Name: 用于胶质母细胞瘤脉冲电场治疗的柔性有机电子器件 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 了解利用柔性有机电子器件向胶质母细胞瘤施加脉冲电场以研究其治疗效果的实验方案。该方法结合微加工技术制备电极，并通过体内成像可视化肿瘤微环境，为精准医疗提供新途径。

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本研究工作得到了法国国家科研署（ANR-18-CE19-0029）的支持。作者衷心感谢 S.M. Bardet 在构建稳定表达 GCaMP6f 的细胞系方面所做的贡献，以及 D. O'Connor 在 in ovo 模型实验中提供的帮助。

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本研究中描述的方法能够实现整合了脉冲电场（PEF）递送系统的脑肿瘤模型，用于研究脉冲电场在不同生物组织层次上的效应。微加工工艺包含标准的薄膜制备流程，可在电极设计上提供高度的自由度，并可根据具体应用进行调整。在某些情况下，制造过程结束后增加一步额外的热退火处理，有助于减少电极在加工过程中产生的弯曲现象。
使用稳定表达荧光钙指示剂的胶质母细胞瘤细胞系可避免与染料递送和滞留相关的所有问题，尤其是在非常致密的三维肿瘤中16。事实上，与传统的化学荧光钙指示剂相比，该方法可在较长时间内维持较高的表达水平17。本方案可应用于多种细胞系，因其已广泛用于神经活动成像11。本文中使用了人源和小鼠源细胞系（分别为U87和Gl261，用于在免疫缺陷或免疫健全小鼠体内进行移植）。然而，近期研究表明，U87细胞系经过多年的细胞培养已积累大量突变，与原始细胞存在差异，从而影响实验的可重复性18。用于制备三维肿瘤的方法具有高通量、可重复性强的优点，并可根据细胞系类型、接种细胞数量及培养时间生成特定尺寸的类球体19。但这些类球体结构致密，在对肿瘤核心区域进行成像时存在不利影响。
在研究脉冲电场（PEF）对三维肿瘤及其血管系统的影响时，in ovo 模型可作为初步研究手段，其优势在于避免了脑组织中其他细胞类型的相互作用。该模型成本低、操作快速、通量高，且相较于动物模型面临的伦理问题更少。在整个实验过程中必须保持胚胎的完整性，因为任何损伤都可能影响胚胎存活及成像质量。打开鹌鹑蛋时需格外小心，以避免损伤胚胎膜。移植肿瘤组织及放置柔性电极时也必须谨慎操作，防止出血导致胚胎死亡。通过向血管内注射荧光染料，可利用荧光显微镜同时观察肿瘤细胞和血管生成情况。眼内注射时需精细操作，防止染料泄漏至胚胎液中，否则可能造成背景残留荧光，降低成像质量。该模型还可用于追踪药物摄取过程，因其可直接进入循环系统。然而，由于胚胎最长存活时间为12天，因此仅能进行约7天的观察，显著短于in vivo模型21。
在动物因突然减重20%而达到伦理实验终点之前，体内脑肿瘤&#160;模型可被监测4至5周。该模型耐受性良好，只要电极的连接尾部不过长，即可保持稳定。否则，动物容易抓挠翻转连接器，可能导致其最终撕裂，从而无法与刺激器再次连接。尽管如此，这4周的时间足以覆盖胶质母细胞瘤发展的各个阶段。通过在不同时间点比较同一感兴趣体积内的肿瘤细胞密度，可以观察到肿瘤生长动力学的演变过程。特别是，在免疫转换时期观察到肿瘤生长增强22。在存在刺激电极的情况下进行类似研究，将有助于了解脉冲电场（PEF）对肿瘤增殖速率以及肿瘤对免疫清除敏感性的影响。与卵内模型相比，体内模型可被视为研究免疫细胞对肿瘤进展影响及其在PEF治疗效应中所起作用的有价值的临床前模型。本方案改编自先前发表的文章，并在放置颅窗前增加了柔性电极装置14。由于初始刺激预期会诱导细胞死亡并引发免疫反应的持续失调，因此可通过双光子显微镜进行直接和后续观察，从而表征肿瘤的急性和慢性生物电治疗效应。
在双光子显微镜下，柔性探针的连接部分易于接触。因此，可以根据观察到的对神经组织和/或靶向细胞的影响，实时调整电刺激参数，这类似于医生在观察患者磁共振成像（MRI）或计算机断层扫描（CT）图像的同时进行介入手术操作。最后需要注意的是，使用瞬干胶和硅胶对脑部电极进行仔细密封至关重要，以防止组织再生。
综上所述，本文所述方案代表了一种利用柔性有机聚合物电极研究脉冲电场疗法对胶质母细胞瘤模型作用的创新模型。这两种模型具有不同水平的复杂性，因而可将细胞、血管或免疫效应分离开来，以更深入地理解其作用机制。贴合性、浅表电极可在破坏肿瘤微环境、引发血管收缩或细胞内钙离子失调的同时，减少医源性损伤15。

多形性胶质母细胞瘤（GBM）是一种高度侵袭性的肿瘤，因此很难通过手术切除、放疗和化疗等标准治疗方法根除。尽管采用多模式治疗，患者的预后仍然极差，大多数患者在确诊后1年内即出现疾病进展1,2。近年来，生物电治疗的发展显示出显著潜力，有望改善现有疗法。这类疗法通常在单次治疗过程中施加脉冲电场（PEF），以破坏肿瘤细胞膜的完整性及其微环境。这种细胞膜的破坏也称为电穿孔，其可逆性取决于电场强度和脉冲次数。不可逆电穿孔（IRE）作为一种非热性组织消融技术，通过电脉冲对细胞膜造成致命损伤，从而导致细胞死亡3。可逆电穿孔则应用于电化学治疗（ECT），这是一种成熟的技术，通过将脉冲电场与化疗药物联合使用，增强药物在癌细胞中的摄取4。此外，近期研究证实钙离子电穿孔可作为ECT的替代方案，具有高效、低成本且副作用更少的优势5。尽管取得了这些令人鼓舞的进展，目前PEF通常依赖刚性金属电极施加，而这类电极已知会对软组织造成损伤6。大脑对这类侵入性装置尤为敏感，其机械不匹配性可引发炎症反应和星形胶质细胞瘢痕形成7。
在此背景下，本文介绍了一种灵活的脉冲电场（PEF）递送系统，并结合从微加工到小鼠模型的胶质母细胞瘤三维模型。共形电极采用标准的薄膜微加工工艺制备，使用了聚对二甲苯-C（parylene-C）、金和PEDOT:PSS等柔软且生物相容性良好的材料8,9。采用叉指电极设计，在保持电极指间足够成像透明度的同时，覆盖较大的表面积10。在肿瘤模型方面，利用液体覆盖96孔板方法的一种改进技术，生成表达基因编码荧光报告基因的胶质母细胞瘤细胞三维球状体11。将这些球状体移植至鹌鹑胚胎的尿囊绒毛膜上，构建出一种已被广泛用于研究血管生成或药物毒理学的鸡胚内（in ovo）模型12,13。由于该阶段胚胎尚未发育免疫系统，肿瘤可在胚胎血管系统的作用下成功移植并实现血管化12。随后将柔性电极置于已血管化的肿瘤表面，以研究PEF递送对球状体及其血管系统的影响。最后，通过将工程化球状体植入小鼠模型的脑实质中，在包含肿瘤微环境和免疫系统的完整活体生物体内进一步探究这些效应14。将柔性电极置于植入部位上方，并用玻璃窗封闭颅骨开窗区域，从而实现持续数周的重复双光子成像。
这些方法将对从微电子工程到肿瘤学应用等多个领域的研究人员具有重要意义。该微加工方案可用于并适用于任何需要以PEDOT:PSS包覆薄膜金属电极的应用。此外，为评估抗肿瘤电治疗而开发的生物模型，将有助于普遍性地研究细胞、血管和免疫系统对植入材料反应的差异。

<table><tbody><tr><td>(3-环氧丙氧基丙基)三甲氧基硅烷</td><td>Sigma</td><td>440167</td><td>GOPS</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>4-十二烷基苯磺酸</td><td>Sigma</td><td>44198</td><td>DBSA</td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Falcon</td><td>353075</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>技术</td><td>530</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酸树脂</td><td>Fischer Scientific</td><td>NC1455685</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌</td><td>Tuttnauer</td><td>3150 EL</td><td></td></tr><tr><td>AZ 10XT</td><td>微化学品</td><td></td><td>正性光刻胶</td></tr><tr><td>AZ 826 MIF 显影剂</td><td>默克</td><td>10056124960</td><td>无金属离子的负性光刻胶显影液</td></tr><tr><td>AZ 开发者</td><td>默克</td><td>10054224960</td><td>无金属离子的正性光刻胶显影液</td></tr><tr><td>AZ nLof 2070</td><td>微化学品</td><td></td><td>负性光刻胶</td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>Axience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>卡洛芬</td><td>Rimadyl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R 离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>CMOS相机 Prime 95B</td><td>光度测量</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 培养箱 HERAcell 150i</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAC板</td><td>国家仪器公司</td><td>USB 6259</td><td></td></tr><tr><td>D&amp;eacute;共喷雾 P&amp;eacute;b&amp;eacute;o</td><td>培养</td><td>3167860937307</td><td>黑色丙烯酸涂料</td></tr><tr><td>德克斯特兰-德克萨斯红 70,000</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>芯片粘接胶 &quot;埃皮纳勒&quot;</td><td>日立</td><td>EN-4900GC</td><td>银浆</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>分液机</td><td>Tianhao</td><td>TH-2004C</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;s 培养基 + GlutaMAX&amp;trade;- I</td><td>Gibco</td><td>10567-014</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Egg incubator COUVAD'OR 160</td><td>lafermedemanon.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙二醇</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>6881.1</td><td></td></tr><tr><td>日本鹌鹑受精卵</td><td>Japocaille</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>VWR</td><td>S181BH</td><td></td></tr><tr><td>烧瓶</td><td>格雷纳</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>荧光体视显微镜</td><td>Leica MZFLIII</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gl261</td><td>DSMZ</td><td>ACC 802</td><td></td></tr><tr><td>金颗粒 - 直径 3 mm × 厚度 6 mm</td><td>Neyco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手持式自动细胞计数仪</td><td>Millipore</td><td>PHCC00000</td><td></td></tr><tr><td>加热干燥箱</td><td>Memmert</td><td>UF110</td><td></td></tr><tr><td>溴化六甲密胺（Hexadimethrine Bromide，Sequa-brene）</td><td>Sigma</td><td>S2667</td><td></td></tr><tr><td>热板 Delta 6 HP 350</td><td>S&amp;uuml;ss Microtec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>照明系统 pE-4000</td><td>CoolLed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>可调谐飞秒红外激光器（Ma&amp;iuml;-Ta&amp;iuml;)</td><td>Spectra Physics（美国）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>钙离子霉素（钙盐）</td><td>Sigma</td><td>I3909</td><td></td></tr><tr><td>Kapton 胶带 SCOTCH 92 33x19</td><td>3M</td><td></td><td>聚酰亚胺保护胶带</td></tr><tr><td>实验室自制脉冲发生器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labcoter 2 聚对二甲苯沉积系统 PDS 2010</td><td>脊髓刺激</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X 293 T 细胞系</td><td>Takara Bio</td><td>63218</td><td>经优化用于慢病毒生产的 HEK 293T 衍生细胞系</td></tr><tr><td>Lenti-X GoStix Plus</td><td>Takara Bio</td><td>631280</td><td>定量慢病毒滴度检测</td></tr><tr><td>掩模对准器 MJB4</td><td>S&amp;uuml;ss Microtec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-90 浓缩清洗液</td><td>国际产品</td><td>M9050-12</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片 76 x 52 x 1 mm</td><td>Marienfeld</td><td>1100420</td><td></td></tr><tr><td>30G针头</td><td>BD Microlance 3</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>PalmSens4 恒电位仪</td><td>PalmSens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚对二甲苯-C ：对二氯二甲基对二亚甲基苯</td><td>脊髓刺激</td><td>300073</td><td></td></tr><tr><td>PCB 处理槽</td><td>Mega Electronics</td><td>PA104</td><td></td></tr><tr><td>PEDOT:PSS Clevios PH 1000</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>pGP-CMV-GCaMP6f</td><td>Addgene</td><td>40755</td><td>质粒</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>等离子体处理系统 PE-100</td><td>等离子体刻蚀</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PlasmaLab 80 反应离子刻蚀机</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料口罩</td><td>塞尔巴</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料称量船 64 x 51 x 19 mm</td><td>VWR</td><td>10770-454</td><td></td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷：SYLGARD 184 硅胶弹性体试剂盒</td><td>陶氏化学</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>聚酰亚胺铜膜 60 &amp;micro;m（Kapton）</td><td>古德费洛</td><td>IM301522</td><td></td></tr><tr><td>丙-2-醇</td><td>技术</td><td>574</td><td></td></tr><tr><td>Protolaser S</td><td>LPKF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Gibco</td><td>A11103</td><td></td></tr><tr><td>直径5毫米圆形盖玻片</td><td>Fischer Scientific</td><td>50-949-439</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 传感器 - 60 &amp;micro;m</td><td>默克密理博</td><td>PHCC60050</td><td></td></tr><tr><td>硅胶粘合剂 Kwik-Sil</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>S&amp;uuml;ss Microtec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>劳雷尔</td><td>WS-650</td><td></td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>办公用品店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无四环素的 f&amp;oelig;胎牛血清</td><td>Takara Bio</td><td>631105</td><td></td></tr><tr><td>热蒸发仪 Auto 500</td><td>Boc Edwards</td><td></td><td></td></tr><tr><td>双光子显微镜</td><td>Zeiss LSM 7MP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U87-MG</td><td>ATCC</td><td>HTB-14</td><td>人胶质母细胞瘤细胞</td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex VTX-3000L</td><td>LMS</td><td>VTX100323410</td><td></td></tr><tr><td>Xfect 单次使用试剂</td><td>Takara Bio</td><td>631447</td><td>转染试剂</td></tr></tbody></table>

用于胶质母细胞瘤脉冲电场治疗的柔性有机电子器件

Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma

胶质母细胞瘤由于其高度侵袭性，难以通过标准肿瘤学疗法根除。基于脉冲电场（PEFs）的生物电治疗在提高治疗效率方面具有前景。然而，这类方法依赖于刚性电极，容易对组织造成急性和慢性损伤，尤其是在脑等软组织中尤为明显。本研究采用柔性电子器件向肿瘤递送脉冲电场，并通过荧光显微镜评估其生物学响应。在超薄透明的聚对二甲苯-C基底上制备叉指金电极，并在其表面涂覆导电聚合物PEDOT:PSS，从而获得一种可贴合、生物相容性良好的器件。利用多种生物模型考察了脉冲电场对肿瘤及其微环境的影响。首先，在电极表面培养胶质母细胞瘤单层细胞，以研究体外（in vitro）现象。作为中间步骤，建立了一种卵内（in ovo）模型，将工程化肿瘤类球体移植到鹌鹑胚胎膜中。由于缺乏免疫系统，该模型可形成高度血管化的肿瘤。在胚胎发育早期，其免疫系统尚未建立，因此肿瘤不会被识别为异物，能够快速生长并利用胚胎现有的血管系统自主形成新生血管，从而构成一种有价值的三维癌症模型。最后，在具有功能性免疫系统的完整生物体内，采用同源异种颅内移植小鼠模型评估柔性电极递送脉冲电场的效果。在植入柔性有机电极装置之前，将肿瘤类球体移植至转基因多荧光小鼠的脑内。通过密封的颅窗，可在数周时间内对脉冲电场治疗过程中的肿瘤及其微环境进行多光子成像。

本方案适用于两种胶质母细胞瘤模型，其中集成了柔性的脉冲电场（PEF）递送系统。在完成微加工和封装步骤后，通过电化学阻抗谱（EIS）在生理盐水中对柔性电极进行表征，以评估并验证其性能。PEDOT:PSS涂层电极表现出典型的由截止频率分隔的容抗主导区和电阻主导区，而未涂层电极仅显示容抗行为（图2）。
采用液体覆盖96孔板法的一种改良方法，培养由稳定表达荧光细胞内钙离子报告蛋白的转染胶质母细胞瘤细胞构成的三维肿瘤。可通过明场显微镜观察类球体的生长情况（图3；ED 0）。获得球形且致密的类球体所需时间至少为2至3天，具体时长取决于细胞系类型及接种的细胞数量。
在in ovo模型中，将类球体移植到鹌鹑胚胎的绒毛尿囊膜上（图3；ED 6）。几天后可通过荧光显微镜评估移植是否成功，因为活细胞含有胞内钙离子，因而具有荧光信号（图3；ED 9）。通过向血管内注射荧光染料，可在荧光显微镜下观察肿瘤的血管化情况（图3；ED9）。然而，由于类球体结构非常致密，可能无法始终清晰观察到肿瘤内部的血管。将柔性交错电极放置于已血管化的肿瘤表面（图3；ED 9），并连接至脉冲发生器。放置探针时应轻柔操作，以避免胚胎出血；否则荧光染料可能扩散，从而阻碍成像观察。通过测量电路中的电流，可验证脉冲是否正确传递至生物环境。对这些in ovo模型进行成像，可实现实时监测脉冲电场（PEFs）对三维胶质母细胞瘤肿瘤中胞内钙离子的影响，以及对肿瘤血管系统所诱导的血管收缩效应，同时避免了包括免疫系统在内的其他细胞类型的干扰15。
对电穿孔效应在胶质母细胞瘤中作用的研究也可在更为完整且具有预测性的模型中进行。事实上， 体内 上述模型14 将一个三维胶质母细胞瘤移植到小鼠脑实质中图4）。肿瘤注射部位被一个交联葡聚糖凝胶半球形栓塞物封闭，以模拟肿瘤生长过程中所受的生理性生物物理约束。尽管在参考文献中已有描述14需要再次强调的是，将葡聚糖半珠精确地用超级胶水粘附至硬脑膜上至关重要；否则，肿瘤可能通过未封闭的硬脑膜逸出，并完全覆盖大脑表面，导致无法成像。对于任何慢性成像实验而言，颅窗愈合过程中发生的组织向内生长都会构成严重障碍，因为新生组织不透明，会使图像变得模糊或无法使用。因此，在插入并粘牢半珠后，必须仔细地在开放颅窗的侧壁周围均匀涂覆一层薄薄的超级胶水，密封整个腔壁，同时防止胶水滑落或流入硬脑膜表面。当柔性探针放置于肿瘤注射部位上方时，探针下方不得残留气泡，原因有二：其一，气泡存在时无法进行成像；其二，气泡具有绝缘作用，会改变电刺激的电学特性。在完成上述各项预防措施后，需将一块玻璃窗用胶固定于颅骨上，封闭开颅部位，以实现持续数周的慢性成像。由于肿瘤由表达GCaMP或DsRed的细胞构成，可通过荧光显微镜确认注射效果。电极植入后，必须测量其电化学阻抗，以验证电极性能。与在生理盐水溶液中测得的阻抗相比，阻抗值会有所升高 体内 由于生物环境的存在，在100 Hz以上的频率下图5）。通过双光子显微镜，可在数周时间内透过透明基质观察并表征具有血管化的神经实质及肿瘤浸润情况。图6). 例如，使用在特定细胞（免疫细胞和神经元）中表达荧光蛋白的转基因动物，可以揭示仅由电极植入所诱导的轻微炎症反应图6A) 或显示在胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤表面植入经PEF刺激的电极后26天存在小胶质细胞和单核细胞图6B1）。在后一种情况下，肿瘤周围及内部均发现有外周单核细胞来源的细胞以及脑内常驻的小胶质细胞图6B2）。在施加PEF的当天，可将柔性电极的接触垫直接连接至双光子显微镜下的脉冲发生器。总体而言，该模型可用于研究生物电治疗对参与脑肿瘤发育的多种细胞类型随时间变化的影响，作用深度可达约 500 µm.
<img alt="金电极图案化、光刻胶曝光、柔性器件释放；工艺示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：柔性电极的微加工工艺。（A）金电极图案化与聚对二甲苯C基底。（B）轮廓开口。（C）PEDOT:PSS涂层。（D）连接与封装。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="阻抗谱图；PEDOT:PSS涂层电极与金电极的频率与阻抗关系。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：柔性金电极与PEDOT:PSS涂层冷电极在盐溶液中的电化学阻抗谱。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="鹌鹑蛋CAM示意图：孵化、无壳培养、肿瘤移植、肿瘤电极放置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：该 在卵内 胶质母细胞瘤模型 ED 0：在明场显微镜下观察到的类球体。ED 3：鹌鹑胚胎去壳培养，开窗后第3天。ED 6：在明场显微镜下观察到的植入绒毛尿囊膜（CAM）的肿瘤。ED 9：柔性装置置于血管化肿瘤上（肿瘤呈绿色，血管呈红色）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="开颅手术中神经探针装置示意图，包含脉冲发生器、柔性探针和刺激实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：体内 应用。 （A）体内 实验示意图。（B）盖玻片和丙烯酸树脂封装前的探针放置状态。（C）完成探针植入后的状态。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="阻抗与频率关系图；植入式与盐水金电极的实验电学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：柔性金电极在盐水溶液中的电化学阻抗谱与植入式探针的比较。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微流控装置的荧光显微成像，显示细胞在26天内的生长情况。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：通过电极进行的活体多光谱双光子成像。（A）对照组多荧光AMU-Neuroinflam小鼠在植入电极后第3天健康脑表面的拼接图像。青色显示第5层锥体神经元的树突分支，绿色显示募集的粒细胞和单核细胞，黄色显示活化的小胶质细胞和树突状细胞。粉红色显示由于热量积聚引起的红外扩散。（B1）与（A）类似图像，但在皮层内深200 µm处植入肿瘤类球体并立即植入电极后第26天。注意绿色和黄色免疫细胞的积聚。（B2）与（B1）类似图像，但位于电极表面下方100 µm处。注意在红色肿瘤团块周围区域存在蓝色神经元树突分支，肿瘤团块本身被黄色小胶质细胞和树突状细胞浸润。深蓝色显示来自肿瘤周围胶原的二次谐波信号。（B3）（B2）的放大视图，显示肿瘤附近存在中间神经元胞体（由箭头指示）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本研究描述了用于三维脑肿瘤模型的柔性叉指电极的开发，即 体外 培养 在卵内 模型，以及 体内 小鼠模型。该方法可用于评估脉冲电场在不同复杂程度下对肿瘤的影响。

胶质母细胞瘤由于其高度侵袭性，难以通过标准肿瘤学疗法根除。基于脉冲的生物电治疗……

本方案通过柔性电子器件递送脉冲电场，以研究其对胶质母细胞瘤的治疗效果。我们利用成像技术在活体中可视化肿瘤微环境来实现这一目标。本方案结合多种复杂程度逐步增加的模型，将生物电子器件整合其中，以研究脉动电场对癌症的影响。本研究中介绍的微加工技术也可作为治疗其他类型癌症（包括患者来源的异种移植瘤）的方法进行测试，这朝着为每位个体患者量身定制的精准医疗理念迈进了一步。这些探针采用标准的微加工技术制造，因此制造过程简单直接，任何拥有洁净室的人员均可制备。对于金电极的图案化，将洁净的玻片放入沉积室中，使用聚对二甲苯沉积系统沉积一层三微米厚的聚对二甲苯C。称取六克聚对二甲苯C放入铝舟中，将其置于炉内，抽真空后按照文中所述参数开始沉积。当沉积完成后且汽化器温度低于40摄氏度时，关闭冷却器、汽化器和炉子。泄压后收集样品。将经等离子体处理的样品以负性光刻胶进行旋涂，转速为1,000 × g，持续40秒。通过带有叉指电极图案的掩膜版对光刻胶进行曝光。然后将样品浸入无金属离子的显影液中三分钟，以去除未曝光的光刻胶。使用热蒸发仪沉积20纳米的铬粘附层和300纳米的金层时，先对蒸发仪放气，再用金属螺丝将样品固定在上方的圆形样品板上。分别将铬和金装入专用的坩埚中。密封并抽空机器，启动样品台旋转。选择装有铬的坩埚，缓慢增加电流，直至沉积速率达到每秒0.2埃。打开快门，等待铬沉积20纳米后关闭快门，再缓慢将电流降至0毫安。选择含有金的坩埚，缓慢增加电流，直至沉积速率达到每秒0.2埃。打开快门开始蒸发金，当金的沉积量达到10纳米时，将沉积速率提高至每秒1.5埃，继续沉积至总厚度约为300纳米。关闭快门，并缓慢将电流降至零毫安。将样品浸入盛有丙酮的烧杯中。然后用异丙醇冲洗样品，并用气枪吹干。以150 ×g 的转速旋涂四层 PEDOT:PSS 溶液，持续35秒。通过将样品浸入水中去除牺牲性聚对二甲苯C层。将样品浸入去离子水中30分钟，以去除PEDOT:PSS薄膜中残留的皂化物和低分子量化合物，并使样品从玻璃基底上脱离。小心地在96孔板的每个孔中加入75微升熔融的1%琼脂糖溶液，并在室温下静置15分钟使其凝固。收集稳定细胞系构建过程中转导的胶质母细胞瘤细胞，并将其消化下来。每孔接种10,000个胶质母细胞瘤细胞，用含1克/升葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和碳酸氢钠的DMEM培养基补足至每孔总体积为150微升，培养基中另含10%胎牛血清、100单位/微升青霉素和100微克/微升链霉素。此后每两天更换一半新鲜培养基，换液时将移液器吸头置于孔板上层，避免损伤琼脂糖或类球体本身，直至进行后续实验。将受精的日本鹌鹑（Coturnix japonica）卵置于孵化器内的托盘中，使用自动旋转装置，每两小时翻转一次卵。此日记为胚胎发育第0天。在胚胎发育第3天，用经70%乙醇预清洗的细尖镊子轻轻打开卵壳。将胚胎倒入一个塑料称量皿中，用另一个称量皿盖住，然后置于37摄氏度的标准恒湿培养箱中培养三天。在胚胎发育第6天，用23号针头在绒毛尿囊膜上做一个小切口。用移液器将一个培养7天的球状体放置于切口处，然后将胚胎放回培养箱中继续培养三天，直至进行后续实验。滴加一滴 DPBS 覆盖颅骨开窗区域。将柔性电极放置在 DPBS 液滴上，轻轻将探针背面带有接触垫的一侧置于小鼠背部。用一小片纸吸取 DPBS 液滴，直至探针能够平整地贴合在硬脑膜上，并顺应脑组织的曲率，确保电极下方保留一层薄薄的生理盐水，以防止胶水溢出。在探针上放置一小滴硅胶粘合剂，并用一个直径五毫米的圆形盖玻片覆盖。向下轻压盖玻片，直至硅胶均匀分布，且盖玻片与探针之间的距离最小。然后等待30秒，使硅胶固化。为了固定盖玻片，迅速在其侧面涂抹氰基丙烯酸酯胶水，并向下按压，直至胶水凝固。使用牙签在探针颈部涂抹氰基丙烯酸酯胶水，注意使胶水被吸入颈部下方，以提供稳定的支撑。用牙科水泥覆盖颅骨以构建慢性帽状结构，需特别注意仅覆盖盖玻片的边缘部分。抬起探针的后部，在探针颈部下方涂抹胶水。在胶水固化前，将探针其余部分放置在胶水上。轻轻按压探针颈部，使其表面与盖玻片齐平，确保在实验过程中不会妨碍显微镜物镜。 用牙科水泥覆盖探针颈部顶端，水泥层厚度不超过1.5毫米，以确保探针对位牢固。在盖玻片周围一至两毫米处，用水泥构建一个具有1.5毫米凸起边缘的井状结构，形成用于双光子成像浸没液的储液 basin。水泥固化后，给予术后镇痛，并将动物用纸巾包裹后置于红外灯泡附近，保持体温直至恢复。PEDOT:PSS 涂层电极显示出典型的以截止频率分隔的容性区和阻性主导区，而未涂层电极仅表现出容性行为。通过明场显微镜观察到的类球体生长情况表明，获得球形且致密的类球体至少需要两到三天，具体时间取决于细胞系和接种的细胞数量。在鸡胚尿囊膜模型中，可通过荧光显微镜评估类球体在尿囊膜上的移植情况，因为活细胞含有细胞内钙，而通过向血管内注射荧光染料可评估肿瘤的血管化情况。与生理盐水溶液中的阻抗相比，由于生物环境的存在，在体内频率高于100赫兹时阻抗预期会升高。通过双光子显微镜，可在数周内透过透明基底观察并表征血管化的神经实质及肿瘤浸润情况。使用在特定细胞中表达荧光蛋白的转基因动物，可证明仅由电极植入所引起的炎症反应极小。在植入脉冲电场刺激电极后第26天，可观察到小胶质细胞和单核细胞的存在。在肿瘤周围及内部均检测到外周单核细胞来源的细胞以及脑内固有的小胶质细胞。植入手术成功的关键在于确保颅窗的密封性和平整性，并优化探针与组织之间的接触质量。除了活体成像之外，还可以考虑将本方案与其他检测技术和方法相结合，例如血液细胞因子检测、流式细胞术评估免疫状态，甚至行为学分析。本研究为柔性可植入器件在癌症中的应用铺平了道路，并为生物电子医学治疗这一慢性疾病开辟了新的前景。

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