Name: 通过可见光光解 核 黄素-5′-磷酸灭活病原体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 了解利用可见紫光诱导核黄素-5′-磷酸光解产生自由基的方法，该方法可有效灭活金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等病原菌，适用于皮肤创伤治疗及食品工业消毒，具有安全、简便且无需昂贵设备的优势。

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作者感谢 Tak-Wah Wong 博士和 Zong-Jhe Hsieh 先生在实验方面提供的支持。

1. 光解系统设置
<ol>
	<li>如图1所示，将六个发光二极管（LED）（直流12 V）安装在一个不透明塑料杯（8 cm × 7 cm）内侧，以构建光解系统31。</li>
	<li>将反应物（见下文）加入玻璃试管（直径13 mm，高100 mm）中，并将试管固定在杯口顶部，如图1所示。将实验装置置于温度恒定为25 ± 3 °C的室内。</li>
	<li>使用红外测温仪监测并记录光解反应过程中各测试单元的温度。 
	注意：图2显示了使用校准的紫外-可见光光谱仪测得的蓝光、绿光、红光和紫光的发射光谱。本研究中所用蓝光、绿光、红光和紫光LED的最大吸收波长分别为465 nm、529 nm、632 nm和405 nm。LED芯片在辐照实验期间可能使装置升温，因此每次实验中的整个光反应系统均置于温度保持在25 ± 3 °C恒定条件的室内。</li>
</ol>
2. 光波长对核黄素（FMN）光解作用的影响（图3）
<ol>
	<li>在100 mM磷酸钾缓冲液（PB，pH 7.8）中配制0.1 mM FMN溶液。将FMN样品（每份3 mL）分别暴露于强度为10 W/m2的蓝光、绿光、红光或紫光下照射5分钟。另取3 mL FMN溶液置于黑暗中作为对照。</li>
	<li>使用紫外/可见分光光度计测定照射后FMN样品在250–750 nm波长范围内的吸光度。</li>
</ol>
3. 硝基蓝四氮唑（NBT）还原法检测<img alt="超氧阴离子自由基 O2−；化学式；在生物化学过程中的自由基存在。" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="font-size: 14px; margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程式 1">（图 4）。
注意：此处使用的氮蓝四唑（NBT）还原法是对核黄素光反应检测方法的轻微修改。NBT还原法用于评估由黄素单核苷酸（FMN）光解产生的<img alt="超氧阴离子自由基 O2−；化学式；生化过程中的自由基存在" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1">的水平。光激发的FMN首先被L-甲硫氨酸还原为半醌形式，随后将一个电子传递给氧气，从而生成<img alt="超氧阴离子自由基 O2−；化学式；生化过程中的自由基存在" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1">31。所生成的<img alt="超氧阴离子自由基 O2−；化学式；生化过程中的自由基存在" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1">可将NBT还原为甲臜，后者在560 nm处具有特征性吸收峰32。
<ol>
	<li>将109.3 mg L-甲硫氨酸加入73.3 mL磷酸缓冲液（PB，100 mM；pH 7.8）中。涡旋振荡使L-甲硫氨酸充分溶解。</li>
	<li>L-甲硫氨酸完全溶解后，向溶液中加入10 mg NBT粉末和1.53 mL 0.117 mM FMN。每使用1 mL反应溶液（即FMN、L-甲硫氨酸和NBT的混合物），FMN、甲硫氨酸和NBT的终浓度分别为2.4 × 10-6 M、1.0 × 10-2 M和1.6 × 10-4 M。</li>
	<li>将反应溶液（1 mL）置于10 W/m2的蓝光或紫光LED照射下，光照时间为1–5分钟。</li>
	<li>检测光化学反应产生的<img alt="超氧阴离子自由基 O2−；化学式；在生化过程中的自由基存在" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程1">物种（通过在560 nm处的吸光度测定），该反应可还原NBT并生成甲臜。</li>
</ol>
4. FMN 光解后金黄色葡萄球菌（S. aureus）的存活率（图 5）
<ol>
	<li>将一株 S. aureus（BCRC 10451）从培养平板接种至含有10 mL LB培养基的15 mL螺口试管中，在37 °C摇床中培养16 h。</li>
	<li>取0.5 mL菌液转移至1.5 mL离心管中，加入无菌水稀释，使菌液在600 nm处的光密度（OD600）达到0.5（约6 × 107 CFU/mL）。</li>
	<li>取0.5 mL菌液转移至1.5 mL离心管中，在14,000 × g 条件下离心10 min，弃去上清液，获得菌体沉淀。</li>
	<li>向步骤4.3中获得的菌体沉淀中分别加入1 mL含30、60和120 µM FMN的磷酸盐缓冲液（PB），涡旋混匀。作为光照对照，单独加入1 mL PB缓冲液。</li>
	<li>分别取含30 µM FMN和单独PB的活性细菌悬液各1 mL，加入玻璃试管中，用10 W/m2的紫光照射30 min。</li>
	<li>分别取含30、60和120 µM FMN以及单独PB的活性细菌悬液各1 mL，加入玻璃试管中，用20 W/m2的蓝光照射120 min。另设一组含120 µM FMN的活性细菌悬液1 mL，同样用20 W/m2蓝光照射60 min。</li>
	<li>按照步骤4.5和4.6设置试管，并用厚铝箔包裹，作为暗对照组。</li>
	<li>在30–120 min的照射期间，将照射室（以及暗对照组）置于9 ± 1 °C的冷藏室中。 
	注：LED光源释放的热量不可忽略，因LED芯片置于照射杯内可能在实验过程中加热光反应体系，因此实验在保持在9 ± 1 °C的冷藏室中进行。</li>
	<li>照射结束后，从各反应液中取0.2 mL涂布于LB琼脂（LA）平板上，用L型玻璃涂布棒均匀涂布，并在37 °C过夜培养。</li>
	<li>根据过夜培养结果，计算S. aureus的活菌平板计数及灭活率。 
	注：S. aureus的灭活率以百分比减少值表示，计算公式为[1 - I / D] × 100%，其中I和D分别代表光照处理组与暗对照组的CFU数量。百分比减少值定义为灭活率的负值。</li>
</ol>
5. 检测 <img alt="超氧阴离子自由基 O2−；化学式；自由基在生物化学过程中的存在" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="font-size: 14px; margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> 在 S. aureus (图6)
<ol>
	<li>按照步骤4所述方法准备 S. aureus 样品。</li>
	<li>用无菌水将样品的细菌密度稀释至在600 nm处的光密度为0.5（OD600，约6 × 106 CFU/mL）。取0.5 mL培养液转移至1.5 mL离心管中，在14,000 × g 下离心10分钟，弃去上清液，获得细胞沉淀。</li>
	<li>将0.1093 g L-甲硫氨酸、0.1 g NBT和25 mL FMN（400、240或120 µM）加入75 mL磷酸盐缓冲液（PB）中。每使用1 mL反应液，FMN、甲硫氨酸和NBT的终浓度分别为100（60或30）× 10-6 M、7.3 × 10-3 M和1.2 × 10-3 M。</li>
	<li>将1 mL各反应液（即含不同FMN浓度的溶液）加入步骤5.2中获得的细胞沉淀中。用10 W/m2的紫光照射10分钟。</li>
	<li>将混合物在14,000 × g 下离心10分钟，弃去上清液。用1 mL二甲基亚砜（DMSO）重悬沉淀，以提取还原的NBT。通过在560 nm处测定吸光度检测生成的 <img alt="超氧阴离子自由基 O2−；化学式；在生化过程中的自由基存在" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 1"> 物种。</li>
</ol>
6. 统计分析
<ol>
	<li>以三次独立实验的均值 ± 标准差（SD）表示数据。</li>
	<li>采用方差齐性的双样本t检验来评估两个测量值之间是否存在差异。p值 &lt; 0.05 被认为具有统计学显著性。</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

光敏剂可增强化学化合物的光化学反应以产生活性氧（ROS）。在光敏剂存在的情况下，通过光照可使病原微生物失活。本研究通过外源性光敏剂核黄素（FMN）在紫光照射下产生的活性氧，测定其对S. aureus的抗菌光动力失活（aPDI）效果。
如图所示 图3，对于FMN，使用紫光或蓝光照射5分钟后，其在444 nm处的吸光度显著降低，而在绿光或红光照射下，FMN的吸光度无明显变化。采用NBT还原法来检测还原产物的生成 <img alt="超氧阴离子自由基 O2−；化学式；自由基在生物化学过程中的存在" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> 通过 电荷转移过程10,33. 作者先前的一项研究...

黄素单核苷酸（FMN）是通过核黄素侧链核糖基的5′位磷酸化形成的，所有黄素蛋白在多种细胞过程中产生能量时均需要FMN。它还在人体某些功能中发挥维生素的作用1。FMN在水中的溶解度约为核黄素的200倍2。
细菌的抗菌光动力失活（aPDI）是一种有效控制细菌耐药性的方法3,4，因为它不依赖于细菌耐药的作用机制。在临床上，aPDI 被用于治疗软组织感染，以减少由多重耐药菌引起的医院内皮肤感染5,6,7,8,9。aPDI 还可通过产生活性氧（ROS）导致细胞死亡。ROS，例如超氧阴离子自由基（<img alt="超氧阴离子自由基 O2−；化学式；在生化过程中的自由基存在" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1">）、单线态氧、羟基自由基（•OH）和过氧自由基，是含有活性氧的自由基或分子10,11,12，通常具有高反应活性13。与 ROS 引起的 DNA 损伤类似，膜脂过氧化以及内皮细胞的破坏也是细胞中由 ROS 引起的有害生化反应12。
使用 aPDI 灭活致病性细菌涉及在化学化合物（如亚甲蓝氯化物）存在下，利用可见光或紫外光源使微生物失活14，PEI-ce6 偶联物15，卟啉16二氧化钛17甲苯胺蓝 O18和氧化锌纳米颗粒19甲苯胺蓝O和亚甲蓝属于吩噻嗪类染料，其中亚甲蓝具有毒性。氧化锌纳米颗粒和紫外照射与不良的健康及环境效应相关。因此，开发一种可靠、安全且简单的光敏剂 通过 可见光照射下的光解反应值得进一步研究。
微量营养素核黄素或FMN无毒，且确实用于食品制造或喂养20FMN 和核黄素均对光照高度敏感2. 在紫外光下1,2,21,22,23 蓝光照射10,24这两种化合物达到激发态。光解产生的激活态核黄素或FMN被促进至其三重态，同时产生活性氧（ROS）。2,25Kumar 等人报道，核黄素在紫外光激活下可选择性地增加对病原微生物DNA中鸟嘌呤部分的损伤26在紫外光照射下，光动力活化的核黄素可促进双链DNA中8-OH-dG的生成，后者是氧化应激的生物标志物。27据报道， S. aureus 和 E. coli 在核黄素或FMN光解过程中被活性氧（ROS）失活10,24,28. 作者之前的一项研究表明，核黄素和FMN参与的光解反应能够还原结晶紫，一种三芳基甲烷染料及可生成抗菌剂的物质 <img alt="超氧阴离子自由基 O2−；化学式；自由基在生物化学过程中的存在" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1">，并消除结晶紫的大部分抗菌能力28当黄素腺嘌呤二核苷酸或FMN被蓝光照射时，所产生的活性氧物种因其毒性在HeLa细胞中诱导凋亡 体外29. 通过在核黄素存在下进行光化学处理，Cui 等人通过抑制淋巴细胞的增殖和细胞因子产生使其失活30.
核黄素的光解作用可用于通过紫外线灭活血液中的病原体10,24，但血液成分在紫外线照射下可能受到损伤30。也有报道称，血小板暴露于紫外线后，其膜表面的活化标志物P-选择素和LIMP-CD63的表达会逐渐增强。紫外线及高强度辐照的细胞毒性需要进一步研究，而在涉及可见光的黄素单核苷酸（FMN）光反应中，若能使用一种操作简便且安全的光敏剂将具有重要意义。
短波长的光具有更高的能量，更易对细胞造成严重损伤。然而，在存在合适光敏剂的情况下，使用低强度紫光照射可抑制病原微生物。光敏作用及活性氧的产生 <img alt="超氧阴离子自由基 O2−；化学式；在生物化学过程中的自由基存在" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> 因此，研究在紫光照射下由FMN产生的ROS对细菌失活作用的途径非常重要。
抗菌控制是一个普遍存在的问题，而新抗生素的开发通常需要数十年时间。经紫光照射后，由FMN介导的光失活可有效灭活环境中的致病菌。本研究提出了一种高效的抗菌方案 体外 利用紫光驱动FMN光解，从而生成 <img alt="超氧阴离子自由基 O2−；化学式；自由基在生物化学过程中的存在" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> 对于aPDI。微生物的存活性 S. aureus 用于确定FMN诱导的aPDI的可行性。

<table><tbody><tr><td>蓝色、绿色和红色LED灯</td><td>Vita LED Technologies Co., 中国台湾台南</td><td></td><td>DC 12 V 5050</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>190186</td><td></td></tr><tr><td>红外温度计</td><td>Raytek 公司，加利福尼亚州圣克鲁斯市</td><td>MT4</td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤</td><td>Difco 公司，新泽西州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-甲硫氨酸</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>1.05707</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Bio Basic 公司，加拿大安大略省马克姆市</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电源</td><td>中国台湾新北市，China tech 公司</td><td>YP30-3-2</td><td></td></tr><tr><td>核黄素 5&amp;prime;-磷酸盐</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>R7774</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>太阳能功率计</td><td>Tenmars Electronics Co.，中国台湾台北</td><td>TM-207</td><td></td></tr><tr><td>金黄色葡萄球菌金黄色亚种</td><td>中国台湾新竹生物资源收集与研究中心（BCRC）</td><td>10451</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见光分光光度计</td><td>Ocean Optics，佛罗里达州邓迪</td><td>USB4000</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>日本东京，日立高新技术公司</td><td>U-2900</td><td></td></tr><tr><td>紫光LED</td><td>中国东莞，龙辉电子有限公司</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

病原体灭活 通过 核黄素-5′-磷酸的可见光光解

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

黄素-5'-磷酸（或黄素单核苷酸；FMN）对可见光敏感。在可见光照射下，FMN光解可产生多种化合物，包括活性氧（ROS）。由FMN光解产生的活性氧对微生物具有危害性，包括致病性细菌，例如 金黄色葡萄球菌 (S. aureus）。本文介绍了一种失活 S. aureus，例如， 通过 在可见光照射下涉及FMN的光化学反应。超氧自由基阴离子（<img alt="超氧阴离子，O₂⁻，化学结构，氧化还原反应分析，分子式。" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1">FMN 光解过程中产生的 ) 进行评估 通过 氮蓝四唑（NBT）还原。微生物活力的 S. aureus 这归因于活性 <img alt="超氧阴离子，O₂⁻，化学结构，氧化还原反应分析，分子式" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> 物种被用于确定该过程的有效性。细菌灭活率与FMN浓度成正比。紫光在灭活方面效率更高。 S. aureus 与蓝光照射相比，红光或绿光不会引发黄素单核苷酸（FMN）的光解。本文展示了FMN光解作为一种简单且安全的卫生处理方法。

光波长对FMN的影响 
使用蓝光、绿光、红光和紫光LED照射后，0.1 mM FMN的吸收光谱如图3所示。在避光对照组中，FMN在372 nm和444 nm处有两个吸收峰。绿光和红光对其无显著影响，因为光谱变化不明显。相比之下，在10 W/m2强度下分别用蓝光和紫光照射5分钟后，FMN在444 nm处的吸光度分别降低了约19%和34%，表明蓝光/紫光照射可促进FMN的光解反应。
利用蓝光或紫光照射黄素单核苷酸（FMN）后检测<img alt="超氧阴离子自由基，\( \text{O}_2^{ \cdot -} \)，分子结构表示，化学分析。" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq10.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 10"> 的生成<...

本文介绍了一种利用在低强度蓝光和紫光照射下黄素单核苷酸（FMN）光解过程中产生的活性氧来灭活致病菌的实验方案。FMN光解被证明是一种用于消毒过程的简单且安全的方法。

核黄素-5'-磷酸（或黄素单核苷酸；FMN）对可见光敏感。多种化合物，包括活性氧（ROS），可以……

本方案利用可见紫光照射诱导黄素单核苷酸发生光解反应，产生大量自由基，从而抑制金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（E.coli）等致病菌。我们已验证黄素单核苷酸可作为合适的光敏剂。在本方案中，我们使用可见的紫光，这种光是安全的，且不需要昂贵的设备。通过插入光纤进行照射，该方法可用于受损皮肤或感染的皮下组织的治疗。它也可应用于食品工业中的消毒实践。演示该实验操作的是我实验室的研究生 Tang-Yu Chen。首先，将六个额定电压为 12 伏的发光二极管安装在一个不透明塑料杯的内壁上。取一支直径为 13 毫米、高度为 100 毫米的玻璃试管，并将反应物加入该试管中。将试管固定在杯口上方，并将整个装置置于 25 ± 3 °C 的恒温环境中。在整个光解反应过程中，使用红外测温仪监测并记录测试单元的温度。接下来，用pH 7.8的100毫摩尔磷酸钾缓冲液配制0.1毫摩尔的FMN溶液。将每份3毫升的FMN样品分别暴露于蓝光、绿光、红光或紫光下照射5分钟。同时，将三毫升 FMN 溶液避光保存作为对照。将样品放入紫外-可见分光光度计中，记录照射后样品在 250 至 750 纳米范围内的吸光度。为检测超氧阴离子自由基做准备，首先将 109.3 毫克 L-甲硫氨酸加入 73.3 毫升 pH 7.8 的 100 毫摩尔磷酸盐缓冲液中。向溶液中加入 10 毫克 NBT 粉末和 1.5 毫升 0.117 毫摩尔 FMN。将 1 毫升反应溶液暴露于蓝色或紫色 LED 光下照射 1 至 5 分钟。记录 516 纳米处的吸光度，以检测由 NBT 光化学反应生成的甲臜。将一株金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）接种至15毫升带螺帽试管中的10毫升LB液体培养基中。在摇床中37°C条件下培养16小时。取0.5毫升菌液转移至1.5毫升离心管中。通过加入无菌水，将培养物稀释至600纳米处的光密度为0.5。然后，将0.5毫升培养物转移至1.5毫升离心管中。在14,000 ×g条件下离心10分钟，并倾去上清液。向细胞沉淀中加入1毫升FMN缓冲液并涡旋振荡。对于照射对照组，加入1毫升磷酸盐缓冲液。将含有30微摩尔FMN和磷酸盐缓冲液的1毫升细菌细胞溶液转移至玻璃试管中。将它们置于紫光下照射，辐射强度为10瓦特每平方米，持续30分钟。然后，取1毫升含有30、60和120微摩尔FMN及磷酸盐缓冲液的细菌细胞溶液，转移至玻璃试管中。在20瓦特每平方米的蓝光下照射120分钟。同时，将含有1毫升120微摩尔FMN的试管照射60分钟。照射后，取0.2毫升反应液加入LB琼脂平板中，用L形玻璃棒涂布均匀，并于37摄氏度过夜培养。第二天，测定金黄色葡萄球菌的活菌平板计数和灭活率。按照前述方法制备金黄色葡萄球菌样品，以获得菌体沉淀。在75毫升磷酸盐缓冲液中加入0.10

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科研

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Bioengineering

生物工程

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