小动物模型中腺相关病毒载体的结膜下给药

本方案提供了一种安全、简便且有效的基因治疗递送方法，可靶向多种眼组织。该方法也可适用于小动物的角膜基质内和视网膜下注射。结膜下注射途径具有微创性。

该方法风险更低，在治疗多种眼部疾病方面具有广阔的应用前景。全球有超过10亿人受到视力障碍的困扰，采用安全且简便的药物递送方式，可广泛适用于多种致盲原因的治疗。本方案中描述的基因递送方法尤其适用于正在开发潜在干预策略的研究人员以及临床眼科医生，后者最终将把这些药物递送给患者。

对于首次执行该方案的研究人员而言，最大的挑战可能是将针头插入结膜囊。首先，在生物安全柜内放置体视显微镜和注射泵，组装注射系统。接着，将聚乙烯管剪切成约50厘米长。

将36号针头的一端插入管路的一端。然后用无菌水充满一支一次性3毫升注射器，并将其插入针头对面的管路侧端。用无菌水和70%酒精交替冲洗管路三次，以消毒管路，并确保整个管路无泄漏、堵塞或损坏。

使用一次性 3 毫升注射器，用无菌水充满导管，并保持导管连接在一次性注射器上。然后在生物安全柜表面放置一块泡棉，向其上添加一滩无菌水。将连接针头的导管部分浸入无菌水滩中。

接下来，将一次性注射器从管口抽出，以防止在移除注射器时空气进入管路系统。然后，用无菌水填充一支10微升的Hamilton注射器。接着，将Hamilton注射器的针头连接到管路的开口端，方法是将Hamilton注射器针头浸入Parafilm上的无菌水液滴中。

按住泵屏幕上快速反向按钮，将推块移动至与注射器大致相同的长度。接着，拧松支架固定旋钮，以放松推块和注射器固定座上的保持支架。随后，将 Hamilton 注射器安装到注射器固定座上，并按照制造商的说明固定注射器。

在泵设置界面中调整参数时，按下“Force”按钮，将力值设为30%，然后确认更改以返回设置界面。按下“Quick Start”按钮，选择“Method”，然后选择“Infuse Only”选项。在注射器选项中，选择Hamilton 1700，然后点击“Glass”并选择10微升。

随后，选择输注速率和注射体积。通过按压“Infuse”按钮，将Hamilton注射器中的水排出，同时确保管路和注射针头内充满水。接下来，将注射针头插入病毒原液的一份等分试样中，回抽以吸取病毒。

然后按压Hamilton注射器的反向按钮，轻微回拉，以在管路中引入一个小的气泡。麻醉动物后，用镊子夹住结膜。随后将针头插入结膜，直至针尖斜面完全被结膜膜覆盖，并将针头紧贴眼球表面放置。

同时，使用脚踏开关按下“开始”按钮以启动注射。为了观察AAV载体的分布情况，对眼部及周围组织进行苏木精-伊红染色。典型的矢状切片显示，墨汁的弥散主要发生在巩膜外表面、眼外肌附近的眶周疏松结缔组织中。

为确认注射后八周自互补 AAV8 的转导情况，通过免疫荧光染色检测了组织横截面中绿色荧光蛋白的表达水平。结果显示，AAV8 载体可高效转导眼球后方的眼周肌肉以及角膜组织。为分析载体的生物分布，采用针对目的基因的特异性引物和探针，通过定量聚合酶链式反应检测了其他器官（包括肝脏和心脏）中不同眼部结构区室的载体基因组拷贝数。

通过定量反转录聚合酶链式反应确认了外源基因的表达，结果表明，腺相关病毒8型（AAV8）的结膜下注射可在眼睑、结膜、角膜和视神经中实现外源基因的表达。气泡将作为管中液体与治疗药物之间的屏障。该技术可使其他研究人员进一步探索结膜下给药途径在多种眼病的眼科溶液及眼部基因治疗中的应用。