利用原子力显微镜研究活体表皮细胞的物理特性 拟南芥 根

该方法可用于量化植物细胞壁在发育过程中物理性质的变化，并将这些微观变化与整个器官的生长联系起来。该技术的主要优势在于其非侵入性，且无需任何预处理，即可在体内以亚细胞分辨率相对快速地定量细胞壁的物理特性。实验开始时，将一层薄薄的硅胶涂抹于培养皿中，并在盖玻片上静置于空气中45秒。

使用镊子将幼苗放置在胶上，并调整其方向，避免幼苗的突出部分与悬臂接触。然后轻轻按压根部，使其牢固地粘附在硅胶层上。静置45秒后，加入1×PBS溶液。

将带有锥形针尖的标准氮化硅悬臂梁安装到适用于液体环境的原子力显微镜探头支架中，并调整激光位置，使其照射在悬臂梁上靠近针尖的位置。然后移动光电二极管，使激光光斑位于探测器中心。通过执行压痕校准挠度灵敏度，设置参数为： ramp 大小为 3 微米，压入和回撤速率为 0.6 微米每秒，触发阈值为 0.5 伏特。

确保探针未与样品接触，并校准悬臂梁的弹簧常数。使用热调谐工具，单击“校准”，然后选择“热调谐”，或单击纳米作用域工具栏中的热调谐图标，并输入悬臂梁温度。选择频率范围后，单击样品谐波振荡器流体按钮。

接下来，单击热调谐面板中的已获取数据。然后，将中值滤波器宽度调整为三。调整PSD分箱宽度，通过平均化降低所获取数据中的噪声，并在第一个共振峰周围设置拟合边界。

单击“计算弹簧常数 K”，然后在弹出窗口中单击“是”，确认是否使用此值。使用倒置光学显微镜，在10倍、20倍和40倍目镜放大倍数下，将原子力显微镜（AFM）探针定位在主根第四个细长表皮细胞的表面，并确保探针位于细胞中心。利用先前计算得到的弹簧常数，设置 ramp 大小为 3 µm、触发阈值为 11 nN、压入和回撤速率为 0.6 µm/s，在选定位置获取力曲线。

每种处理条件下，从每个根部的三个细胞获取力曲线，并为每个根部至少采集150条力曲线。该图显示了在位于根伸长区细胞中心的活体样品上进行力压痕实验时的预期结果。当原子力显微镜（AFM）探针开始压入细胞壁表面时，由于细胞壁对形变的抵抗作用，检测到的力开始增加。

力的增加持续至达到最大力值。此后，压痕的卸载阶段开始。在压痕阶段，力随抛物线规律增长，这一点对于将每条曲线拟合到用于计算的锥形压头预测模型至关重要。

作为拟合参数，接触点位置应对应于压痕前的细胞壁表面，并被视为原子力显微镜（AFM）探针位移的起点。在压痕前无法检测到接触点的力曲线应予以舍弃。此外，力-压痕实验的加载和卸载曲线必须无噪声干扰。

对每条力曲线进行模型拟合后，得到直方图，显示所获得的表观杨氏模量值的频率分布。该直方图展示了在对照条件下生长的三株哥伦比亚零号（Columbia Zero）植物的九个不同细胞上，共201次成功压痕实验所获得的频率结果。由于根的形态差异，某些基因型的压痕操作可能较为困难。

例如，在严重渗透胁迫条件下生长的 TTL1 PRC1-1 双突变体。这些直方图显示了从九个不同细胞获得的表观杨氏模量值的概率分布。只有对应于一个细胞的直方图 H 能够拟合为高斯分布。

本文所述的金属可与其他技术结合使用，例如生长速率研究或细胞壁化学成分分析。这些技术将进一步补充信息，有助于理解细胞壁的化学成分如何影响器官的生长及其物理特性。