连续流PCR微流控芯片中 大肠杆 菌的扩增及毛细管电泳系统的检测

该协议描述了如何构建基于微流控芯片的连续流聚合酶链系统，以及如何在实验室中构建毛细管电泳系统。它提供了一种在实验室中分析核酸的简单方法。聚合酶链反应是用于扩增靶基因的传统方法。

然而，传统的PCR由于温度变化效率低，非常耗时。该工作提出了一种基于微流控芯片的连续流PCR系统。通过将PCR溶液运行到放置在不同温度的加热器上的微通道中，可以大大缩短扩增时间。

由于CE具有高分辨率、高速度和出色的重现性等许多优点，因此它成为实验室中用于分析核酸和蛋白质的常用工具。然而，由于CE仪器价格高昂，大多数实验室，尤其是发展中国家的实验室，负担不起这项技术。在此，我们概述了如何制造CF-PCR微流控芯片以及如何在实验室中构建多功能CE系统的协议。

我们还演示了CF-PCR系统扩增大肠杆菌的过程，以及CE系统检测PCR产物的过程。通过遵循本协议中描述的程序，用户应该能够制造微流控芯片，制备PCR溶液，构建用于核酸扩增的CF-PCR系统，并建立简单的CE系统，即使资源有限，也可以分离DNA片段。将硅片在 200 摄氏度下加热 25 分钟以去除水分。

每英寸晶圆分配一毫升 SU-8 2075 光刻胶。使用旋涂机以 500 rpm 的速度在硅晶圆上旋转 5 到 10 秒，以每秒 100 rpm 的速度旋转，然后以 2， 000 rpm 的速度旋转 30 秒，以每秒 500 rpm 的速度旋转。在 65 摄氏度下软烤 3 分钟，在 95 摄氏度下烘烤 15 分钟。

将每平方厘米150至215毫焦耳设置为光刻机的曝光能量，并用光刻掩模将设计的图案雕刻在光刻胶上。放置硅晶圆和掩模，准备曝光。曝光后，将晶圆在 65 摄氏度下烘烤两分钟，在 95 摄氏度下烘烤七分钟。

将硅晶圆浸入显影液中以去除多余的光刻胶，并在可以看到微通道时将其取出。然后用异丙醇冲洗掉残留的显影液。将聚二甲基硅氧烷预聚物和固化剂以 10 比 1 的比例混合。

将混合的PDMS溶液倒入复制模具中，在80摄氏度下固化60分钟。使用等离子清洗机激活后将PDMS微流控芯片粘合在载玻片上，并尽快在80°C下固化30分钟。使用涡旋混合器和离心机确保试剂充分混合。

准备离心管。首先向离心管中加水。然后加入DNA模板、引物、缓冲液、dNTP混合物、吐温20、PVP，最后加入DNA聚合酶。

最后，通过涡旋混合溶液。准备两个PTC陶瓷加热器、两个固态继电器、两个温度控制器、两个温度传感器和一根电源线。将加热器连接到固态继电器。

将固态继电器连接到PID温度控制器。然后将温度传感器探头连接到两个加热器的底部，并将端子连接到PID温度控制器。最后，将两个固态继电器串联起来，并连接电源线。

3D打印两个加热器的插槽，并将加热器保持在同一平面上。将微流控芯片放在两个加热器上。准备注射器泵和注射器，然后将注射器固定在注射器泵上。

用注射器连接硅胶管，并将钢针连接到硅胶管的顶部。将钢针插入微流控芯片的入口。将移液器吸头放在芯片的出口处以收集PCR产物。

使用高压电源产生脉冲场电场。看，这是一个高压电源。这些是正极和负极。

使用汞灯作为光源，通过滤光片过滤汞灯的激发波长。将毛细管放在显微镜载物台上。用物镜收集荧光发射，然后通过光电倍增管检测。

这是我们的显微镜，这是我们的毛细管。现在我们在黑暗的房间条件下打开灯。激发光由物镜收集。

使用自主研发的LABVIEW软件控制电源，完成数据采集。将CF-PCR系统的加热器温度预设为65°C和95°C。将微流控芯片放在两个加热块上。

将硅胶管的尖端插入含有50微升PCR溶液的离心管中。拉动注射器柱塞以缓慢抽出溶液。将注射器固定在注射泵上。

将钢针插入微流控芯片的入口。将泵的流量设置为每分钟 10 微升，然后按下启动按钮将溶液推入微芯片入口处的微通道中。在微流控芯片的出口处收集PCR产物。

准备总长度为 8 厘米、有效长度为 6 厘米的毛细管。通过混合 100 微升 1%HEC、2 微升 100x SYBR Green 和 98 微升超纯水来制备分离缓冲液，以获得含有 1x SYBR Green 的 0.5%HEC。 使用真空泵用准备好的分离缓冲液填充毛细管。

在软件界面输入进样电压和进样时间，点击开始按钮，等待PCR产物被电动力引入毛细管。在软件界面输入直流电压，点击开始按钮，以每厘米100伏的电场强度进行电泳。在毛细管中分离所有 DNA 片段后，单击停止按钮。

每次运行后用消毒水冲洗毛细管一分钟。这张图片代表了PCR产物和DNA标记物的电泳图。我们首先在CF-PCR系统中扩增了大肠杆菌的靶基因，PCR溶液从芯片的入口到出口大约需要10分30秒。

大肠杆菌靶扩增子的大小为544 bp。之后，我们分析了毛细管电泳系统中扩增的PCR产物。此外，我们还在相同的实验条件下对100 bp DNA分子量标准进行了毛细管电泳。

PCR产物的大小可以根据DNA分子量标准的电泳图进行评估。为了重现性，每个实验进行三次。该图数据显示，分离后观察到大肠杆菌PCR产物对应的峰，微流控芯片中PCR产物的迁移时间与热循环仪中的迁移时间一致。

PCR 和 CE 都是核酸分析中两种流行的生物技术。本文介绍了使用内部构建的CF-PCR和CE系统扩增大肠杆菌和PCR产物检测。大肠杆菌靶基因在10 min内成功扩增，8 min内分离出小于1， 500 bp的DNA片段。

此外，本文介绍的基于微流控芯片的CF-PCR系统和CE系统易于制造，可以为实验室中核酸的分析提供一种简单的方法。它一次只能扩增和检测一个样品，这限制了它的广泛应用。因此，用于病原体高通量检测的集成CF-PCR和CE微流控芯片阵列的开发仍在进行中。