Name: 小动物模型中腺相关病毒载体的结膜下给药 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: 了解腺相关病毒载体在小动物模型中的结膜下给药方法，用于安全有效的眼部基因治疗。该技术具有微创性，可降低风险并治疗多种眼部疾病。

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作者感谢北卡罗来纳大学病毒载体核心实验室（Vector Core at the University of North Carolina）提供本研究中使用的scAAV8-GFP载体，感谢CGIBD组织学核心实验室（CGIBD Histology Core），以及Brian C. Gilger博士实验室在本研究临床评估部分提供的协助。本研究得到了辉瑞-北卡生物技术中心杰出博士后奖学金（Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship）以及美国基因与细胞治疗学会职业发展奖（Career Development Award from the American Society of Gene）的资助。 &amp;#38; 细胞治疗与囊性纤维化基金会&#160;内容完全由作者负责，并不一定代表美国基因学会的官方观点 &amp;#38; 细胞治疗或囊性纤维化基金会。

所有动物实验均按照北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物护理和使用委员会的规定进行。使用腺相关病毒（AAV）载体属于生物安全等级1级的生物危害风险。在操作AAV时，应穿戴适当的个人防护装备，包括实验服、手套和护目镜。在本实验中，采用了一种重组AAV载体，该载体包装了8型血清型衣壳，并携带由通用的普遍性巨细胞病毒（CMV）启动子控制绿色荧光蛋白（GFP）表达的编码序列。
1. AAV 载体的处理与保存
<ol>
	<li>将病毒以100 µL分装于硅化或低吸附的微量离心管中，于-80 °C冰箱中保存。</li>
	<li>使用前将所有载体储存液置于冰上解冻。 
	&#8203;注意：通常将荧光素钠溶液等染料（终浓度为0.1–2%）与AAV载体混合，以可视化注射溶液。此外，观察注射溶液有助于检测气泡，并监测注射后AAV的分布情况和/或渗漏情况。</li>
</ol>
2. 结膜下（SCJ）注射
<ol>
	<li>组装注射系统。
	<ol>
		<li>组装注射系统时，将体视显微镜和注射泵放置于生物安全柜中。 
		注意：需要使用输注泵以高精度进行注射。本实验采用标准推注/回抽可编程注射泵（见材料表），该泵配备牢固的夹持装置和适用于0.5 µL至60 mL注射器的安全夹具。该泵还提供增强的流体性能，具有高准确性和平稳的流速，范围为1.28 pl/min至88.28 ml/min。</li>
		<li>将聚乙烯管剪成约50 cm长（见材料表）。</li>
		<li>将36 G针头的针座端插入管的一端。 
		注意：将针座端滑入管中约3 mm，以确保无泄漏。36 G针头用于后续的球结膜下注射（SCJ）。32 G至36 G的针头是SCJ注射中最常用的规格。强烈建议使用止血钳辅助此步骤，以避免锐器损伤的风险。</li>
		<li>用无菌水填充一次性3 mL注射器；将该一次性注射器插入与针头相对的管端，并将水冲洗通过整个管路/针头。再用70%酒精重复此步骤。</li>
		<li>重复步骤2.1.4三次，交替使用无菌水和70%酒精冲洗，以消毒管路并确保在整个管路中无泄漏、堵塞或损坏现象。</li>
		<li>使用一次性3 mL注射器将管路充满无菌水，并保持管路连接在一次性注射器上。</li>
		<li>在实验台表面放置一片封口膜，并在其上加入约1 mL无菌水形成液滴。将连接针头的管段浸入无菌水液滴中。从另一端拔出一次性注射器时，拉动注射器活塞以防止空气进入管路/针头系统。保持连接针头的管段浸没在水中。 
		注意：步骤2.1.4至2.1.7应在层流罩内进行。</li>
		<li>用无菌水填充10 µL Hamilton注射器/针头，避免注射器内存在空气。通过将管路和Hamilton注射器针尖浸入封口膜上的无菌水液滴中，将Hamilton注射器/针头连接至管路的另一开放端。</li>
		<li>按下泵屏幕上快速回退按钮，使推杆块移动至注射器的大致长度位置。松开支架夹紧旋钮，放松推杆和注射器支架块上的固定支架。根据制造商说明，将Hamilton注射器装入注射器支架块并固定注射器。 
		注意：为固定注射器，注射器筒夹应紧贴注射器筒身；但不要过度拧紧，尤其是使用玻璃注射器时。&#160;注射器推杆应由推杆块固定支架夹紧。</li>
		<li>在泵设置界面中调整参数。
		<ol>
			<li>按下力值按钮，将力值设为30%。确认更改后返回设置界面。</li>
			<li>按下快速启动按钮，选择方法 | 推注/回抽。</li>
			<li>对于注射器，选择Hamilton 1700, 玻璃, 10 µL。设置推注速率、回抽速率和注射体积。 
			注意：力值设置取决于注射器类型/材质/容量/制造商；请参阅厂家建议的每种注射器的推荐力值。本实验使用的注射速度为200 nL/s。SCJ注射相对安全，注射引起眼内压（IOP）升高的风险较小。对于某些应用，较慢的注射速度通常更理想，以避免液体反流至针头，并保持动物间注射的一致性。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>排出Hamilton注射器中的水，但保持管路和注射针内充满水。通过按下回退按钮轻微回拉Hamilton注射器，在管路/针头中引入一个小气泡。 
		注意：该气泡将作为管路中水与治疗药物（本例中为AAV）之间的屏障，确保给药剂量的准确性。</li>
		<li>将注射针插入病毒原液分装管中，回抽病毒。确保病毒与管路中的水之间保留一个可见的气泡。 
		注意：AAV载体可结合塑料管路和金属针头，导致病毒损失和/或给药剂量不准确。因此，为确保实验严谨性、可重复性和AAV剂量的准确性，建议预先包被后续与AAV接触的表面。为包被管路/针头系统，将病毒载体溶液吸入管路/针头中，在室温下孵育10分钟，使病毒充分结合至针头和/或管路内壁。随后弃去病毒溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>病毒注射
	<ol>
		<li>使用吸入麻醉（异氟烷）或腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪/乙酰丙嗪对小鼠进行麻醉。通过用力捏压脚趾无反应来确认手术麻醉深度。 
		注意：使用至少6周龄的雌性或雄性C57BL/6J或BALB/c小鼠。氯胺酮/赛拉嗪/乙酰丙嗪的剂量如下：氯胺酮70&#8201;mg/kg，赛拉嗪7&#8201;mg/kg，乙酰丙嗪1.5&#8201;mg/kg。</li>
		<li>对接受注射的眼部使用局部麻醉剂。 
		注意：使用0.1%盐酸丙帕他卡因和/或0.5%盐酸丁卡因眼科溶液进行局部麻醉。</li>
		<li>对未接受注射的另一只眼睛涂抹眼膏，以防止干燥和损伤。</li>
		<li>将小鼠置于显微镜载物台上，在体视显微镜下暴露小鼠眼部。</li>
		<li>用两根手指捏住眼睑，轻轻将其从小鼠眼球上拉开，以暴露结膜，即连接眼睑与巩膜的内层膜。</li>
		<li>用镊子夹住结膜。</li>
		<li>松开眼睑，用惯用手握住针头，使针尖斜面朝上。</li>
		<li>将针头插入结膜，直至针尖斜面完全被结膜覆盖。将针头贴紧眼球表面。 
		注意：由于结膜为透明膜，针尖/斜面清晰可见。</li>
		<li>使用脚踏开关按下开始按钮启动注射。 
		注意：气泡移动与Hamilton注射器推杆运动同步；任何延迟均提示注射系统中存在多余空气，或管路、针头和/或注射器组件之间连接松动。</li>
		<li>注射完成后，保持针头在原位10秒后再从结膜中拔出，以减少反流的可能性。 
		注意：SCJ注射部位常出现水疱样隆起（bleb），此类隆起通常在注射后数小时内完全消退。</li>
		<li>在小鼠眼睛上滴一滴局部润滑凝胶，防止眼部干燥或损伤，然后将小鼠置于加热垫上恢复。</li>
		<li>进行眼部检查，如泪液分泌量、眼内压（IOP）和裂隙灯检查，并结合角膜荧光素染色评估注射后眼部异常。 
		注意：泪液分泌量通过酚红棉线试验测定，常用眼压计检测小鼠眼内压。据报道，某些眼内注射（如玻璃体内注射）可能导致眼内压显著升高；然而，SCJ注射后的眼内压变化并不明显13,22,23,24。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结膜下注射后AAV的生物分布及转导效率检测
	<ol>
		<li>为研究通过SCJ递送的AAV载体的病毒基因组生物分布和/或转导特性，采用AVMA批准的方法处死小鼠。 
		注意：本实验中，小鼠在注射后8周被处死。</li>
		<li>为分析靶向眼部组织区室的生物分布和转基因表达，解剖相关感兴趣组织，如眼睑、角膜、结膜、眼外肌、视网膜和视神经。迅速冷冻所有组织并储存在-80 °C。为检测全身AAV生物分布，采集如下颌下淋巴结和肝脏等器官，迅速冷冻并储存在-80 °C。</li>
		<li>使用DNA/RNA提取试剂盒，从同一样本中分别提取基因组DNA（gDNA）和RNA，用于检测转基因表达和AAV生物分布。若仅需检测载体生物分布，可使用DNA提取试剂盒提取gDNA。</li>
		<li>使用载体特异性引物/探针进行标准qPCR和RT-qPCR，以确定AAV载体的生物分布和cDNA丰度13,25。</li>
		<li>进行组织学分析时，固定眼球，包埋于石蜡中，并切成5 µm厚切片。进行标准免疫荧光染色以显示转基因表达26。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bourne, R. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnitude%2C+temporal+trends%2C+and+projections+of+the+global+prevalence+of+blindness+and+distance+and+near+vision+impairment%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).</li>
<li>Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+polymeric+nanoparticles+in+the+eye%3A+implications+in+ocular+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy.</a> Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10(2021).</li>
<li>Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+gene+therapy+for+diseases+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Humam+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Advances in gene therapy for diseases of the eye.</a> Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).</li>
<li>Russell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+voretigene+neparvovec+%28AAV2-hRPE65v2%29+in+patients+with+RPE65-mediated+inherited+retinal+dystrophy%3A+a+randomised%2C+controlled%2C+open-label%2C+phase+3+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).</li>
<li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-associated+defective+virus+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-associated defective virus particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li>
<li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+adenovirus-associated+virus+%28AAV%29+in+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures.</a> Virology. 29 (2), 353-357 (1966).</li>
<li>Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+injection%3A+a+review+on+the+novel+route+of+therapeutic+delivery+for+vitreoretinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases.</a> Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).</li>
<li>Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+perspectives+in+ocular+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Recent perspectives in ocular drug delivery.</a> Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).</li>
<li>Amado, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+subretinal+readministration+of+a+viral+vector+in+large+animals+to+treat+congenital+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness.</a> Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+route+of+AAV2+vector+administration+defines+humoral+immune+response+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential.</a> Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).</li>
<li>Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+cytomegalovirus+retinitis+in+AIDS+patients+with+intravitreal+ganciclovir%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Association+of+Thailand%22%5BJournal%5D)">Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir.</a> Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).</li>
<li>Miyadera, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrastromal+gene+therapy+prevents+and+reverses+advanced+corneal+clouding+in+a+canine+model+of+mucopolysaccharidosis+I%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I.</a> Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+survey+of+AAV+gene+delivery+via+subconjunctival+injection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice.</a> Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).</li>
<li>Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subconjunctival+injection+of+recombinant+AAV-angiostatin+ameliorates+alkali+burn+induced+corneal+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis.</a> Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).</li>
<li>Veneziale, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCH+412499%3A+biodistribution+and+safety+of+an+adenovirus+containing+P21%28WAF-1%2FCIP-1%29+following+subconjunctival+injection+in+Cynomolgus+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Cutaneous+and+Ocular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).</li>
<li>Liu, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+by+subconjunctival+injection+of+adenovirus+in+rats%3A+a+study+of+local+distribution%2C+transgene+duration+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety.</a> PLoS One. 10 (12), 0143956(2015).</li>
<li>Igarashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+administration+routes+for+AAV8-mediated+ocular+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy.</a> Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).</li>
<li>Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Ocular drug delivery.</a> AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).</li>
<li>Short, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+evaluation+of+ocular+drug+delivery+formulations%3A+techniques+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations.</a> Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).</li>
<li>Stevens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administering+a+subconjunctival+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Community+Eye+Health%22%5BJournal%5D)">Administering a subconjunctival injection.</a> Community Eye Health. 22 (69), 15(2009).</li>
<li>Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+administration+of+adeno-associated+virus+vectors+for+corneal+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).</li>
<li>de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+intravitreal+injections+on+intraocular+pressure+and+retinal+nerve+fiber+layer%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13248(2020).</li>
<li>Hartman, R. R., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal%2C+subretinal%2C+and+suprachoroidal+injections%3A+evolution+of+microneedles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Theraputics%22%5BJournal%5D)">Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).</li>
<li>Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+intraocular+pressure+spikes+due+to+intravitreal+bevacizumab+injections+by+scleral+indentation+with+cotton+swab+or+digital+ocular+massage%3A+innovative+techniques+compared%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared.</a> Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).</li>
<li>Crabtree, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+expression+of+HLA-G1%2F5+reduces+severity+of+experimental+autoimmune+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19864(2019).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+to+human+limbal+stem+cells+using+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).</li>
<li>Reichel, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+model+of+conjunctival+scarring+in+the+mouse+eye%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">New model of conjunctival scarring in the mouse eye.</a> British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).</li>
<li>Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+shedding+and+immunogenicity+sampling+for+retinal+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy.</a> Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).</li>
<li>Gilger, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fixed-depth+microneedle+enhances+reproducibility+and+safety+for+corneal+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy.</a> Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).</li>
<li>Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+and+porcine+transscleral+solute+transport%3A+influence+of+lipophilicity+and+the+Choroid-Bruch%27s+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

腺相关病毒介导的基因治疗在治疗眼部疾病方面具有巨大潜力。目前的眼部基因治疗主要依赖两种局部给药途径：玻璃体内注射和视网膜下注射。然而，这两种途径均具有侵入性，可能引起严重并发症，包括视网膜脱离、白内障形成和眼内炎。因此，探索相对创伤较小的给药途径（如结膜下注射）具有重要意义。
尽管该技术相对简单且侵入性显著较低，但仍需强调腺相关病毒（AAV）递送过程中的几个重要方面。&#160;建议将AAV载体分装于硅化或低吸附的微量离心管中，每管体积为所需体积（本实验为100 µL），并在-80 °C保存，以避免反复冻融，防止病毒滴度下降。本实验所用载体在-80 °C保存约6年，未出现滴度显著降低的情况。此外，载体的组成可能影响病毒载体的稳定性。本实验中，病毒载体为含350 mM NaCl和5% D-山梨醇的磷酸盐缓冲液（PBS）。本研究所用病毒的滴度为5.1 × 109 vg/µL（通过qPCR测定），每眼注射总量为7 × 109 vg。然而，根据靶组织和目的基因的不同，每眼注射1 × 108–1 × 1010</su...

眼病包括多种遗传性和获得性疾病。2015年，全球约有3600万人被认定为法定盲人，超过10亿人至少存在一定程度的视力障碍，这凸显了在各个层面加强防治工作的迫切需求1。眼部药物递送的主要方法包括局部给药和眼内局部注射，例如滴眼液或结膜下（SCJ）、前房内、玻璃体内和视网膜下注射。尽管无创的局部治疗是眼科药物最常用的给药方式，并广泛用于多种眼前段疾病，但角膜解剖屏障的存在限制了局部给药物质的生物利用度、生物分布和疗效，提示该方法可能并非治疗许多眼内疾病的最佳选择。将药物直接注射至受累的眼内特定腔室可能是更有效且靶向性更强的给药策略2。然而，反复注射可能引发不良反应，使治疗方案复杂化。理想的治疗方法应在单次给药后即可维持长期的治疗效果。因此，基因治疗有望减少所需注射次数，并实现外源基因的持续表达，为治疗眼病提供一种极具前景的方案3,4。
目前有多种病毒性和非病毒性载体可用于基因治疗，但腺相关病毒（AAV）载体因其出色的安全性而备受关注。AAV是一种小的、单链、无包膜的DNA病毒，最初由Atchison等人于1965年在腺病毒制备物中作为污染物发现5,6。随后在20世纪80年代，AAV被改造为一种高效的病毒载体用于基因递送，并在近几十年来成为包括眼病在内的多种疾病基因治疗的首选载体。其中最显著的例子是首个上市的基因治疗药物——voretigene neparvovec，该药物已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于治疗一种罕见的后部眼病——莱伯氏先天性黑蒙症（Leber's Congenital Amaurosis）。尽管voretigene neparvovec已成功克服了临床开发中的诸多障碍，但其他眼科基因疗法的商业化仍面临挑战。例如，voretigene neparvovec需通过视网膜下注射给予仍保留有活性视网膜细胞的患者。因此，对于疾病进展较晚期、缺乏可存活视网膜细胞的患者而言，该治疗无效，不符合治疗适应证。此外，临床观察到与视网膜下注射相关的已知并发症，包括眼部炎症、白内障、视网膜撕裂、黄斑病变和疼痛7,8。与此操作相关的其他担忧还包括出血、视网膜脱离、眼内炎，以及因眼组织破坏导致眼部免疫豁免状态丧失的风险9,10,11,12。因此，探索侵入性更小的基因递送途径（如SCJ注射）的研究正变得日益重要13,14,15,16,17。
结膜是一种薄层膜，由3至5层细胞构成，连接眼球前部与眼睑内侧。结膜下注射（SCJ注射）在临床上用于向眼部的前段和/或后段递送药物，以治疗年龄相关性黄斑变性、青光眼、视网膜炎及后部葡萄膜炎等眼病18,19。该方法操作相对简便，在门诊环境中常规用于眼科药物递送20，疼痛轻微，不会破坏眼部的免疫豁免状态，并可使给药后的药物扩散至包含视神经在内的较大眶周区域。因此，SCJ&#160;注射是AAV基因治疗应用中一种具有吸引力的给药途径。既往已在小鼠中通过SCJ注射途径对天然AAV血清型的安全性、转导效率、血清免疫原性、生物分布及组织特异性进行了表征13,16,21。这些数据表明，通过SCJ给药实现向特定眼部组织的基因递送在理论上是可行的。
本文介绍了一种简单且可调节的小鼠模型中通过巩膜睫状体交界处（SCJ）注射递送腺相关病毒（AAV）载体的实验方案。为确保该方法的可重复性，文中描述了一套注射系统，包括体视显微镜、可编程推注/回吸式注射泵（可实现稳定且精确的注射速度与压力控制），以及与微注射针头连接的气密性可拆卸注射器。该系统适用于小型动物其他眼内给药途径，如角膜基质内、前房内、玻璃体内和视网膜下注射。此外，通常使用荧光素染料以可视化AAV注射部位。本文将详细讨论给药途径中的关键操作步骤、注射平台的设置、注射前准备以及来自实际操作的经验技巧。最后，简要介绍用于确认AAV成功递送至目标组织的常用验证技术。

<table><tbody><tr><td>36 G NanoFil 针头</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF36BV-2</td><td></td></tr><tr><td>AAV 载体</td><td>&amp;nbsp; 北卡罗来纳大学教堂山分校</td><td>&amp;nbsp; /</td><td></td></tr><tr><td>乙酰丙嗪</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-0079-8</td><td></td></tr><tr><td>抗 GFP 抗体</td><td>AVES Labs 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>数码相机</td><td>佳能</td><td>佳能 EOS T5i</td><td></td></tr><tr><td>DNA/RNA 提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;镊子</td><td>精细科学工具公司</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>哈密尔顿注射器</td><td>Hamilton</td><td>7654-01</td><td></td></tr><tr><td>印度墨水</td><td>StatLab</td><td>NC9903975</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮注射液</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>防潮膜</td><td>Parafilm</td><td>807-6</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯导管</td><td>贝克顿·迪金森公司</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>0.1% 丙帕卡因</td><td>Bausch Health 美国公司</td><td>NDC 24208-730-06</td><td></td></tr><tr><td>回弹式眼压计</td><td>Tonovet</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>荧光素钠溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>标准推注/抽取泵 11 Pico Plus Elite 可编程注射泵</td><td>哈佛生物科学公司</td><td>70-4504</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>徕卡</td><td>Mz6</td><td></td></tr><tr><td>0.5% 盐酸丁卡因眼科溶液</td><td>博士伦公司</td><td>处方药</td><td></td></tr><tr><td>局部眼膏</td><td>GenTeal</td><td>NDC 0078-0429-47</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Zone-Quick 酚红棉线盒（100 根）</td><td>ZONE-QUICK</td><td>PO6448</td><td></td></tr></tbody></table>

小动物模型中腺相关病毒载体的结膜下给药

Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

眼病包括多种遗传性和获得性病变，由于可通过多种给药途径相对容易地进行局部给药，这些疾病成为局部药物递送的理想靶点。与其它眼内给药途径相比，结膜下注射（SCJ）具有操作简便、安全性高、通常可在门诊条件下完成等优势。由于小动物眼球尺寸较小，进行结膜下注射通常需要手术显微镜的辅助。已有研究表明，特定血清型的腺相关病毒（AAV）通过结膜下注射是一种有效的基因递送策略，可实现对眼表、眼外肌、角膜及视神经的靶向转导，为多种眼病的治疗提供了潜在途径。
本文介绍了一种在小鼠模型中进行巩膜睫状体交界区（SCJ）注射的详细实验方案，所用注射系统包括可编程输注/回抽式注射泵（可实现稳定且精确的注射速度与压力）以及与微注射针头连接的无泄漏可拆卸注射器。该注射系统亦可适用于小动物其他眼内给药途径，如角膜基质内、前房内、玻璃体内及视网膜下注射。尽管文中以腺相关病毒载体（AAV）在眼科基因治疗研究中的递送为例进行描述，但本方案亦可适用于多种小动物模型中的眼科溶液给药。本文将详细讨论该给药途径的关键操作步骤、注射平台的设置、注射前准备以及来自实际操作经验的技术要点。此外，还将简要介绍用于确认AAV成功递送至目标组织的常用验证技术。

注入结膜下腔的溶液会根据注射体积形成一个水疱样隆起（bleb）。 
本实验中，在体视显微镜下使用36 G针头注射7 µL AAV（7 × 109 病毒基因组拷贝 (vg)/眼），其中混合荧光素至终浓度为0.1%；采用可编程注射泵以1 µL/s的速度恒定控制注射速率/压力。注射时可见水疱样隆起形成（箭头所示）。小鼠结膜下腔（SCJ）给予AAV载体的显微图像见图1。
注入结膜下间隙的物质会扩散至眼球周围，并分布于眼周组织中。 
为了明确通过结膜下注射（SCJ）给予的腺相关病毒（AAV）的分布情况，将7 µL稀释的印度墨水注射到一只10月龄小鼠的结膜下间隙，注射前已进行麻醉。在SCJ注射过程中及注射后均未观察到出血、渗漏或回流现象。注射30分钟后，取眼球及周围组织，并用苏木精和伊红（H&amp;E）染色以观察印度墨水的分布情况。图2 所示的代表性矢状切片显示，印度墨水主...

在本研究中，通过使用由输注/抽取注射泵、可拆卸气密注射器及显微注射针组成的注射系统，证明了结膜下注射可作为小鼠眼组织有效的载体递送方法。该注射系统也可适用于其他眼内给药途径。

眼部疾病包括多种遗传性和获得性病变，由于其相对...

本方案提供了一种安全、简便且有效的基因治疗递送方法，可靶向多种眼组织。该方法也可适用于小动物的角膜基质内和视网膜下注射。结膜下注射途径具有微创性。该方法风险更低，在治疗多种眼部疾病方面具有广阔的应用前景。全球有超过10亿人受到视力障碍的困扰，采用安全且简便的药物递送方式，可广泛适用于多种致盲原因的治疗。本方案中描述的基因递送方法尤其适用于正在开发潜在干预策略的研究人员以及临床眼科医生，后者最终将把这些药物递送给患者。对于首次执行该方案的研究人员而言，最大的挑战可能是将针头插入结膜囊。首先，在生物安全柜内放置体视显微镜和注射泵，组装注射系统。接着，将聚乙烯管剪切成约50厘米长。将36号针头的一端插入管路的一端。然后用无菌水充满一支一次性3毫升注射器，并将其插入针头对面的管路侧端。用无菌水和70%酒精交替冲洗管路三次，以消毒管路，并确保整个管路无泄漏、堵塞或损坏。使用一次性 3 毫升注射器，用无菌水充满导管，并保持导管连接在一次性注射器上。然后在生物安全柜表面放置一块泡棉，向其上添加一滩无菌水。将连接针头的导管部分浸入无菌水滩中。接下来，将一次性注射器从管口抽出，以防止在移除注射器时空气进入管路系统。然后，用无菌水填充一支10微升的Hamilton注射器。接着，将Hamilton注射器的针头连接到管路的开口端，方法是将Hamilton注射器针头浸入Parafilm上的无菌水液滴中。按住泵屏幕上快速反向按钮，将推块移动至与注射器大致相同的长度。接着，拧松支架固定旋钮，以放松推块和注射器固定座上的保持支架。随后，将 Hamilton 注射器安装到注射器固定座上，并按照制造商的说明固定注射器。在泵设置界面中调整参数时，按下“Force”按钮，将力值设为30%，然后确认更改以返回设置界面。按下“Quick Start”按钮，选择“Method”，然后选择“Infuse Only”选项。在注射器选项中，选择Hamilton 1700，然后点击“Glass”并选择10微升。随后，选择输注速率和注射体积。通过按压“Infuse”按钮，将Hamilton注射器中的水排出，同时确保管路和注射针头内充满水。接下来，将注射针头插入病毒原液的一份等分试样中，回抽以吸取病毒。然后按压Hamilton注射器的反向按钮，轻微回拉，以在管路中引入一个小的气泡。麻醉动物后，用镊子夹住结膜。随后将针头插入结膜，直至针尖斜面完全被结膜膜覆盖，并将针头紧贴眼球表面放置。同时，使用脚踏开关按下“开始”按钮以启动注射。为了观察AAV载体的分布情况，对眼部及周围组织进行苏木精-伊红染色。典型的矢状切片显示，墨汁的弥散主要发生在巩膜外表面、眼外肌附近的眶周疏松结缔组织中。为确认注射后八周自互补 AAV8 的转导情况，通过免疫荧光染色检测了组织横截面中绿色荧光蛋白的表达水平。结果显示，AAV8 载体可高效转导眼球后方的眼周肌肉以及角膜组织。为分析载体的生物分布，采用针对目的基因的特异性引物和探针，通过定量聚合酶链式反应检测了其他器官（包括肝脏和心脏）中不同眼部结构区室的载体基因组拷贝数。通过定量反转录聚合酶链式反应确认了外源基因的表达，结果表明，腺相关病毒8型（AAV8）的结膜下注射可在眼睑、结膜、角膜和视神经中实现外源基因的表达。气泡将作为管中液体与治疗药物之间的屏障。该技术可使其他研究人员进一步探索结膜下给药途径在多种眼病的眼科溶液及眼部基因治疗中的应用。

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科研

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Medicine

医学

本文介绍了在视觉皮层中通过颅内注射腺相关病毒（AAV）载体对神经元和胶质细胞进行荧光标记的方法。...

颅内注射腺相关病毒载体

在本视频中，我们展示了基于重组腺相关病毒的基因递送技术在小鼠幼崽中的应用。该方法有助于研究靶向细胞中的基因表达。...

基于重组腺相关病毒的基因递送：一种用于转基因递送及在啮齿类动物模型中实现心脏特异性表达的技术

来源：Park, S. W., 等. 小鼠视网膜色素上皮基因治疗中病毒载体的角膜缘入路视网膜下注射。J. Vis. Exp.

小鼠模型中向视网膜色素上皮的视网膜下注射病毒载体

来源：Grames, M. S., 等．大鼠腺相关病毒静脉注射方法与技巧及中枢神经系统转导评估．J. Vis. Exp.

在大鼠模型中静脉注射重组腺相关病毒载体

为了研究视网膜疾病动物模型中血-视网膜屏障的通透性以及内界膜的完整性，我们使用了多种腺相关病毒（AAV）变体作为标记视网膜神经元和胶质细胞的工具。随后利用病毒介导的报告基因表达作为视网膜屏障通透性的指标。...

利用腺相关病毒作为工具研究疾病中的视网膜屏障

视网膜下注射是一种将基因有效递送至小鼠眼内视网膜色素上皮的外科技术。本文介绍了一种在实验小鼠中对视网膜色素上皮进行病毒载体视网膜下注射的简便且可重复的方法。...

经角膜缘入路-小鼠视网膜色素上皮基因治疗中病毒载体的视网膜下注射

关键词：角膜缘入路，视网膜下注射，病毒载体，基因治疗，视网膜色素上皮，小鼠

介绍了在大鼠中实现中枢神经系统大范围基因递送的方法。本示例的目的是模拟一种影响整个脊髓的疾病。通过广泛的转导，可实现仅通过一次外周给药，便将治疗性蛋白递送至中枢神经系统。...

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本文介绍了一种使用含1%盐酸利多卡因的病毒溶液进行直接鞘内注射的技术，以确保腺相关病毒高效递送至小型动物，并建立了一种评分系统，可根据利多卡因引起的短暂性肌力减弱程度来预测中枢神经系统中的转导效率。...

成年小鼠脑脊液内直接注射重组腺相关病毒

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通过侧尾静脉注射在成年小鼠中稳定递送腺相关病毒

了解腺相关病毒载体在小动物模型中的结膜下给药方法，用于安全有效的眼部基因治疗。该技术具有微创性，可降低风险并治疗多种眼部疾病。

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