使用超低输入量靶向切割与核酸酶释放技术进行染色质上单细胞因子定位

CUT&RUN 是一种用于确定蛋白质在染色质上定位的强有力技术，本文介绍了一种以手动96孔板形式进行的单细胞版本该技术。大多数蛋白质定位技术（如 ChIP-seq）需要大量细胞输入，且完成实验约需三天时间。CUT&RUN 由于具有高信号和低背景的特点，已针对低细胞数和单细胞应用进行了优化，可在一天内完成。

我们设想该技术可应用于几乎任何生物样本，尤其适用于确定稀有且丰度较低的样本（如珍贵的患者样本）中因子的定位。在开展任何单细胞实验之前，应先在大量非珍贵细胞上测试抗体及该技术。本实验的主要局限性在于对高效抗体的依赖性。

演示该实验步骤的是来自我实验室的资深研究专家 Santana Lardo。在完成单细胞分选并将细胞核与磁珠结合后，将96孔板置于96孔磁力架上，使磁珠结合至少五分钟。随后，移除并弃去上清液。

向结合有细胞核的磁珠中加入 100 µL 封闭缓冲液，轻轻吹打混匀，在室温下孵育 5 分钟。将孔板置于 96 孔磁力架上，静置至少 5 分钟，使上清液澄清。随后，在不扰动磁珠的情况下，移除并弃去上清液。

从磁力架上取下反应板，每孔加入100 µL洗涤缓冲液，轻轻吹打重悬磁珠。将反应板放回96孔磁力架，静置使上清澄清，然后吸除并弃去上清液。每孔加入25 µL洗涤缓冲液，轻轻吹打重悬磁珠。

通过每反应分配 25 微升洗涤缓冲液制备一抗主混合液，然后每反应加入 0.5 微升一抗。向每份需用靶向目标蛋白的一抗处理的样品中加入 25.5 微升抗体-洗涤缓冲液混合液，随后轻轻吹打混匀。室温孵育 1 小时。

然后，再次将样品放回96孔磁力架上。待上清液澄清后，小心移除并弃去上清液，切勿扰动磁珠。从磁力架上取下反应板后，用100 µL洗涤缓冲液洗涤磁珠，并通过移液重新悬浮磁珠。

将平板重新置于96孔磁力架上，弃去上清液（操作方法如前所述）后，每份样品中加入25 µL洗涤缓冲液重悬。通过在每反应体系中加入25 µL洗涤缓冲液和优化量的蛋白A微球菌核酸酶（protein A MNase），配制蛋白A MNase主混合液。向每个样品（包括对照样品）中加入25 µL蛋白A MNase主混合液。

将样品在室温下孵育30分钟。将板置于96孔磁力架上。静置至少5分钟，待上清液澄清后，小心移除上清液并弃去，注意不要扰动磁珠。

从磁力架上取下酶标板后，用100微升洗涤缓冲液洗涤磁珠，并通过轻柔吹打重悬。将酶标板置于96孔磁力架上，弃去上清液，操作方法如前所述。随后，将样品从磁力架上取下，再用50微升洗涤缓冲液通过轻柔吹打重悬磁珠。

将样品置于冰水混合物中平衡至0摄氏度，持续5分钟，然后从冰水浴中取出样品。使用多通道移液器加入1微升100毫摩尔/升的氯化钙溶液。用大体积多通道移液器轻柔吹打3至5次，充分混匀，然后将样品重新放回0摄氏度环境中。

当酶标板重新放回冰水浴中后，立即启动10分钟计时器。按照之前加入氯化钙的相同顺序，向每个孔中加入50微升含有两倍浓度RSTOP+和缓冲液的溶液，以终止反应。将样品在37摄氏度下孵育20分钟。

在4°C条件下，以16,000 ×g离心微孔板5分钟。将微孔板置于96孔磁力架上，静置使上清液澄清，时间不少于5分钟。

然后，将上清液转移至新的96孔板中，并弃去磁珠。进行DNA提取时，向每个样本中加入1 µL 10% SDS和0.83 µL 20 mg/mL蛋白酶K，通过轻柔吹打混匀样本。将样本在70 °C下孵育10分钟。

将培养板恢复至室温。向其中加入46.6 µL 5 M氯化钠溶液和90 µL 50% PEG4000，轻轻吹打混匀。每份样品中加入33 µL聚苯乙烯磁珠，室温孵育10分钟。

将培养板置于磁力架上，静置约五分钟，使上清液澄清。然后，小心弃去上清液，避免扰动磁珠。用150 µL 80%乙醇轻轻冲洗两次，避免扰动磁珠。

在1000 ×g 条件下短暂离心96孔板30秒。将96孔板放回96孔磁力架，小心去除残留的乙醇，避免扰动磁珠。将样品在空气中干燥约2至5分钟。

将磁珠重悬于 37.5 微升 pH 8 的 10 毫摩尔 Tris 盐酸盐溶液中，在室温下孵育 5 分钟。将酶标板重新置于磁力架上，静置 5 分钟使磁珠充分结合。将 36.5 微升上清液转移至新的适用于PCR仪的 96 孔板中，弃去磁珠。

在进行细胞质量评估后，检测了细胞形态和比例，结果表明不应使用低质量的胚胎干细胞。使用 Hoechst 33342 染色进行单细胞分选，并对检测细胞进行计数，以确保每个孔中包含零个或一个细胞。琼脂糖凝胶分析显示了低分子量的条带以及各个单细胞 uliCUT&RUN 文库。

文库分析结果显示，分子量较低的条带呈梯状分布，其中由于MNase消化效率低导致文库构建不理想，而经过适当消化后可获得成功的文库。片段分析仪的分布图显示，单细胞预期片段大小范围为150至500个碱基对。然而，对于较大的蛋白质，DNA片段长度约为270个碱基对。

使用单一位点基因组浏览器展示高细胞数量样本或阴性对照以及单细胞CTCF uliCUT&RUN的蛋白占据情况，结果显示单细胞样本主要呈现强峰信号，与高细胞数量的uliCUT&RUN结果相似。单细胞CTCF或阴性对照的热图显示，在已知CTCF结合位点处存在明显的测序读段富集模式。一维热图表明，相对于周围区域和无抗体对照，单细胞文库在已知CTCF结合位点处具有更高的读段密度，证明在已知结合位点处存在抗体特异性的富集。

将结合珠子的细胞核在冰水浴中平衡，并在加入氯化钙时避免样品过热，对于防止染色质过度消化至关重要。