用于量化生长因子介导的整合素力学与黏附的张力测量锚定探针

该方案的重要性在于采用了结构简单的TGT传感器平台，用于研究EGFR-整合素串扰及其对细胞力学力的影响。Rao提出该方案旨在探究表皮生长因子（EGF）依赖性的细胞力学调控机制。该方案可适用于不同的配体、细胞类型、刺激模式，并可与具有不同张力阈值的TGT传感器联用。

表面合成最初可能看起来令人望而生畏。关键在于做好充分准备并有条不紊，通过使用试剂制备和计算的清单，精确执行复杂的步骤。在第一天，将最多八片25毫米的玻璃盖玻片放入聚四氟乙烯架中。

将支架放入盛有40毫升纯乙醇的50毫升硼硅酸盐玻璃烧杯中，在室温下以35千赫的运行频率超声处理10至15分钟。取一个50毫升烧杯，加入40毫升新配制的piranha溶液，该溶液由浓硫酸与过氧化氢按3:1的比例在Pyrex烧杯中混合，并用玻璃移液管搅拌制得。

将载玻片架转移至烧杯中，于通风橱内室温孵育30分钟，以蚀刻载玻片表面。蚀刻完成后，用镊子将载玻片架转移至盛有超纯水的烧杯中。目视检查载玻片，确保表面清洁，无任何图案或灰尘颗粒附着于玻璃表面。

将盖玻片架转移至含有200度乙醇的烧杯中，清洗两次，每次15秒，以使表面与有机溶剂达到平衡。将盖玻片架转入含有3% APTES的200度乙醇溶液中，在室温下孵育1小时，以对盖玻片进行硅烷化处理。随后将架子浸入装有干净的200度乙醇溶液的烧杯中。

使用低出口压力的氮气吹干盖玻片。将盖玻片放入一个内铺有平展石蜡膜的10厘米聚苯乙烯培养皿中。取四片置于石蜡膜上的盖玻片，每片上加入100 µL浓度为2 mg/mL的NHS-生物素DMSO溶液。

将另外四片盖玻片叠放成三明治结构，其中两片盖玻片相对放置，中间夹有功能化溶液。第二天，将培养皿从4°C取出，分离叠放的盖玻片。分离三明治结构时，避免刮伤或损坏功能化表面。

然后，将盖玻片在支架中放置，使涂层表面相对。用氮气吹干。将盖玻片放入一个新的培养皿中，培养皿内放置有封口膜。

向每个盖玻片中加入 800 微升含 0.1% 牛血清白蛋白的 1× PBS 溶液。将盖玻片在室温下孵育 30 分钟，以钝化表面并阻断后续功能化试剂的非特异性结合。为功能化盖玻片，加入 800 微升浓度为每毫升 1 微克的链霉亲和素 PBS 缓冲液（1× PBS），在室温下孵育 45 至 60 分钟。

使用PCR管和PCR仪组装TGT探针。孵育后，用1×PBS将盖玻片洗涤三次。向四片盖玻片上各加入100微升预组装的TGT探针，并将剩余四片功能化面向下的盖玻片覆盖其上，形成夹心结构。

用铝箔覆盖。孵育结束后，将夹心结构分开，并用1×PBS洗涤盖玻片三次。小心地将盖玻片组装到预先清洁的成像腔室中。

为了研究表皮生长因子刺激对Cos-7细胞力学特性、黏附及细胞铺展的影响，使用0.05%胰蛋白酶-EDTA处理Cos-7细胞，消化2分钟。用HBSS洗涤并以800 ×g离心5分钟以中和胰蛋白酶。将细胞以每孔40,000个细胞的密度接种于组装好的TGT表面，培养基为添加50纳克/毫升EGF的DMEM，或不含EGF的DMEM。

孵育结束后，用1× PBS洗涤细胞三次。在室温下，用2毫升4%多聚甲醛固定12分钟。在室温下，用1× PBS每隔5分钟洗涤盖玻片一次，共洗涤五次。

可选步骤：将盖玻片在含有50毫摩尔氯化铵的1×PBS中，37摄氏度孵育30分钟。加入缓冲液A，将带有盖玻片的成像腔室置于湿盒中，在37摄氏度孵育30分钟，以封闭并通透细胞。

用封闭缓冲液按1:250稀释倍数稀释一抗paxillin抗体。每张盖玻片加入200 µL一抗溶液，37°C孵育2小时。同时，每张盖玻片使用200 µL封闭缓冲液，其中包含按1:800稀释的双标记山羊抗兔二抗和按1:400稀释的双标记鬼笔环肽，对细胞进行标记。

用 1× PBS 每隔五分钟清洗表面五次。首先，在物镜上添加油，清洁样品腔盖玻片底部，并将样品放置在载物台上。聚焦到一个细胞，并启用完美聚焦功能。

通过关闭并居中落射照明孔径光阑来对RICM进行对准。将488纳米激光聚焦到房间天花板上的一个小光斑，并逐渐增大入射角直至超过临界角，同时以实时模式在相机上监测荧光信号。当入射角超过临界角时，可观察到背景荧光显著降低，并出现一个清晰的焦平面。

使用RICM的相机实时模式识别用于成像的细胞。依次采集肌动蛋白在488纳米激发下的RICM和TIRF图像、整合素张力在561纳米激发下的图像以及paxillin在647纳米激发下的图像。采用200毫秒的曝光时间顺序获取图像。

更换盖玻片，重新对焦并重复操作。将Cos-7细胞接种于该TGT表面，有或无EGF刺激，以研究EGFR在配体刺激下激活对整合素力学的影响。若整合素结合配体并施加超过探针总张力阈值的力，则DNA双链将分离，从而产生荧光。

任何未被机械力断裂的TGT探针将保持非荧光状态。细胞在TGT表面有或无EGF的情况下孵育60分钟，随后固定并进行免疫染色，以显示黏着斑的分布及细胞骨架的排列情况。在RICM图像中，与无刺激相比，EGF刺激显著增强了Cos-7细胞在56皮牛顿TGT表面上的铺展。

经 EGF 刺激后，细胞呈现更趋圆形的形态，代表 Cos-7 细胞的铺展与生长。在张力荧光图像中也可观察到，EGF 刺激下开放探针的荧光信号更强。与未刺激组相比，EGF 刺激下开放探针的总荧光强度（与开放探针数量成正比）显著升高。

始终注意盖玻片的方向，确保功能化表面朝上。分离三明治结构时动作要轻柔，避免划伤或损坏表面。在完成表面合成后，可检测调控细胞黏附或机械转导的胞质蛋白。

这有助于鉴定参与调控细胞质膜上细胞力学过程的下游信号分子。