Name: 用于量化生长因子介导的整合素力学和附着力的张力计系绳探头 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 了解利用TGT传感器平台研究EGFR与整合素相互作用的方法。该技术使用Cos-7细胞系和RICM、TIRF成像技术，可量化生长因子介导的细胞力学变化，为细胞黏附和铺展研究提供新见解。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者谨向 Mattheyses 实验室的成员致以感谢，感谢他们富有成效的讨论和宝贵意见。我们感谢 NSF CAREER 1832100 和 NIH R01GM131099 项目对 A.L.M. 的资助支持。

1. TGT 寡核苷酸的制备
注意：此处概述了寡核苷酸探针的合成细节。请注意，某些修饰和纯化步骤可外包进行定制合成。
<ol>
	<li>按照 Zhang 等人的方法，使用叠氮-NHS 连接剂活化环状[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(PEG-PEG)]肽的伯胺22 以1:1.5的比例（100:150 nmol）混合，最终体积为10 &#181;L 二甲基甲酰胺。加入 0.1 &#181;L 有机碱三乙胺，4 ℃孵育 12 小时&#176; C.</li>
	<li>使用0.1 M TEAA（溶剂A）和100%乙腈（溶剂B），在流速为1 mL/min、初始条件为10%溶剂B、梯度为0.5%/min的条件下，通过反相高效液相色谱法纯化产物。收集洗脱峰（在203 nm处有吸收），并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）验证。产物为cRGDfK-叠氮。</li>
	<li>为了生成TGT上链，将cRGDfK-叠氮和炔基-21-BHQ2寡核苷酸（TGT上链：5Hexynyl/GTGAAATACCGCACAGATGCG/3BHQ_2）以2:1的比例混合（&#8128;200 &#181;M：100 &#181;M）在 100 &#181;1×磷酸盐缓冲液（PBS）1 升，含 5 mM 抗坏血酸钠和 0.1 &#181;M 预形成的 Cu-THPTA。室温（RT）下反应至少 4 小时，或在 4 ℃ 过夜反应。 &#176;C.</li>
	<li>通过 P2 脱盐凝胶处理混合物，以去除过量染料、副产物、有机溶剂和未反应的试剂。用 650 μL 离心柱进行准备。 &#181;通过在18,000 x g下离心，收集预水化P2凝胶的L组分 g 离心1分钟。弃去流出液，加入反应混合物。再次以18,000 x g 1 分钟，收集流穿液。将反应混合物补至终体积 300 &#181;用超纯水定容至 L。 
	注意：使用水对 P2 凝胶预水化 6 小时。</li>
	<li>通过反相高效液相色谱法纯化脱盐后的反应混合物。用于此纯化的有机溶剂包括含0.1 M TEAA的H2O（溶剂A）和100%乙腈（溶剂B，或流动相）。
	<ol>
		<li>在注入混合物之前，用初始条件为10%溶剂B、梯度为1%/min的流动相平衡色谱柱。调节流速至1 mL/min。用500 μL进样环将反应混合物注入HPLC系统。 &#181;L注射针</li>
		<li>通过检测DNA在260 nm和BHQ2淬灭剂在560 nm处的峰值吸收来收集产物。将洗脱产物在真空离心浓缩仪中干燥过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用亲核取代反应将TGT底链与Cy3B-NHS酯偶联，具体方法见Ma等人的文献描述。25. 混合100 &#181;56 pN TGT 底链（5Biosg/TTTTTT/iUniAmM/CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT）的 M 值与 50 &#181;Cy3B-NHS酯预溶于10 &#181;L 的 DMSO 中。用 0.1 M 碳酸氢钠将该混合物的 pH 值调至 9，并将最终体积定容至 100 &#181;用 1× PBS 洗涤。在室温下孵育反应混合物过夜。</li>
	<li>使用P2凝胶过滤和反相高效液相色谱法依次纯化混合物，以分离未反应的试剂、盐类和有机溶剂（见步骤1.4和1.5）。</li>
	<li>使用分光光度计在260 nm处测定纯化后的寡核苷酸-染料偶联物的吸光度，以估算其浓度。</li>
	<li>通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF 质谱）对纯化产物进行表征。将过量的 3-羟基吡啶甲酸溶解于 TA50 溶剂（50:50 v/v 乙腈和含 0.1% 三氟乙酸的去离子水）中。2O) 以制备新鲜的MALDI基质。标记产物的理论分子量与实测分子量分别为：cRGDfK-1-BHQ2 — 8157.9（计算值），8160.1（实测值）；Cy3B标记的56 pN TGT — 10272.7（计算值），10295.8（实测值）。</li>
	<li>将上链和下链分别溶解于无核酸酶的水中，浓度为 30–50 &#181;M. 使用无DNase的移液器吸头以避免原液污染。4℃保存 &#176;C用于短期应用或-20 &#176;C 适用于长期应用。寡核苷酸的稳定性不受反复冻融循环的影响。</li>
</ol>
2. 表面准备
第1天：
<ol>
	<li>将25 mm的玻璃盖玻片（最多8片）放入聚四氟乙烯架中，将架放入含有40 mL无水乙醇的50 mL硼硅酸盐烧杯中。用石蜡膜覆盖烧杯以防止水分进入，并在室温下以35 kHz频率超声处理10–15分钟（图1A）。</li>
	<li>在50 mL烧杯中加入40 mL新配制的piranha溶液，该溶液由在耐热玻璃烧杯中按3:1比例混合浓硫酸和过氧化氢制得。用玻璃移液管搅拌，将盖玻片架转移至烧杯中，在通风橱内室温孵育30分钟以蚀刻盖玻片表面（图1B）。 
	注意：穿戴全套个人防护装备（包括实验服、手套和护目镜），并在化学通风橱中操作。将过氧化氢缓慢加入酸中，以防止溶液过热。</li>
	<li>蚀刻完成后，用镊子将盖玻片架转移至盛有超纯水的烧杯中。每15秒重复一次，共重复六次，以彻底中和残余酸液（图1C）。 
	注意：使用后的piranha溶液应留在化学通风橱中过夜，再倒入酸性废液容器中处理。</li>
	<li>目视检查盖玻片表面，确保其清洁、无图案或灰尘颗粒。若发现图案或灰尘，则需重复步骤2.1–2.4。 
	注意：通过将处理后的盖玻片垂直浸入水中并取出，测试其表面亲水性。处理后的盖玻片表面水膜均匀回缩形成杨氏环，而未处理的盖玻片则形成水斑。</li>
	<li>将盖玻片架转移至盛有无水乙醇的烧杯中，用无水乙醇洗涤两次，每次15秒，使表面与有机溶剂平衡。随后将盖玻片架放入含3% APTES的无水乙醇溶液中，在室温下孵育1小时以完成硅烷化处理（图1D）。用石蜡膜覆盖烧杯。 
	注意：APTES沉积参数可能因表面清洗方法、溶剂含水量、APTES浓度、孵育时间及退火温度的不同而有所变化。</li>
	<li>将架浸入盛有无水乙醇的洁净烧杯中，每次15秒，重复洗涤三次（图1E）。</li>
	<li>使用低压氮气（N2）吹干盖玻片。将盖玻片放入一个10 cm的聚苯乙烯培养皿中，皿内预先平铺一片石蜡膜。确保盖玻片干燥且彼此分离（图1F）。</li>
	<li>在石蜡膜上放置四片盖玻片，每片上加入100 µL浓度为2 mg/mL的NHS-生物素DMSO溶液。将另外四片盖玻片盖在上方，形成“三明治”结构（两片盖玻片相对放置，功能化溶液夹在中间），将培养皿在4 °C下孵育过夜（图1G）。 
	注意：在4 °C条件下，NHS试剂更稳定，有助于实现均匀的表面功能化。此外，三明治结构可节约试剂用量。避免加入过多溶液，以防泄漏导致盖玻片滑动。</li>
</ol>
第2天：
<ol start="9">
	<li>将培养皿从 4 °C 取出，分离夹心式盖玻片。将盖玻片按 图 2A 所示方向放置在支架上，使涂层表面相对。用 200 证明乙醇溶液清洗三次，每次 15 秒。用 N2 气体吹干，并将其放入内含石蜡膜的新培养皿中。 
	注意：按所示方式放置盖玻片有助于识别功能化表面。</li>
	<li>用 1 mL 的 1× PBS 溶液清洗盖玻片三次，使其重新平衡至水相环境。在每片盖玻片上加入 800 µL 含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的 1× PBS 溶液（w/v），室温孵育 30 分钟，以钝化表面并阻断后续功能化试剂的非特异性结合（图 2B）。</li>
	<li>孵育结束后，用 1 mL 的 1× PBS 清洗盖玻片三次。在每片盖玻片上加入 800 µL 含 1 µg/mL 链霉亲和素的 1× PBS 溶液，室温孵育 45–60 分钟，以实现盖玻片的功能化（图 2C）。 
	注意：可保留一片未加链霉亲和素的盖玻片用于验证钝化效率（可选）。加入 10 nM 生物素化分子，并在实验条件下成像。该表面荧光强度应接近相机的暗噪声水平。</li>
	<li>与步骤 2.11 同时进行，在 PCR 管中将 TGT 探针（上链：下链摩尔比为 1:1）以终浓度 50 nM 溶于 100 µL 的 1 M NaCl 溶液中，使用热循环仪进行退火。95 °C 解链 5 分钟，然后逐步降温至 25 °C 并维持 25 分钟以完成退火（图 2D）。避免 TGT 探针长时间暴露于光照下。</li>
	<li>链霉亲和素孵育结束后，用 1× PBS 清洗盖玻片三次。取四片盖玻片，每片加入 100 µL 预组装的 TGT 探针，并用剩余的 4 片盖玻片（功能化面朝向探针）形成夹心结构（共八个表面，需四管杂交完成的 TGT 探针）。用铝箔包裹，室温孵育 1 小时，使探针充分结合至表面（图 2E）。</li>
	<li>孵育结束后，分离夹心结构，用 1× PBS 清洗盖玻片三次。此时 TGT 表面已准备就绪，可用于成像。小心将盖玻片装入预先清洁的成像腔室，并加入 1× PBS 以保持表面湿润（图 2F）。 
	&#8203;注意：过度拧紧腔室会导致表面破裂。防止表面干燥。</li>
</ol>
3. 细胞准备与染色
<ol>
	<li>为研究表皮生长因子（EGF）刺激对Cos-7细胞力学特性、黏附及铺展的影响，使用0.05%胰蛋白酶-EDTA处理Cos-7细胞2分钟进行消化。用HBSS洗涤并以800 × g 离心5分钟以中和胰蛋白酶。重复中和步骤一次。</li>
	<li>将细胞以4 × 104 个/孔的密度接种于已组装的TGT表面，培养基为添加50 ng/mL EGF的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），或不含EGF的DMEM。将细胞置于37 °C、5% CO2 的细胞培养箱中孵育60分钟，使其充分铺展（图3A）。 
	注：为避免血清中生长因子的干扰，细胞在无血清DMEM中孵育。EGF用10 mM乙酸溶解配制成1 mg/mL的储存液，成像实验中使用浓度为50 ng/mL的DMEM溶液。</li>
	<li>孵育结束后，用1× PBS洗涤细胞三次，随后加入2 mL 4%多聚甲醛，在室温下固定12分钟（图3B）。 
	注：所有孵育步骤均在约35 rpm的旋转摇床上进行，以确保溶液均匀分布。TGT表面需避光覆盖，直至成像前。</li>
	<li>吸除固定液，于室温下用1× PBS洗涤盖玻片五次，每次间隔5分钟。可选步骤：将盖玻片置于含50 mM NH4Cl的1× PBS中，37 °C孵育30分钟以淬灭多聚甲醛引起的自发荧光，随后用1× PBS洗涤三次，每次间隔5分钟（图3B）。</li>
	<li>加入缓冲液A（1× PBS、5%正常马血清、5%正常山羊血清、1% BSA、0.025% Triton X-100），37 °C孵育30分钟，用于封闭并通透细胞。随后用1× PBS洗涤三次，每次间隔5分钟（图3B）。</li>
	<li>将带有盖玻片的成像腔室置于湿盒中。将一抗（抗paxillin抗体，作为黏着斑标记物）按1:250比例溶于封闭缓冲液（1× PBS、5%正常马血清、5%正常山羊血清、1% BSA、0.005% Triton X-100）中。每张盖玻片加入200 μL一抗溶液，37 °C孵育2小时（图3B）。 
	注：避免表面干燥。</li>
	<li>用1× PBS洗涤盖玻片五次，每次间隔5分钟，然后放回湿盒中。每张盖玻片加入200 μL封闭缓冲液，其中含按1:800稀释的荧光标记山羊抗兔二抗和按1:400稀释的荧光标记鬼笔环肽（标记肌动蛋白），同时对细胞进行染色。37 °C孵育60分钟（图3B）。</li>
	<li>用1× PBS洗涤表面五次，每次间隔5分钟，随后于4 °C保存，待成像时取出（图3B）。 
	注：建议在表面制备后3天内完成样品成像，以避免信号衰减。</li>
</ol>
4. 图像采集
<ol>
	<li>使用倒置显微镜上的60倍油浸物镜（高数值孔径，1.49），配备488、561和647 nm TIRF激发光、RICM激发光、完美聚焦系统以及数字相机。
	<ol>
		<li>在物镜上添加镜油，清洁样品腔盖玻片底部，并将样品放置于载物台上。对焦至一个细胞，并启用完美聚焦功能。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将显微镜切换至RICM成像模式，使用落射荧光激发和GFP滤光立方体，但移除发射滤光片。通过关闭并居中落射照明孔径光阑来校准RICM。</li>
	<li>将显微镜切换至TIRF模式，使用激光激发和四通道TIRF滤光立方体。将488 nm激光聚焦到房间天花板上形成一个小光斑，并逐渐增大入射角直至超过临界角，同时在实时模式下监测相机上的荧光信号。当超过临界角时，可观察到背景荧光显著降低，并仅保留一个清晰的焦平面。 
	注意：TIRF可激发紧邻样品与盖玻片界面的极薄区域（约100 nm），从而突出显示开放的TGT探针和局灶性黏附结构，同时消除细胞内部的离焦荧光。若无TIRF条件，可使用落射荧光成像；但信噪比将较低。</li>
	<li>使用相机的“实时”模式结合RICM观察，选择用于成像的细胞。</li>
	<li>依次采集RICM图像以及肌动蛋白（640 nm激发）、整合素张力（561 nm激发）和paxillin（488 nm激发）的TIRF图像，曝光时间设为200 ms。 
	注意：曝光时间取决于多种因素，包括物镜、激光功率、发射滤光片和相机灵敏度。信号强度应至少为背景的2倍。背景约为1000 AU，因此信号应至少达到2000–3000 AU。</li>
	<li>对至少30个细胞重复步骤4.4–4.5。更换盖玻片，重新对焦，并重复步骤4.4–4.5。</li>
</ol>
5. 数据分析
注意：使用 Fiji 软件进行定量图像分析，并使用统计学软件进行数据分析。
<ol>
	<li>打开一个细胞的图像集。</li>
	<li>在 RICM 图像中使用 ImageJ 的徒手选择工具勾勒细胞边界，创建细胞区域的掩膜（RICM 掩膜）。将该区域保存至 ROI 管理器（分析 &#62; 工具 &#62; ROI 管理器）（图 4A1,2）。</li>
	<li>在整合素张力图像中选取细胞外的一个代表性区域，绘制至少 200 × 200 像素的 ROI。确保 ROI 内不包含其他细胞或荧光碎片。使用测量工具（分析 &#62; 测量）测定该 ROI 内的背景荧光强度（图 4A3）。</li>
	<li>从张力图像中减去步骤 5.2 获得的平均背景荧光值（处理 &#62; 数学 &#62; 减去）（图 4A4）。</li>
	<li>使用步骤 5.2 建立的 RICM 掩膜，定义细胞贴附区域内的张力信号（ROI 管理器 &#62; 选择 &#62; 应用掩膜 &#62; 编辑 &#62; 清除外侧）（图 4A5）。</li>
	<li>对张力图像使用 Huang 自动阈值法创建阈值掩膜（图像 &#62; 调整 &#62; 阈值）（图 4A6）。确保阈值掩膜能最佳地反映整合素张力产生的区域。作为经验法则，将阈值设定为平均背景荧光强度的 2 倍。</li>
	<li>基于阈值化后的张力掩膜创建选区（编辑 &#62; 选区 &#62; 创建）（图 4A7）。</li>
	<li>将选定的掩膜转移至步骤 5.4 生成的张力图像上，并测量开放探针的积分荧光强度（ROI 管理器 &#62; 选择 （张力掩膜）&#62; 分析 &#62; 测量 &#62; RawIntDen）（图 4C）。</li>
	<li>从 RICM 掩膜中测量细胞的形态计量学参数，包括面积、圆度和长宽比（ROI 管理器 &#62; 选择 （RICM 掩膜）&#62; 应用掩膜 &#62; 分析 &#62; 测量）（图 4B）。</li>
	<li>测量机械断裂密度，定义为探针发生断裂的细胞贴附区域所占百分比：选择张力掩膜图像并应用 RICM 掩膜（ROI 管理器 &#62; 选择 （RICM 掩膜）&#62; 分析 &#62; 测量 &#62; %Area）（图 4C）。</li>
	<li>导出测量数据，用于后续的统计分析和可视化。</li>
	<li>对每个细胞重复步骤 5.1–5.11。</li>
</ol>

<ol><li>Lim, C. -G., Jang, J., Kim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+machinery+for+sensing+mechanical+force%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular machinery for sensing mechanical force.</a> BMB Reports. 51 (12), 623-629 (2018).</li>
<li>Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28Micro%29managing+the+mechanical+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">(Micro)managing the mechanical microenvironment.</a> Integrative Biology. 3 (10), 959-971 (2011).</li>
<li>Vogel, V., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+forces+matter+in+health+and+disease.+From+Cancer+to+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Mechanical forces matter in health and disease. From Cancer to Tissue Engineering.</a> Nanotechnology. , 233-303 (2010).</li>
<li>Wang, J. H. C., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+rules+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Sports+Science%2C+Medicine+and+Rehabilitation%22%5BJournal%5D)">Mechanics rules cell biology.</a> BMC Sports Science, Medicine and Rehabilitation. 2 (1), 16(2010).</li>
<li>Moeendarbary, E., Harris, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+principles%2C+practices%2C+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Systems+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: principles, practices, and prospects.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).</li>
<li>Streuli, C. H., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+co-operation+between+integrins+and+other+receptor+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Signal co-operation between integrins and other receptor systems.</a> Biochemical Journal. 418 (3), 491-506 (2009).</li>
<li>Chiasson-MacKenzie, C., McClatchey, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR-induced+cytoskeletal+changes+drive+complex+cell+behaviors%3A+The+tip+of+the+iceberg%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">EGFR-induced cytoskeletal changes drive complex cell behaviors: The tip of the iceberg.</a> Science Signaling. 11 (515), (2018).</li>
<li>Kechagia, J. Z., Ivaska, J., Roca-Cusachs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+as+biomechanical+sensors+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrins as biomechanical sensors of the microenvironment.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 457-473 (2019).</li>
<li>De Luca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+EGFR+signaling+in+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The role of the EGFR signaling in tumor microenvironment.</a> Journal of Cellular Physiology. 214 (3), 559-567 (2008).</li>
<li>Javadi, S., Zhiani, M., Mousavi, M. A., Fathi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+Epidermal+Growth+Factor+Receptors+%28EGFR%29+and+integrins+in+resistance+to+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitors+%28TKIs%29+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between Epidermal Growth Factor Receptors (EGFR) and integrins in resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in solid tumors.</a> European Journal of Cell Biology. 99 (4), 151083(2020).</li>
<li>Eliceiri, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+and+growth+factor+receptor+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Integrin and growth factor receptor crosstalk.</a> Circulation Research. 89 (12), 1104-1110 (2001).</li>
<li>Dan, L., Jian, D., Na, L., Xiaozhong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+EGFR+and+integrin+affects+invasion+and+proliferation+of+gastric+cancer+cell+line%2C+SGC7901%5BTitle%5D)+AND+%22OncoTargets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between EGFR and integrin affects invasion and proliferation of gastric cancer cell line, SGC7901.</a> OncoTargets and Therapy. 5, 271-277 (2012).</li>
<li>Giancotti, F. G., Tarone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+control+of+cell+fate+through+joint+integrin%2Freceptor+protein+kinase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews%3A+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Positional control of cell fate through joint integrin/receptor protein kinase signaling.</a> Annual Reviews: Cell and Developmental Biology. 19, 173-206 (2003).</li>
<li>Ricono, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+cross-talk+between+epidermal+growth+factor+receptor+and+integrin+alphavbeta5+promotes+carcinoma+cell+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Specific cross-talk between epidermal growth factor receptor and integrin alphavbeta5 promotes carcinoma cell invasion and metastasis.</a> Cancer Research. 69 (4), 1383-1391 (2009).</li>
<li>Polacheck, W. J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cell-generated+forces%3A+a+guide+to+the+available+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring cell-generated forces: a guide to the available tools.</a> Nature Methods. 13 (5), 415-423 (2016).</li>
<li>Hang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosensors+for+single+cell+mechanical+interrogation%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Nanosensors for single cell mechanical interrogation.</a> Biosensors and Bioelectronics. 179, 113086(2021).</li>
<li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li>
<li>Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+traction+forces+by+micropillar+arrays%3A+contribution+of+substrate+warping+to+pillar+deflection%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Probing cellular traction forces by micropillar arrays: contribution of substrate warping to pillar deflection.</a> Nano Letters. 10 (5), 1823-1830 (2010).</li>
<li>Ma, V. P. -Y., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Nanotechnology+as+an+Emerging+Tool+to+Study+Mechanotransduction+in+Living+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">DNA Nanotechnology as an Emerging Tool to Study Mechanotransduction in Living Systems.</a> Small. 15 (26), 1900961(2019).</li>
<li>Kim, Y., Kim, K. A., Kim, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+DNA+force+sensors+to+study+the+molecular+level+forces+required+to+activate+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Korean+Physical+Society%22%5BJournal%5D)">Double-stranded DNA force sensors to study the molecular level forces required to activate signaling pathways.</a> Journal of the Korean Physical Society. 78 (5), 386-392 (2021).</li>
<li>Rao, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+activation+attenuates+the+mechanical+threshold+for+integrin+tension+and+focal+adhesion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">EGFR activation attenuates the mechanical threshold for integrin tension and focal adhesion formation.</a> Journal of Cell Sciences. 133 (13), (2020).</li>
<li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167(2014).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+integrins+exhibit+anisotropic+mechanosensing+and+harness+piconewton+forces+to+mediate+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (2), 325-330 (2018).</li>
<li>Ma, V. P. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+induced+catalytic+amplification+reaction+for+readout+of+receptor-mediated+cellular+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Mechanically induced catalytic amplification reaction for readout of receptor-mediated cellular forces.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5488-5492 (2016).</li>
<li>Wang, X., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+single+molecular+forces+required+to+activate+integrin+and+notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining single molecular forces required to activate integrin and notch signaling.</a> Science. 340 (6135), 991-994 (2013).</li>
<li>Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+regulated+conformational+change+of+integrin+%CE%B1V%CE%B23%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Force regulated conformational change of integrin αVβ3.</a> Matrix Biology. 60-61, 70-85 (2017).</li>
<li>Kantlehner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+coating+with+cyclic+RGD+peptides+stimulates+osteoblast+adhesion+and+proliferation+as+well+as+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Surface coating with cyclic RGD peptides stimulates osteoblast adhesion and proliferation as well as bone formation.</a> ChemBioChem. 1 (2), 107-114 (2000).</li>
<li>Kapp, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+evaluation+of+the+activity+and+selectivity+profile+of+ligands+for+RGD-binding+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A comprehensive evaluation of the activity and selectivity profile of ligands for RGD-binding integrins.</a> Scientific Reports. 7, 39805(2017).</li>
<li>Kok, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+functional+evaluation+of+RGD-modified+proteins+as+alpha%28v%29beta%283%29+integrin+directed+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Preparation and functional evaluation of RGD-modified proteins as alpha(v)beta(3) integrin directed therapeutics.</a> Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 128-135 (2002).</li>
<li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502(2017).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-activatable+biosensor+enables+single+platelet+force+mapping+directly+by+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).</li>
<li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li>
<li>Yasunaga, A., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+molecular+tension-classifications%2C+interpretations+and+limitations+of+force+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001(2019).</li>
<li>Luca, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-Jagged+complex+structure+implicates+a+catch+bond+in+tuning+ligand+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Notch-Jagged complex structure implicates a catch bond in tuning ligand sensitivity.</a> Science. 355 (6331), 1320-1324 (2017).</li>
<li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+antigen+extraction+is+regulated+by+physical+properties+of+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).</li>
<li>Brockman, J. M., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+proofreading%3A+a+general+mechanism+to+enhance+the+fidelity+of+information+transfer+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Mechanical proofreading: a general mechanism to enhance the fidelity of information transfer between cells.</a> Frontiers in Physics. 7, 14(2019).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

通过上述详细的逐步操作流程，可制备TGT表面，用于量化经EGF处理后贴壁细胞在黏附和铺展过程中产生的细胞形态变化及整合素张力。该探针设计简洁，合成与表面制备过程简便，实验装置简单，为研究EGFR与整合素之间的相互作用提供了稳定的平台。总体结果表明，配体依赖性激活的EGFR可增强细胞铺展，调节整合素受体的承力特性，并促进黏着斑的组装与成熟。利用TGT探针获得的结果支持了总体假设：生长因子（如EGFR）可作为“机械组织者”，增加整合素张力的强度及其空间分布的有序性，并调控黏着斑的取向与力学特性。
当细胞施加于TGT表面时，其会着陆、附着并铺展，此时整合素（αVβ3）受体感知并结合cRGDfK配体。在此过程中，TGT探针可能因机械断裂而在配体结合位点产生荧光信号。该信号读出的是细胞与表面相互作用过程中的累积&#34;受力历史&#34;。在这些实验中，TGT表面可能出现一些常见问题，例如表面背景荧光过高（图6A、B）、表面呈现斑驳外观、细胞未能产生张力信号（图6C、D）以及细胞未能铺展（图6E、F），这些问题可能源于TGT探针或表面合成过程中的技术缺陷。针对这些常见问题的解决方案见表1。
TGT探针的简单设计为细胞生物学家提供了一种强大工具，可在仅提供特定配体和刺激的情况下，独立研究特定生长因子-整合素信号转导的结果，而不受其他细胞表面受体的干扰。此外，TGT探针能够在细胞黏附过程中以皮牛顿（pN）级别的灵敏度，检测单个整合素受体所涉及的张力阈值。其他方法无法在固定样本中以高空间分辨率报告单个受体施加的力31。牵引力显微镜仅对纳牛顿（nN）级别的力敏感，比单个整合素受体施加的力高出一个数量级15；而分子张力探针虽可测量皮牛顿级别的力，但由于其可逆性，无法在固定过程中保持稳定。基于这些原因，TGT探针成为研究生长因子-整合素相互作用力学特性的理想工具。
在设计实验之前，应考虑与TGT探针相关的若干技术细节。张力图像代表的是某一时间点的快照，反映的是受体-配体相互作用的力历史，而非在任意特定时刻受体-配体结合状态的指示。由于信号的产生依赖于探针的分离，TGT荧光来源于未处于受体-配体相互作用主动张力下的开放探针。这意味着在TGT表面获得的整合素张力读数具有历史性和累积性，仅反映曾经存在超过Ttol的力的位置；而当前受体-配体作用力低于Ttol的位置则不会被报告19,32。由于TGT断裂会导致受体-配体相互作用的终止，因此细胞铺展是由所受力低于Ttol的整合素-配体相互作用所介导的。因此，用户在定义接种后的时间点以评估基于整合素黏附的力学结果时必须谨慎。最后，必须理解Ttol的含义。本研究所采用的TGT探针的Ttol为56 pN，其中Ttol是指在持续施加2秒时能够使50%探针断裂的恒定力值。在复杂的生物系统中，TGT探针可能经历具有不同时间依赖性的异质且多样的力梯度。若TGT探针受到高于Ttol的力而断裂，则荧光信号将低估总张力。相反，低于Ttol的力若作用时间更长，也可能导致与高强度短时作用力相似数量的探针断裂。上述两种情况可能产生相同的荧光强度读数，使得利用TGT探针难以分辨确切的张力大小或动态变化33,34。
总体而言，在进行生长因子刺激下整合素张力的评估时，应谨慎设计实验，设置内部对照，比较细胞在其他基质包被表面的铺展特征，平行检测有无生长因子刺激条件下细胞中TGT荧光信号的变化，并使用具有不同Ttol的TGT探针。TGT技术可实现对生长因子信号通路在调控整合素受体力学特性、黏着斑动态行为及细胞铺展过程中作用的定量分析。本实验方案可作为多种基于TGT探针的研究工作的模板，适用于不同Ttol、不同配体、不同细胞类型或不同刺激条件的实验体系。固定后可对任何感兴趣的蛋白质进行标记，并可采用任意类型的定量图像分析方法。因此，本文提供了一个适用于多种TGT实验的通用模板。
TGT探针的应用不仅限于整合素的研究，通过更换配体，还可扩展至不同类型细胞的多种细胞膜受体。TGT探针已被用于研究力学在调控各种受体信号通路中的作用，包括揭示Notch受体力学在胚胎发育和神经发生中的机械作用35，B细胞受体识别和内化抗原过程中介导的力学作用36，以及T细胞表面受体通过检测力学变化实现机械校对的能力，从而增强信号传递的强度与特异性37。这些研究结果共同凸显了TGT探针在多种实验条件下的巨大应用潜力。

细胞具有感知、产生和响应机械力的内在能力，从而导致细胞表型的改变以及局部微环境的重塑1,2。机械力在调控细胞行为的诸多方面发挥着关键作用，包括黏附、迁移、增殖、分化以及伤口愈合3,4。细胞与微环境之间双向力学交换的异常可导致疾病状态，包括癌症5。多种膜受体参与维持细胞-基质稳态，其中整合素（integrins）与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）之间存在显著的协同作用6,7。传统上，整合素建立微环境与细胞内细胞骨架之间的力学连接，而EGFR则调控细胞生长、增殖和存活8,9。EGFR是一个被广泛研究的治疗靶点，其研究重点在于介导胞外到胞内的信号转导。EGFR与整合素之间的相互作用已在遗传学和生物化学层面被证实，可调控包括癌症在内的多种疾病的进展10,11。尽管研究提示EGFR与整合素之间存在相互作用，但这些效应通常归因于远离质膜的信号通路7,12,13,14。由于缺乏用于测量细胞力学和信号输出的工具，EGFR或其他生长因子对细胞力学的影响在很大程度上仍未被探索。当前的挑战在于识别合适的工具，以研究这两种并行信号模式之间的通讯，并量化它们对细胞力学的特定贡献。
已开发出多种方法用于测量细胞黏附受体产生的力，读者可参考有关这些技术的深入综述15,16简而言之，牵引力显微镜和微柱阵列检测依赖于基底材料的形变来推断纳牛顿（nN）级的力，该力级比单个受体所受的力高一个数量级。17,18单分子技术（包括原子力显微镜和光镊）能够检测单个蛋白质的皮牛顿（pN）级力，但每次仅能测量一个受体，且空间分辨率较差（或无空间分辨率）。基于DNA的分子张力探针和张力阈值拴系（TGT）探针则可在衍射极限（或更高）的空间分辨率下实现pN级力的检测，因而在单细胞力学研究中具有独特作用。19,20 来自多种细胞类型，包括成纤维细胞、癌细胞、血小板和免疫细胞21,22,23,24. 尽管分子张力探针具有可延伸性 &#34;弹簧&#34; 元素，适用于实时成像，TGT&#160;探针不可逆地破裂，留下荧光标记 &#34;受力历史&#34;TGT 还可调节其下方基底的张力阈值；一系列具有相似化学组成但断裂力或张力耐受性（Ttol)，可用于量化黏着斑形成和细胞铺展所需的最小张力。TGT探针由两条互补的DNA链组成，其中一条固定在表面，另一条向细胞呈现配体。当受体结合该配体并施加的力超过Ttol 探针的链将被分开。Ttol 定义为在理想条件下，2秒内使50%的探针断裂所需的恒定力。在 &#34;开启&#34; TGT探针中，上链的淬灭剂可与下链的荧光团分离。只有在TGT探针发生断裂的位置（推测是由于受到大于或等于T的力所致），才会出现这种分离现象tol，将产生荧光信号。TGT探针还可被固定，便于对生物系统进行操作以及多种条件的测试。因此，本研究采用了TGT探针。
采用TGT探针研究了活化的EGFR如何调节整合素依赖性细胞黏附和机械力21。该研究确立了EGFR作为一种“机械组织者”的作用，可调控黏着斑的组装及张力生成。此外，研究发现EGF刺激影响了黏着斑的分布与成熟度，并促进细胞铺展。该方法可用于未来研究生长因子如何影响肿瘤进展和动态过程中的机械力。尽管EGFR与整合素串扰在调控上皮-间质转化中的作用已较为明确，但机械力在该过程中的作用仍缺乏深入研究10。
本文详细介绍了这些实验的操作流程，涵盖56 pN TGT探针的合成与组装、在玻璃盖玻片上构建TGT表面、将Cos-7细胞接种于TGT表面并用EGF刺激、细胞固定、鬼笔环肽染色以及抗paxillin抗体染色、高分辨率全内反射荧光（TIRF）显微镜和反射干涉对比显微镜（RICM）成像，以及图像定量分析。尽管本实验方案旨在研究EGF对Cos-7细胞的刺激作用，但其可轻松适用于多种基于TGT的实验。通过替换不同的配体、Ttol、细胞类型、刺激参数、固定后标记的蛋白质以及定量分析方法，该方案具有高度的灵活性和广泛的应用价值。

<table><tbody><tr><td>(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷</td><td>Millipore Sigma</td><td>440140</td><td>表面制备</td></tr><tr><td>3-羟基吡啶甲酸（3-HPA）</td><td>Millipore Sigma</td><td>56197</td><td>MALDI-TOF-MS 基质</td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38S</td><td>EGF 稀释</td></tr><tr><td>乙腈（HPLC 级）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998SK</td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 鬼笔环肽</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8878S</td><td>免疫细胞化学</td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Fisher Scientific</td><td>A687</td><td>免疫细胞化学</td></tr><tr><td>抗 Paxillin 抗体 [Y113]</td><td>Abcam</td><td>ab32084</td><td>免疫细胞化学</td></tr><tr><td>BD 带鲁尔锁扣的注射器</td><td>BD bioscience</td><td>309657</td><td>表面制备</td></tr><tr><td>Bio-Gel P-2</td><td>Bio-Rad</td><td>1504118</td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>无蛋白酶牛血清白蛋白（BSA）粉末</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9703100</td><td>表面制备</td></tr><tr><td>Cos-7 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td>细胞培养，传代次数 11–20</td></tr><tr><td>8 片盖玻片用小型支架</td><td>Fisher Scientific</td><td>C14784</td><td>表面制备</td></tr><tr><td>c(RGDfK(PEG-PEG))，其中 PEG = 8-氨基-3,6-二氧代辛酸</td><td>Vivitide</td><td>PCI-3696-PI</td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>Cy3B NHS 酯</td><td>GE Healthcare</td><td>PA63101</td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺</td><td>Millipore Sigma</td><td>PHR1553</td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>含 L-谷氨酰胺、4.5 g/L 葡萄糖和丙酮酸钠的 DMEM 培养基</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10013C</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>人表皮生长因子（EGF）</td><td>Millipore Sigma</td><td>E9644</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>乙醇，200 证明（100%）</td><td>Fisher Scientific</td><td>22032601</td><td>表面制备</td></tr><tr><td>Falcon 标准组织培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772E</td><td>表面制备</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-438-026</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>Flurobrite DMEM 培养基</td><td>Fisher Scientific</td><td>A1896701</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647 标记</td><td>Invitrogen</td><td>A-21244</td><td>免疫细胞化学</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-210-064</td><td>免疫细胞化学</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-170-161</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Fisher Scientific</td><td>16050130</td><td>免疫细胞化学</td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-500</td><td>表面制备</td></tr><tr><td>Nanosep MF 离心过滤装置</td><td>Pall laboratory</td><td>ODM02C35</td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>NHS-叠氮化物</td><td>Fisher Scientific</td><td>88902</td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>氮气钢瓶</td><td>Airgas</td><td></td><td>表面制备</td></tr><tr><td>2 号圆形玻璃盖玻片，直径 25 mm</td><td>VWR</td><td>48382-085</td><td>表面制备</td></tr><tr><td>Parafilm M 实验室封口膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td>表面制备</td></tr><tr><td>16% 戊二醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-980-487</td><td>免疫细胞化学</td></tr><tr><td>PBS，1×</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-030-CV</td><td>表面制备/免疫细胞化学</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（5,000 U/mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-070-063</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>PYREX 低型 Griffin 烧杯</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540G</td><td>表面制备</td></tr><tr><td>抗坏血酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-606-310</td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td>表面制备</td></tr><tr><td>链霉亲和素</td><td>Fisher Scientific</td><td>434301</td><td>表面制备</td></tr><tr><td>磺基-NHS-LC-生物素</td><td>Fisher Scientific</td><td>21335</td><td>表面制备</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A300-500</td><td>表面制备</td></tr><tr><td>TEAA</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0322726</td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>三乙胺</td><td>Millipore Sigma</td><td>471283</td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>三氟乙酸（TFA）</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI28901</td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>THPTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1296293</td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>曲拉通 X-100 去垢剂表面活性剂溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>85111</td><td>免疫细胞化学</td></tr><tr><td>DNA 级水，无 DNase 和蛋白酶</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24701</td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent AdvanceBio 寡核苷酸 C18 柱，4.6 × 150 mm，2.7 &amp;mu;m</td><td>Agilent</td><td>653950-702</td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>高效液相色谱仪</td><td>Agilent</td><td>1100</td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>低速轨道摇床</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-320-813</td><td>免疫细胞化学</td></tr><tr><td>基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）</td><td>Voyager STR</td><td></td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>Molecular Probes Attofluor 细胞培养腔室</td><td>Fisher Scientific</td><td>A7816</td><td>表面制备</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 紫外-可见分光光度计</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti 倒置显微镜</td><td>pe Nikon</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>Nikon 完美对焦系统</td><td>Nikon</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>NIS Elements 软件</td><td>Nikon</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 V3 数字 CMOS 相机</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>四通道 TIRF 405/488/561/647 滤光片组</td><td>CHROMA</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>RICM 滤光片组</td><td>CHROMA</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>SOLA v-nIR 光源引擎</td><td>Lumencor</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>Thermo Forma Steri Cycle 370 CO2 培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>VWR 75D 超声波清洗器</td><td>VWR</td><td>13710</td><td>表面制备</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;数据分析&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;用途&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Fiji（Image J）</td><td></td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td>定量分析</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>Graph Pad</td><td></td><td>统计分析</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;寡核苷酸名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;5'修饰/3'修饰&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;序列（5' 至 3'）&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;用途&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Alkyne-21-BHQ2</td><td>5' 己炔基/3' BHQ_2</td><td>GTGAAATACCGCACAGATGCG</td><td>上链 TGT 探针</td></tr><tr><td>56 pN TGT</td><td>5' Biosg/TTTTTT/iUniAmM</td><td>CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT</td><td>下链 TGT 探针</td></tr><tr><td>12 pN TGT</td><td>5' AmMC6/3' BioTEG</td><td>CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT</td><td>下链 TGT 探针</td></tr></tbody></table>

用于量化生长因子介导的整合素力学与黏附的张力测量锚定探针

Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion

多细胞生物依赖细胞膜受体与其周围细胞外基质（ECM）中对应配体的相互作用，以协调多种功能，包括黏附、增殖、迁移和分化。机械力可从细胞传递 通过 细胞黏附受体整合素与细胞外基质（ECM）中配体的相互作用。这些由细胞产生的力学力的大小和空间分布可受到生长因子受体的调控，包括表皮生长因子受体（EGFR）。目前可用的工具可用于量化由信号串扰介导的细胞力学特性变化，并将其与&#160;黏着斑、细胞形态及信号转导的研究受限。基于DNA的分子力传感器，即张力阈值拴系物（tension gauge tethers, TGTs），已被用于量化这些变化。TGT探针的独特之处在于能够调控其内在的力阈值，并在衍射极限的空间分辨率下，报告整个贴壁细胞表面皮牛顿量级的受体受力情况。本文所使用的TGT探针依赖于受体-配体作用力导致DNA双链发生不可逆解离，从而产生荧光信号，由此可量化细胞整合素张力的累积值（即受力历史）。本文介绍了一种利用TGT研究表皮生长因子受体（EGFR）对整合素力学特性及黏附形成影响的实验方案。该探针的组装&#160;TGT机械传感平台被系统地详细阐述，并概述了成像力、黏着斑及细胞铺展的实验流程。总体而言，该平台可通过调节探针的内在力阈值、黏附配体以及所用刺激因子的类型和浓度，成为研究多种膜受体在调控整联蛋白介导的力学作用中相互关系的可靠工具。

开启型TGT探针被用于研究配体激活的表皮生长因子受体（EGFR）对Cos-7细胞中整合素介导的细胞力学及黏附形成的影响21探针呈递配体环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸（cRGDfK）21,23,25,26，该物质对整合素异源二聚体具有选择性 &#945;V&#946;3 仅具有微弱的亲和力 &#945;5&#946;1 整合素27,28,29,30TGT探针由固定在玻璃盖玻片表面的双链DNA构成 通过 利用生物素-链霉亲和素结合固定底部链。顶部链展示整合素配体，并可与细胞膜上的相应整合素受体结合（图5A）。下链标记有荧光染料，上链标记有淬灭剂，当双链TGT完整时，背景荧光极低。如果整合素结合配体并施加的力大于Ttol 探针的DNA双链会解离，从而产生荧光（图 5A）。任何未受到机械力作用而破裂的TGT探针将保持非荧光状态。这种力选择性开启的荧光特性，能够以衍射极限分辨率对整合素产生的皮牛顿（pN）级作用力进行系统性与定量的图谱绘制。此外，TGT探针还可调节基底的张力阈值。
图中展示了一个具有 56 pN Ttol 的 TGT 表面的代表性示例。将 Cos-7 细胞接种于该 TGT 表面，有或无 EGF 刺激，以研究配体刺激下 EGFR 激活对细胞黏附和整合素力学的影响（图 5A、B）。细胞在 TGT 表面上有或无 EGF 孵育 60 分钟，随后固定并进行免疫荧光染色，以显示黏着斑分布（paxillin）和细胞骨架组织（F-actin）（图 5B）。然后使用反射干涉显微镜（RICM）和全内反射荧光显微镜（TIRF）对细胞成像。RICM 图像中可明显看出，在 56 pN TGT 表面上，经 EGF 刺激后 Cos-7 细胞的铺展显著增强，相较于未刺激组。通过测量 RICM 图像中细胞-基底接触区域的大小，对每种条件下 50 个细胞进行了量化分析（图 5C）。经 EGF 刺激后，细胞呈现更趋圆形的形态，代表了 Cos-7 细胞在其自然生理环境中铺展和生长的典型特征（图 5D）。如张力荧光图像所示，EGF 刺激下的开放探针荧光信号也更强。开放探针的积分强度（与开放探针数量成正比）在 EGF 刺激条件下明显高于未刺激条件（图 5B、E）。这代表了所有整合素施加的力超过 Ttol（56 pN）的受体-配体结合事件。
使用paxillin染色显示，焦点黏附的分布、数量、成熟度（大小）和组织结构也受到EGF刺激的影响。与未添加EGF的对照组相比，经EGF刺激的细胞中焦点黏附显得更为成熟，并呈放射状排列。通过鬼笔环肽染色评估发现，EGF刺激 также增强了F-肌动蛋白细胞骨架的组织结构（图5B）。这些定性评估是通过对两组处理的图像进行视觉比较得出的。虽然可以进行焦点黏附的定量分析，但这超出了本实验方案的范围。在本实验中，TGT表面为系统阐述EGFR激活对细胞铺展、整合素力学以及焦点黏附形成的影响提供了平台。
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig01.jpg" /> 
图 1：TGT 表面制备第 1 天的示意图。 （A）清洗盖玻片。（B）刻蚀盖玻片表面。（C）中和 Piranha 溶液。（D）对表面进行硅烷化处理以引入反应性氨基。（E）将盖玻片平衡至有机相。（F）用惰性气体干燥盖玻片。（G）使表面的氨基生物素化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig02.jpg" /> 
图2：TGT表面制备第二天的示意图。 （A）清洗并干燥盖玻片，以去除前一天残留的生物素。（B）用BSA封闭，防止后续步骤中试剂的非特异性结合。（C）用链霉亲和素对盖玻片进行功能化处理。（D）在热循环仪中杂交探针。（E）将合成的探针加到盖玻片上。（F）将盖玻片组装到细胞成像室中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig03.jpg" /> 
图3：整个实验设置中主要步骤的总体工作流程示意图。（A）在基础培养基（DMEM）中，有或无EGF刺激条件下，细胞从培养表面脱离并接种到TGT表面的过程。（B）细胞在TGT表面贴附和铺展后，进行固定和免疫染色的步骤流程图。（C）染色完成后，使用倒置荧光显微镜结合反射干涉对比显微技术（RICM）和全内反射荧光显微技术（TIRF）对细胞进行成像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig04.jpg" /> 
图 4：数据处理与定量分析示例。（A）在 Fiji（ImageJ）中用于 RICM 和张力图像定量分析的分析流程逐步分解示意图。（B）使用上述流程分析的细胞形态测量结果的代表性示例。（C）使用上述流程分析的细胞力学结果的代表性示例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig05.jpg" /> 
图 5：TGT 实验的示例数据。（A）示意图突出显示细胞膜与 TGT 表面界面处的接触区域。插图展示了整合素与其特异性配体 cRGDfK 的相互作用，在有（右）或无（左）EGF 刺激的情况下。（B）Cos-7 细胞在 56 pN TGT 表面上铺展的 RICM 和 TIRF 图像。图像为接种后 60 分钟在有或无 EGF 刺激条件下获得。分别展示了两种刺激条件下的 RICM（原始采集图像）、整合素张力（灰度）、paxillin（橙红色调）和 F-actin（蓝绿色）图像及其叠加图。比例尺：10 μm。插图放大显示一个感兴趣区域（ROI），详细展示由 paxillin 标记的黏附形成位点处产生的整合素张力，以及由肌动蛋白标记的下方亚细胞骨架结构的共定位情况。比例尺：5 μm。（C–D）Cos-7 细胞在有或无 EGF 刺激条件下的铺展面积（RICM 细胞印迹）（C）、圆度（D）和总张力（E）的散点图。柱状图表示均值 ± 标准差。组间差异通过 Student's t-检验进行统计学评估；****P &#60; 0.0001。数据来自三次独立实验，共分析 50 个细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig06.jpg" /> 
图6：具有不同潜在问题的TGT表面示例。（A）理想TGT表面的张力和反射干涉显微镜（RICM）图像，探针在细胞黏附前已组装并淬灭。（B）TGT探针缺少上链（淬灭剂）的TGT表面的张力和RICM图像。张力图像显示下链中开放荧光团的均匀荧光。（C）细胞在理想TGT表面上铺展的张力和RICM图像。（D）细胞在制备不良的TGT表面上铺展的张力和RICM图像，该表面存在钝化不充分或探针降解问题。（E）细胞接种在含cRGDfK配体的理想表面上的张力、RICM和明场图像，表明cRGDfK-整合素相互作用对细胞黏附和张力生成至关重要。（F）细胞接种在TGT表面无cRGDfK配体的表面上的张力、RICM和明场图像。尽管在明场图像中可见细胞，但未观察到细胞黏附或整合素张力的生成。比例尺：10 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

TGT 表面是一种用于研究生长因子与整合素串扰的创新平台。该平台采用灵活的探针设计、特异性的黏附配体以及对刺激条件的精确调控，可对 EGFR 与整合素之间的相互作用进行可靠的定量评估。研究结果表明，EGFR 作为一种“机械组织者”，能够调节整合素的力学特性，影响黏着斑的组装和细胞铺展。

多细胞生物依赖细胞膜受体与其周围细胞外基质（ECM）中对应配体之间的相互作用，以协调……

该方案的重要性在于采用了结构简单的TGT传感器平台，用于研究EGFR-整合素串扰及其对细胞力学力的影响。Rao提出该方案旨在探究表皮生长因子（EGF）依赖性的细胞力学调控机制。该方案可适用于不同的配体、细胞类型、刺激模式，并可与具有不同张力阈值的TGT传感器联用。表面合成最初可能看起来令人望而生畏。关键在于做好充分准备并有条不紊，通过使用试剂制备和计算的清单，精确执行复杂的步骤。在第一天，将最多八片25毫米的玻璃盖玻片放入聚四氟乙烯架中。将支架放入盛有40毫升纯乙醇的50毫升硼硅酸盐玻璃烧杯中，在室温下以35千赫的运行频率超声处理10至15分钟。取一个50毫升烧杯，加入40毫升新配制的piranha溶液，该溶液由浓硫酸与过氧化氢按3:1的比例在Pyrex烧杯中混合，并用玻璃移液管搅拌制得。将载玻片架转移至烧杯中，于通风橱内室温孵育30分钟，以蚀刻载玻片表面。蚀刻完成后，用镊子将载玻片架转移至盛有超纯水的烧杯中。目视检查载玻片，确保表面清洁，无任何图案或灰尘颗粒附着于玻璃表面。将盖玻片架转移至含有200度乙醇的烧杯中，清洗两次，每次15秒，以使表面与有机溶剂达到平衡。将盖玻片架转入含有3% APTES的200度乙醇溶液中，在室温下孵育1小时，以对盖玻片进行硅烷化处理。随后将架子浸入装有干净的200度乙醇溶液的烧杯中。使用低出口压力的氮气吹干盖玻片。将盖玻片放入一个内铺有平展石蜡膜的10厘米聚苯乙烯培养皿中。取四片置于石蜡膜上的盖玻片，每片上加入100 µL浓度为2 mg/mL的NHS-生物素DMSO溶液。将另外四片盖玻片叠放成三明治结构，其中两片盖玻片相对放置，中间夹有功能化溶液。第二天，将培养皿从4°C取出，分离叠放的盖玻片。分离三明治结构时，避免刮伤或损坏功能化表面。然后，将盖玻片在支架中放置，使涂层表面相对。用氮气吹干。将盖玻片放入一个新的培养皿中，培养皿内放置有封口膜。向每个盖玻片中加入 800 微升含 0.1% 牛血清白蛋白的 1× PBS 溶液。将盖玻片在室温下孵育 30 分钟，以钝化表面并阻断后续功能化试剂的非特异性结合。为功能化盖玻片，加入 800 微升浓度为每毫升 1 微克的链霉亲和素 PBS 缓冲液（1× PBS），在室温下孵育 45 至 60 分钟。使用PCR管和PCR仪组装TGT探针。孵育后，用1×PBS将盖玻片洗涤三次。向四片盖玻片上各加入100微升预组装的TGT探针，并将剩余四片功能化面向下的盖玻片覆盖其上，形成夹心结构。用铝箔覆盖。孵育结束后，将夹心结构分开，并用1×PBS洗涤盖玻片三次。小心地将盖玻片组装到预先清洁的成像腔室中。为了研究表皮生长因子刺激对Cos-7细胞力学特性、黏附及细胞铺展的影响，使用0.05%胰蛋白酶-EDTA处理Cos-7细胞，消化2分钟。用HBSS洗涤并以800 ×g离心5分钟以中和胰蛋白酶。将细胞以每孔40,000个细胞的密度接种于组装好的TGT表面，培养基为添加50纳克/毫升EGF的DMEM，或不含EGF的DMEM。孵育结束后，用1× PBS洗涤细胞三次。在室温下，用2毫升4%多聚甲醛固定12分钟。在室温下，用1× PBS每隔5分钟洗涤盖玻片一次，共洗涤五次。可选步骤：将盖玻片在含有50毫摩尔氯化铵的1×PBS中，37摄氏度孵育30分钟。加入缓冲液A，将带有盖玻片的成像腔室置于湿盒中，在37摄氏度孵育30分钟，以封闭并通透细胞。用封闭缓冲液按1:250稀释倍数稀释一抗paxillin抗体。每张盖玻片加入200 µL一抗溶液，37°C孵育2小时。同时，每张盖玻片使用200 µL封闭缓冲液，其中包含按1:800稀释的双标记山羊抗兔二抗和按1:400稀释的双标记鬼笔环肽，对细胞进行标记。用 1× PBS 每隔五分钟清洗表面五次。首先，在物镜上添加油，清洁样品腔盖玻片底部，并将样品放置在载物台上。聚焦到一个细胞，并启用完美聚焦功能。通过关闭并居中落射照明孔径光阑来对RICM进行对准。将488纳米激光聚焦到房间天花板上的一个小光斑，并逐渐增大入射角直至超过临界角，同时以实时模式在相机上监测荧光信号。当入射角超过临界角时，可观察到背景荧光显著降低，并出现一个清晰的焦平面。使用RICM的相机实时模式识别用于成像的细胞。依次采集肌动蛋白在488纳米激发下的RICM和TIRF图像、整合素张力在561纳米激发下的图像以及paxillin在647纳米激发下的图像。采用200毫秒的曝光时间顺序获取图像。更换盖玻片，重新对焦并重复操作。将Cos-7细胞接种于该TGT表面，有或无EGF刺激，以研究EGFR在配体刺激下激活对整合素力学的影响。若整合素结合配体并施加超过探针总张力阈值的力，则DNA双链将分离，从而产生荧光。任何未被机械力断裂的TGT探针将保持非荧光状态。细胞在TGT表面有或无EGF的情况下孵育60分钟，随后固定并进行免疫染色，以显示黏着斑的分布及细胞骨架的排列情况。在RICM图像中，与无刺激相比，EGF刺激显著增强了Cos-7细胞在56皮牛顿TGT表面上的铺展。经 EGF 刺激后，细胞呈现更趋圆形的形态，代表 Cos-7 细胞的铺展与生长。在张力荧光图像中也可观察到，EGF 刺激下开放探针的荧光信号更强。与未刺激组相比，EGF 刺激下开放探针的总荧光强度（与开放探针数量成正比）显著升高。始终注意盖玻片的方向，确保功能化表面朝上。分离三明治结构时动作要轻柔，避免划伤或损坏表面。在完成表面合成后，可检测调控细胞黏附或机械转导的胞质蛋白。这有助于鉴定参与调控细胞质膜上细胞力学过程的下游信号分子。

tension-gauge-tether-probes-for-quantifying-growth-factor-mediated

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

用于量化生长因子介导的整合素力学和附着力的张力计系绳探头

该视频展示了一种利用聚乙二醇锚定的金纳米颗粒和DNA发夹张力探针来评估免疫细胞施加的受体力的方法。CD8阳性T细胞的相互作用会触发探针的展开，从而发出荧光，而锁定链则维持信号，用于量化免疫细胞施加的力。...

利用基于DNA的张力探针评估免疫细胞施加的受体作用力

我们通过在轴突膜上附着的光镊探针同时进行力谱测量，检测了使用激光显微切割仪部分损伤的轴突中的张力释放。该实验方案用于评估轴突与培养基底之间的黏附性。...

利用激光诱导轴突损伤过程中张力释放的测量，在皮牛顿和毫秒分辨率下评估轴突与基底的黏附力

细胞表面黏附在机械转导过程中起核心作用，因其可传递机械张力并启动参与组织稳态与发育的信号通路。本文介绍一种利用配体包被的磁性微珠对黏附受体施加外力，以解析张力响应所激活的生化通路的实验方案。...

利用磁珠分析细胞表面黏附在机械张力作用下的重塑过程

本文介绍了一种实验方案，可同时利用基于荧光共振能量转移的张力传感器测量蛋白质所受载荷，并结合光漂白后荧光恢复技术测量蛋白质动态，从而实现对活细胞内受力敏感的蛋白质动态进行定量分析。...

利用荧光技术组合测量活细胞中力敏感蛋白的动力学

整合素张力在多种细胞功能中发挥重要作用。利用一种整合式张力传感器，可对整合素张力进行皮牛顿（pN）级灵敏度的校准，并以亚微米分辨率成像。...

以整合型张力传感器实现亚微米分辨率的整合素张力与细胞力成像

该方法可用于定量分析贴壁依赖性细胞在纤连蛋白上的早期黏附和铺展动态。此外，该实验还可用于研究氧化还原稳态改变对细胞铺展和/或细胞黏附相关胞内信号通路的影响。...

在氧化应激条件下研究上皮细胞在纤连蛋白上的细胞黏附与铺展动态过程

本文介绍了一种利用基于DNA的张力探针成像免疫细胞受体受力的详细实验方案。该方法可绘制受体受力图谱 &gt;4.7 pN...

用于绘制免疫细胞瞬时皮牛顿受体力的DNA张力探针

本方案介绍了进行黏附足迹实验以成像快速细胞滚动黏附过程中黏附事件的实验步骤。...

成像细胞滚动过程中分子黏附的黏附足迹检测法

为了前进，生长锥必须对外部环境施加牵引力。牵引力的产生依赖于肌动蛋白动态和离合器耦合。本研究描述了分析生长锥前进过程中肌动蛋白动态、离合器耦合以及牵引力的方法。...

生长锥前进过程中的肌动蛋白动力学、黏着耦合与牵引力分析

提供了一种利用可调节密度的RGD功能化亲和素-生物素连接臂对单个迁移血小板进行成像的详细方案，揭示出血小板产生的力足以断裂亲和素-生物素键。...

一种利用RGD功能化亲和素-生物素连接臂研究血小板迁移的体外实验方法

该方法通过检测细胞断裂固定化配体呈递DNA双链的倾向性，以报告细胞相对牵引力。断裂的荧光寡核苷酸被递送至细胞内，并通过流式细胞术进行分析，记录细胞的力学历史。该技术可实现细胞力生成的高通量测量，适用于细胞力学表型分析。...

基于DNA张力探针破裂及递送入细胞的高通量流式细胞术细胞机械表型检测

了解利用TGT传感器平台研究EGFR与整合素相互作用的方法。该技术使用Cos-7细胞系和RICM、TIRF成像技术，可量化生长因子介导的细胞力学变化，为细胞黏附和铺展研究提供新见解。

用于量化生长因子介导的整合素力学与黏附的张力测量锚定探针

探索更多视频