设计抗病毒药物 通过 表面等离子体共振

表面等离子体共振光谱法已用于中等通量条件下检测介质中的蛋白质配体。该方法展示了同一分子不同结合位点变体的结合亲和力差异，特别是病毒上铁结合型高甘露糖寡糖的结合特性。SPR是一种无需标记的实时检测技术，可用于研究固定在表面的受体与大分子之间的相互作用。

在动力学分析中，无论研究中的特定区域大小如何，多结合位点相互作用均可通过竞争性结合来识别。表面等离子共振（SPR）的应用领域包括药物开发中的抑制剂筛选以及抗体表征。动力学常数和亲和力可直接从传感器响应值计算得出。实验开始时，将100 µL溶液转移至LB-琼脂平板上，使用无菌涂布棒轻轻涂布均匀。

使用双链DNA模板进行一系列样本反应，模板浓度范围为5至50纳克，同时保持引物浓度恒定。然后在矿物油覆盖层下方加入DpnI限制性内切酶，并立即在37摄氏度孵育一小时，以消化亲本的超螺旋双链DNA。解冻XL1-Blue超感受态细胞时，将细胞分装至预冷的小型圆底离心管中。

接下来，将每个对照和样品反应中经 DpnI 处理的单链 DNA 各取一微升，分别转移至合成互补链的超感受态细胞分装管中。轻轻涡旋混匀转化反应体系后，将反应物置于冰上孵育 30 分钟。随后在 42 摄氏度条件下对转化反应进行 45 秒的热激处理，再将反应物放回冰上放置 2 分钟。

然后加入 0.5 毫升 NZY+ 培养基，将转化反应物在 37 摄氏度下振荡培养 1 小时，转速为 225 至 250 转/分钟。随后，按照之前所示方法，将每种转化反应的适当体积涂布于 LB 氨苄青霉素琼脂平板上。对于种子培养，从转化平板上挑取单菌落，接种至含氨苄青霉素的 LB 培养基中进行小量培养。

使用过夜培养物接种表达培养液，添加物包括10毫摩尔的氯化镁、10毫摩尔的硫酸镁和20毫摩尔的葡萄糖，将种子培养物按1:100稀释。随后，在37摄氏度下剧烈振荡培养细胞，使其在600纳米处的吸光度达到0.4至0.6，然后将细胞冷却至20摄氏度，加入1毫摩尔的IPTG进行诱导，并继续培养过夜。接着，在4摄氏度下以4,000 g离心15分钟收集细胞，并弃去上清液。

将细胞沉淀重悬于磷酸盐缓冲液中后，在4,000 g、4摄氏度条件下离心15分钟。然后用移液器弃去上清液。接着将剩余沉淀重悬于10毫升裂解缓冲液中，并在37摄氏度孵育1小时。

然后在4°C下以4,000 g离心15分钟，分离可溶性和不溶性组分。此外，使用HIS-Select Ni2+亲和凝胶分别装入14毫升离心管中，用于结合并重悬在含有20毫摩尔咪唑和250毫摩尔咪唑的缓冲溶液中表达的组氨酸标签重组氰病毒素-N。各步骤之间需进行至少30分钟的批式孵育。

加入含有 250 毫摩尔/升咪唑的洗脱缓冲液以洗脱蛋白质。将蛋白质溶液转移至截留分子量为 10 千道尔顿的超滤管中，在 4,500 ×g 及 4 °C 条件下离心 10 分钟进行浓缩。用 SPR 运行缓冲液按 1:10 的稀释比例稀释，并在 4,500 ×g 及 4 °C 条件下每次离心 10 分钟，重复四次，浓缩至初始体积。

随后，根据主要蛋白质 CVN2L0 的计算消光系数（其分子量为 23,474 道尔顿），使用 NanoDrop 紫外-可见分光光度计在 280 纳米处测定蛋白质浓度。对于双通道 SPR 系统，使用 HBSCP plus 作为运行缓冲液，pH 1.5 至 1.6 的 10 毫摩尔甘氨酸盐酸缓冲液作为再生缓冲液，并开启仪器的脱气装置、自动进样器和泵。然后用双蒸水清洗整个系统一小时。

接下来，在检测器上滴加浸油，并将涂有薄金膜且上表面经羧甲基葡聚糖水凝胶功能化的玻璃传感器芯片直接安装到三通道流通池下方的检测器上。然后通过向下拉动操作手柄固定装置。

为了将蛋白质配体固定到传感器芯片上，请在菜单栏中点击“Form”，打开集成SPP自动链接软件中的运行表编辑器。然后从可用的运行表列表中选择并点击“Basic Immobilization”，并按照计算机屏幕上显示的实验步骤进行操作。接下来，在表单部分点击“Sample Set Editor”，填写自动进样器中两个样品架所用试剂的列表，以进行后续分析。

在菜单栏中点击“自动进样器直接控制”工具，将样品架移出或移回原位，并将运行温度设为四摄氏度。通过点击“工具”和“泵直接控制”启动泵，以注入双蒸水。通过点击“SPR 仪器直接控制”来记录数据。

每次操作均需在新出现的窗口中开始。将偶联试剂加入300 µL小瓶后，将其放入自动进样器样品架中，并点击“运行”以启动运行表。对于简单的蛋白质-蛋白质相互作用，在以25,000 µL/min流速重新填充泵后，进行30秒的基线校正。

用双蒸水进行1.5分钟的后续基线调整，然后用1摩尔的盐酸乙醇胺（pH 8.5）淬灭活化的芯片表面。接着，将液体进样器中的管路从双蒸水切换至脱气装置中的HBS-EP+溶液瓶；点击表单，向下滚动，通过点击此操作模式切换至“后处理”。然后点击“添加”，以选择数据平台中每个流动池随时间生成的结合曲线，并将叠加图导出为scrubber文件。

接下来，单击“文件”以打开文件保存选项，通过将左侧和右侧曲线对齐，并从配体通道信号中减去第二参考通道的信号，获得响应曲线。首先使用自动进样器和运行表编辑器，测试 CVN2L0 以及 V2 和 V5 变体单次注射与偶联血凝素的传感器芯片的结合情况，以估算结合容量。在系统中随时间对不同浓度（纳米摩尔至微摩尔范围）进行重复注射，结果表明芯片表面未达到饱和，也未实现平衡结合。

绘制了CVN野生型与RBD结合的浓度-响应曲线，假设其特异性靶向RBD S1亚基上可能保守的碳水化合物，其亲和力较弱，解离速率常数为260微摩尔。CVN2L0-V4与DM结合的相同亲和力曲线由于二硫键被替换，干扰了其与小分子糖基化肽段的高亲和力结合，导致响应值超过最大响应值，因而无法再进行分析。CVN野生型与SARS-CoV-2的RBD结合显示，其对S蛋白和RBD的解离速率常数分别为18.6微摩尔和260微摩尔。

尽管分析物浓度的 SPR 响应会产生较高的响应单位，CVN 野生型和 E41A 结合的典型 SPR 传感图也是如此。然而，该突变体在稀释时不稳定。SPR 生物传感可用于研究纯化蛋白及其变体与配体的高亲和力和低亲和力结合。

在本例中，糖蛋白利用传感器芯片表面的光学读出和双通道流动系统。酶联免疫吸附测定作为一种替代性免疫学方法，不仅可识别蛋白质表位，还能提供复杂基质中肽段和小分子浓度的数据。通过表面等离子共振（SPR）结合实验检测重组表达的蛋白质，可实现对构象变化的生物传感，这在利用计算蛋白质学方法验证和预测蛋白质稳定性方面具有重要意义。