而言，这些彩色图谱提供了对整个组织样本中胶原纤维结构的全面理解。需要注意的是，复合层在从固定的组织上分离后会发生收缩。

尽可能采集最大量的样本，以确保有足够的组织用于后续检测。