Name: 通过表面等离子体共振 设计 抗病毒药物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: 学习利用表面等离子体共振技术研究蛋白质与糖类的实时结合相互作用，测定动力学常数与亲和力。该方法为抗病毒药物开发和抗体表征提供重要的结构生物学与生物物理学数据支持。

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作者感谢维也纳工业大学生物技术和微生物学系以及维也纳医科大学医学三部肾病和透析科的Christian Derntl博士，特别是Markus Wahrmann博士在技术和科学方面的支持。哺乳动物细胞中的蛋白表达得到了维也纳自然资源与生命科学大学（BOKU）生物技术系的支持。作者谨向德国杜塞尔多夫XanTec bioanalytics公司的Nico Dankbar博士致以诚挚谢意，感谢他在开展表面等离子共振（SPR）结合实验过程中提供的有益科学讨论。

在本研究中，使用了CVN-小泛素样修饰蛋白（SUMO）融合蛋白替代CV-N，用于酶联免疫吸附试验，并适用于基于细胞的检测。重组全长甲型流感病毒HA H3蛋白通过商业途径获得（见 材料表）或根据标准方案在哺乳动物HEK293细胞系和杆状病毒感染的昆虫细胞中表达12武汉-1刺突蛋白在哺乳动物HEK293细胞中表达。单甘露糖基化肽（MM）和双甘露糖基化肽（DM）的合成，使得均一性配体对CVN2及单甘露糖基化小分子的检测成为可能。10.
1. 构建CV-N表达载体
<ol>
	<li>针对每种CVN2变体及CVN2L0蛋白（PDB编号3S3Y），从商业来源获取带有N端pelB信号肽序列和His标签的pET27b(+)载体基因构建体（参见材料表，补充文件1）。</li>
	<li>在CVN2L0模板基因背景下获得CVN2L0及其变体（V2、V3、V4和V5；图2A，C），该模板基因包含两个不同的DNA序列，分别对应每个CV-N重复单元。</li>
	<li>将冻干的质粒DNA溶解于无菌去离子蒸馏水（ddH2O）中，终浓度为100 ng/µL。</li>
</ol>
2. 含质粒DNA转化细胞的LB琼脂平板的制备
<ol>
	<li>通过将蛋白胨（10 g/L）、酵母提取物（5 g/L）和 NaCl（5 g/L）溶解于 ddH2O 中（参见材料表）来配制 LB-Lennox 培养基，并将 pH 调整至 7.4。采用化学法对每种变异株（V2-V5）进行转化，转入感受态 E. coli BL21 (DE3)，具体操作参照已发表的文献方法10。</li>
	<li>将溶液分装（900 µL 和 100 µL），取 100 µL 涂布于 LB-琼脂平板（含 50 µg/mL 卡那霉素），并用无菌涂布棒轻轻涂匀。将琼脂平板在 37 °C 下过夜培养。</li>
</ol>
3. 克隆
<ol>
	<li>将CV-N基因亚克隆至pET11a的NdeI和BamHI位点（参见材料表），随后按照参考文献27的方法，通过电穿孔转化至电转感受态细胞中。</li>
</ol>
4. 定点突变
<ol>
	<li>在含有两个不同DNA序列的CVN2L0模板基因背景下，生成CVN2L029及突变体CVN-E41A，这两个序列分别对应于每个CV-N重复区27。</li>
	<li>使用定点突变试剂盒（见材料表）和特异性突变引物5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3'与5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3'进行PCR扩增以引入突变31。
	<ol>
		<li>使用不同浓度的双链DNA（dsDNA）模板（范围为5–50 ng，例如5、10、20和50 ng）进行一系列样本反应，保持引物浓度恒定。 
		注意：PCR反应体系和热循环程序通常按照定点突变试剂盒说明书中的描述进行32。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在矿物油覆盖层下方加入Dpn I限制性内切酶（1 µL，10 U/µL，见材料表）。轻轻充分混匀反应体系，在台式微量离心机中离心1分钟，随后立即于37 °C孵育1小时，以消化亲本的超螺旋dsDNA。</li>
</ol>
5. 细菌细胞的转化
<ol>
	<li>将XL1-Blue超感受态细胞（见材料表）在冰上轻轻解冻。为转化每个对照和样品反应，取50 µL超感受态细胞分装至预冷的聚丙烯圆底管（14 mL）中。
	<ol>
		<li>从每个对照和样品反应中取1 µL经Dpn I处理的单链DNA（ssDNA）（突变ssDNA），分别加入不同的超感受态细胞分装管中，由细胞合成互补链。轻轻旋转混匀转化反应体系，并在冰上孵育30分钟。 
		注意：在将经Dpn I处理的DNA加入转化反应前，建议小心地从移液枪头上去除残留的石蜡油。作为可选对照，可通过将0.1 ng/µL的pUC18对照质粒（1 µL）与50 µL超感受态细胞混合，检测XL1-Blue超感受态细胞的转化效率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将转化反应在42 °C下进行45秒热激处理，随后立即置于冰上冷却2分钟。 
	注意：上述热激条件已针对所提及的聚丙烯圆底管（14 mL）条件优化。</li>
	<li>加入0.5 mL NZY+培养基（每升含：NZ胺（酪蛋白水解物）10 g、酵母提取物5 g、NaCl 5 g、1 M MgCl2 12.5 mL、1 M MgSO4 12.5 mL、2 M葡萄糖10 mL，pH 7.5，预热至42 °C），将转化反应在37 °C、225–250 rpm振荡条件下孵育1小时。将各转化反应的适当体积（对照质粒转化取5 µL；样品转化取250 µL）涂布于LB-氨苄青霉素琼脂平板上。 
	注意：对于转化对照和定点突变实验，应将细胞涂布于含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷（X-gal，80 µg/mL）和异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷（IPTG，20 mM）的LB-氨苄青霉素琼脂平板（见材料表）。挑取单个转化后的E. coli菌落接种至50 mL培养基中，用于纯化突变质粒DNA以进行后续分析。突变结果通过外部机构的DNA测序予以确认。</li>
</ol>
6. 表达与蛋白纯化
<ol>
	<li>进行大规模培养时，用转化平板上的单个菌落接种少量含氨苄青霉素的 LB 培养基。</li>
	<li>利用过夜培养物接种表达培养物，并加入添加剂，如 10 mM MgCl2、10 mM MgSO4 和 20 mM 葡萄糖，将种子培养物稀释至 1/100。
	<ol>
		<li>在 37 °C 下剧烈振荡培养细胞，使其在冷却至 20 °C 前生长至 600 nm 处吸光度（Abs）为 0.4–0.6（对数中期）。加入 1 mM IPTG 诱导，并继续培养过夜。</li>
		<li>随后，在 4 °C 下以 4,000 × g 离心 15 分钟收集细胞，并用移液器弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液中，并在 4 °C 下以 4,000 × g 再次离心 15 分钟，然后用移液器弃去上清液。将剩余沉淀重悬于 10 mL 裂解缓冲液中，在 37 °C 下孵育 1 小时。 
	注意：裂解缓冲液的组成如下：（50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、2% Triton-X100、500 ng/mL 溶菌酶、1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）、1 mM 二硫苏糖醇、1 mM MgCl2，pH 8，参见 材料表）。
	<ol>
		<li>将混合物进行两次冻融循环（-80 °C），然后在 4 °C 下以 4,000 × g 离心 15 分钟，分离可溶性与不溶性组分，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），特别是十二烷基硫酸钠（SDS）-PAGE33（图 2B、C）进行分析。 
		注意：细胞可通过多种方式裂解，例如冻融、超声处理、均质化、酶解裂解，或上述方法的组合。建议从包涵体中纯化以获得较高的蛋白产量26。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 Ni-NTA 柱层析法纯化蛋白（参见 材料表）。将可溶性组分以 1 mL/min 的流速上样至再生的 Ni-NTA 微珠柱。在开始梯度洗脱（在 60 分钟内使用含 0–100% 500 mM 咪唑的 TBS 缓冲液）并收集组分（1 mL/min）前，先用 TBS 缓冲液（50 mM Tris、150 mM 氯化钠，pH 7.5）洗涤系统。将纯化后的蛋白在 100 mM PBS 中透析，用于生化表征（图 2C、D）。</li>
	<li>或者，可在 14 mL 管中使用 His-Select Ni2+ 亲和凝胶（参见 材料表），分别在含 20 mM 和 250 mM 咪唑的缓冲液中结合并重悬带有 His 标签的重组表达的 CV-N。批式孵育至少 30 分钟。 
	注意：可将这些半纯化蛋白应用于一次性预装柱，以进行缓冲液置换及生物样品（例如碳水化合物和蛋白质）的净化，该柱可承载来自固定化金属亲和层析的 1–1.5 mL 洗脱液。</li>
	<li>将蛋白溶液转移至含有 10 kDa 截留分子量滤膜的离心管（参见 材料表），在 4 °C 下以 4,500 × g 离心 10 分钟进行浓缩。对于 SPR 测量，将分析物溶液置换为 10 mM HEPES、150 mM 氯化钠、3 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）和 0.05% Tween20，pH 7.4（HBS-EP(+)，参见 材料表）。
	<ol>
		<li>将 SPR 运行缓冲液按 1:10 稀释，加至初始体积，于 4 °C 下以 4,500 × g 离心 4 次，每次 10 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基于主蛋白 CVN2L0 的计算消光系数（20,440 M-1 cm-1，分子量为 23,474 Da34），使用 NanoDrop 紫外-可见分光光度计（参见 材料表）在 280 nm 处测定蛋白浓度。以 PBS（100 mM，pH 7.0）或 SPR 缓冲液作为空白对照，测量三个稀释梯度（1:1、1:10 和 1:100）下的蛋白浓度。</li>
</ol>
<img alt="域交换二聚体CV-N结构、SDS-PAGE结果及吸收色谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63541/63541fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：CV-N序列与表达。（A）在大肠杆菌（E. coli）中，使用pET11a载体表达无连接肽的CVN2（每个CV-N重复单元含101个氨基酸残基），并具有四个二硫键。（B）CV-N（单体）和CVN2（二聚体）两个独立克隆的表达情况。（C）二硫键突变体经纯化后进行SDS-PAGE分析。使用低分子量标记物（6 µL）作为参照。WT = CVN2L0，含有如（A）中标注的四个二硫键。V2为在58和73位点由极性残基取代二硫键的变体。V3-V5为保留两个S-S键的变体，分别引入极性（C58E-C73R）或非极性（C58W-C73M）替代氨基酸，或这些残基对替代的组合。（D）纯化的CVN2L0通过HPLC色谱分析，流速为1 mL/min，在30分钟内以缓冲液A中5%-65%的缓冲液B进行线性梯度洗脱。缓冲液A为：ddH2O中含0.1%（v/v）三氟乙酸；缓冲液B为：乙腈中含0.08%（v/v）三氟乙酸。蛋白在高性能硅胶300-5-C4（150 x 4.6 mm）柱上于214 nm和280 nm处检测。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63541/63541fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
7. 表面等离子体共振光谱法
<ol>
	<li>使用双通道 SPR 系统（见材料表），以 HBS-EP(+) 作为运行缓冲液，10 mM 盐酸甘氨酸（pH 1.5–1.6）作为再生缓冲液。开启仪器、脱气装置、自动进样器和泵，用 ddH2O 清洗整个系统 1 小时。将准备好的运行缓冲液置于单独的瓶中。</li>
	<li>在检测器上滴加浸油，然后将玻璃传感器芯片（见材料表）安装至三通道流通池下方的检测器上，该芯片表面镀有薄金膜，并在上侧功能化修饰了羧甲基葡聚糖水凝胶。通过下拉操作手柄固定装置。 
	注意：C19RBDHC30M 200 nm 链霉亲和素衍生的羧甲基葡聚糖水凝胶芯片，其表面生物素化的严重急性呼吸综合征冠状病毒-2 受体结合域蛋白为中等密度，是一种配体已预先固定化的即用型传感器芯片。</li>
</ol>
8. CV-N 与 HA、S 蛋白和 RBD 结合的 SPR 结合实验
<ol>
	<li>按照以下步骤将蛋白质类配体固定到传感器芯片上。
	<ol>
		<li>单击以打开运行表格 表格 在菜单栏中 运行表格编辑器 在集成的 SPRAutoLink 软件中（参见 材料表）。选择并点击 基础_固定化 从可用的运行表列表中选择，并按照计算机屏幕上显示的实验步骤进行操作。所使用的相应样本编辑器显示在右上角。</li>
		<li>点击 样本集编辑器 在“表单”部分填写自动进样器中两个样品架的试剂列表，以进行后续分析。点击 自动进样器直接控制 在菜单栏中选择“工具”以将架子向前或向后移动至原位。选择 4 °C 作为操作温度。 
		注意：SPR 软件支持“SPR 仪器直接控制”和“泵直接控制” 通过 选择相应的工具，以及自动进样器操作，并通过点击 表格；也 运行表格编辑器，数据-绘图，或 后期处理 可选择进行数据分析。文件将直接保存在默认目录中，并从“后处理”窗口导出为 scrubber.files。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动泵以注入ddH₂O20，通过单击 工具 和 泵直接控制 并点击记录数据 SPR 仪器直接控制，每次 开始 在新出现的窗口中。将偶联试剂（步骤 8.3）放入 300 µL 小瓶，放入自动进样器架中，然后通过点击运行表开始 运行. 
	注意：芯片表面可使用 10 mM 甘氨酸缓冲液（pH 9.0）进行预处理，或用 1 M 氯化钠和 0.1 M 硼酸钠缓冲液（pH 9.0）冲洗，以对羧基修饰的芯片表面进行预处理，便于后续 EDC/NHS 活化混合反应30.</li>
	<li>对于这种简单的蛋白质-蛋白质相互作用，使用 CMD500D 芯片（参见 材料表) 以生成微折射率单位（µRIU) = 2500 - 3000 流通池，固定化 HA 和 µRIU = 400 芯片通道中加入刺突蛋白。以灌注流速 15 µL/min，通过执行以下连续步骤，注入0.4 M盐酸N-乙基-N'-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC*HCl）与0.1 M N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的等体积水溶液混合物。
	<ol>
		<li>泵补充液补充于 25,000 µL/min，进行30秒的基线调整，然后注入 90 µL 在6分钟接触时间内加入样品活化溶液（EDC/NHS），然后继续孵育5分钟。</li>
		<li>在基线运行1分钟后重复此循环 10 µL/min 仅在左侧流动池（蓝色）中注入并固定化学合成的多肽10，HA 和刺突蛋白在 20 µg/mL，并允许后续使用ddH₂O进行基线校正2O持续1.5分钟，然后用1 M盐酸乙醇胺（pH 8.5）淬灭活化的芯片表面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将管路从液体进样器切换至ddH₂O脱气装置20 加入含 HBS-EP(+) 的瓶中（补充图1).</li>
	<li>分析 SPR 传感图。
	<ol>
		<li>为了进行动力学研究，使用不同浓度的分析物（10-5-10-8 M），每次进样后进行再生步骤，并在不同分析物检测后进行空白测量。改变流速至 10 µL/min 开始注射，接触时间为4分钟，随后进行5分钟的基线生成，接着进行两次再生步骤，每次2分钟，间隔30秒。</li>
		<li>注入缓冲液溶液进行空白测量，其传感器图将从样品运行中扣除，以校正不同的蛋白质浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击 表格，向下滚动，通过点击此操作模式切换为“Post-Processing”。点击 添加 在数据绘图界面中，为每个流动池选择随时间生成的结合曲线，并将叠加图导出为scrubber文件（.ovr）。点击“File”以打开文件保存选项。通过比对并左对齐和右对齐曲线，从配体通道信号中减去第二参考通道信号，获得响应曲线。 
	注意：数据通过计算方式在“后期处理”中对传感图进行定义，可呈现为左右两个流动池传感图的叠加，或表示为两个通道差值的传感图。</li>
	<li>在结合测量前后，使用 50–100 mM pH 9.5 甘氨酸缓冲液、水和 20% 乙醇彻底清洗整个流体系统，以去除盐分或蛋白质污染残留；必要时可采用更严格的清洗方式，使用 0.5% SDS 和甘氨酸缓冲液。 
	注意：若芯片在缓冲液中或100%湿度条件下储存，在将芯片盒重新插入仪器前，建议检查玻璃芯片的机械稳定性，以防止仪器损坏。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

CV-N 的结合亲和力与其功能性结合位点的数量相关 [2H 位于 B 结构域，2L 位于经工程化改造为结构域交换二聚体时的 A 结构域]。一种结合亲和力改变的变体（CVN2L0-V2，一种包含二硫键敲除的同源二聚体稳定折叠构型的 CV-N）在 E. coli，经纯化，并通过表面等离子共振（SPR）检测证实可特异性结合HA蛋白（H3N2）10，且在H或L碳水化合物结合位点与HA结合时发生构象变化，并伴有KD1 = 49 nM 和 KD2 = 8 µM38随着CVN2中糖链靶向口袋附近的二硫键数量从4个减少到2个，其与HA蛋白的结合亲和力降低（图3B-D 和 补充表1）。通过将半胱氨酸（Cys）进行替换，并插入极性残基对Glu - Arg，可构建二硫键变体，其稳定性略有降低。除上述改变外，这些变体代表相同的分子，且四个结合位点...

由干扰素-α诱导的与tetherin相关的抗病毒活性包含基于蛋白质的锚定结构，可导致完全形成的病毒颗粒滞留在感染细胞表面1. 束素蛋白糖基化在抑制病毒释放中的必要性仍不明确，提示糖基化模式对重组表达的糖链功能具有重要意义 体外 研究1,2，这取决于（以流感病毒为例）表面表达的流感血凝素HA的构象3,4已发现，N-连接糖基化位点上连接的寡糖修饰足以介导tetherin对1型人类免疫缺陷病毒释放的限制作用2，而二聚化在阻止病毒释放过程中起着关键作用，因此涉及跨膜区或糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定结构，以锚定出芽的病毒颗粒5人类和小鼠tetherin的独特特征可抑制多种包膜病毒、逆转录病毒和丝状病毒。BST-2/tetherin是先天免疫系统中一种由干扰素诱导的抗病毒蛋白1,6，具有广谱抗病毒活性，且可被包膜糖蛋白拮抗5 转运tetherin或破坏tetherin的结构6例如，甲型流感病毒表面表达的包膜糖蛋白HA和神经氨酸酶在不同毒株中以毒株特异性方式发挥牵连蛋白拮抗作用7，有助于识别宿主受体结合位点8糖类靶向抗体与其在血凝素（HA）上快速定制的糖类保护层之间的相互作用化学计量关系被用于研究，从而产生对甲型流感病毒H3N2和H1N1亚型的结合亲和力4.
为阐明抗病毒药物与病毒包膜刺突（即糖类配体）之间的结合机制，采用单一、双重及三重甘露糖基团的化学合成方法，并结合免疫学与光谱学手段，制备甘露糖化肽 通过 β-乙酰基糖基叠氮化物的叠氮糖基化反应转化为1,2-反式糖基叠氮化物9，模拟危及生命的病毒表面常见的N-乙酰葡萄糖胺和高甘露糖型寡糖。采用三唑类生物等排体来模拟构成血凝素肽甘露糖基化残基的连接结构10 并促进抗病毒CV-N衍生物在HA头部结构域第二个N-连接糖基化位点（HA顶端，含4个N-连接糖链N54、N97、N181、N301）周围的特定位点相互作用8,11,12谷氨酸（Glu）与精氨酸（Arg）之间的相互作用及其所导致的螺旋偶极效应表现出两种模型肽和蛋白质的良好稳定性，但需通过表面等离子共振（SPR）进行可视化。若与识别HA上单一化学合成的糖基化位点相比较10 通过直接抑制糖链部分上的受体结合，一种四点突变的Fc结构对其受体表现出更高的亲和力，从而引发效应功能 体内，揭示了与Fc突变体相连的N-连接聚糖的非相关组成是由机制决定的13.
CV-N 对 HIV14,15、流感病毒16 和埃博拉病毒具有抗病毒活性，其作用机制是通过纳摩尔级结合包膜刺突蛋白上的高甘露糖型寡糖修饰12,17,18,19。流感病毒血凝素（HA）与 CV-N 中的一个高亲和力碳水化合物结合位点（H）或共价连接的二聚体 CVN2 中的两个 H 位点结合，其平衡解离常数（KD）分别为 5.7 nM（图 1A）和 KD = 2.7 nM。CV-N 和 CVN2 还各含有一个或两个低亲和力碳水化合物结合位点（L）12,17,20,21。埃博拉病毒 GP1,2 与 CVN2 的两个 H 位点（2H）结合，亲和力处于较低的纳摩尔范围（KD = 26 nM）。野生型 CV-N 与埃博拉病毒 GP1,2 和 HA 的结合亲和力范围为 KD = 34 nM 至 KD = 5.7 nM（A/New York/55/04）12。凝集素（如 CV-N）可特异性靶向病毒包膜上的高甘露糖型糖链，进一步抑制丙型肝炎病毒、SARS-CoV、疱疹病毒、马尔堡病毒和麻疹病毒的复制22。
小分子CV-N已被深入研究超过20年，因其能够结合多种病毒，从而抑制病毒进入细胞16,18结构分析和结合亲和力测定表明，二价结合在微摩尔范围内可促进两个L链在结构域交换的CVN2二聚体中交联，从而增强对病毒包膜糖蛋白的结合力10,19Manα1-2Manα 在 Man(8) D1D3 支链和 Man(9) 上的选择性结合包含两个位于相反蛋白原体上的不同亲和力结合位点20，从而达到纳摩尔级的结合亲和力（图1B因此，CVN2 被视为一种拟抗体，可用于结合 HIV gp120 上的表位，作用类似于病毒中和抗体。17在此，作者旨在研究CVN2与SARS-CoV-2刺突蛋白潜在的结合能力 通过 其受体结合域（RBD）。固定化的人血管紧张素转换酶2（ACE2）与SARS-CoV-2 RBD结合的结合曲线得到KD = 4.7 nM，针对此具有生物学意义的结合相互作用23.
相比之下，某些免疫球蛋白类别可识别特定且稳定的结构蛋白模式，这些模式为膜锚定的HA区域中的亲和力成熟提供了底物24。CV-N在几乎所有甲型和乙型流感病毒中均表现出强效活性16，是一种广谱中和性抗病毒剂。目前对于HA1和HA2茎部区域上靶向表位的具体位置仍了解不足，这些区域可能包含高效中和抗体识别的糖链靶向表位结构，并可与凝集素结合方式进行比较25。
<img alt="表面等离子体共振光谱；CV-N结合病毒蛋白；动力学分析；示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：CV-N与病毒包膜刺突蛋白结合的表面等离子体共振（SPR）检测示意图。（A）CV-N与配体HA全长蛋白（90 kDa）结合的SPR检测。动力学数据集（5120、2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、0 nM），显示CV-N与固定化的流感病毒HA A/New-York/55/04（H3N2）实时双参考结合曲线。（B）CVN2L0变体V2在500 nM至16 µM浓度范围内与固定化配体DM的结合情况。序列中，L残基以黄色高亮，H残基以灰色高亮。E58和R73取代了野生型蛋白中的半胱氨酸，使V2形成具有三个而非四个二硫键的稳定蛋白构象。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
膜远端HA顶端的聚糖屏障可诱导其与CV-N的高亲和力结合12，此外，CVN2与HA顶端二硫键邻近区域的低亲和力结合位点也已被观察到10,12。在CV-N介导的碳水化合物结合过程中，已鉴定出多种极性相互作用及相互作用位点。这些相互作用通过在结合位点构建敲除突变体，并将其结合亲和力与in silico预测的糖基化模式进行关联分析而得以验证12。因此，本项目旨在比较先前测试的化学甘露糖基化HA肽段与SARS相关2019-nCoV刺突蛋白及SARS-CoV-2中天然存在的、仅含少数不同N-连接和O-连接糖基化位点的短肽序列在结合亲和力和特异性上的差异。Pinto及其同事利用冷冻电子显微镜和结合实验报道了一种单克隆抗体S309，该抗体可能识别Sarbecovirus亚属中SARS-CoV-2刺突蛋白上包含保守糖链的一个表位，且不干扰受体结合26。本研究的实验方案描述了设计、表达和表征CV-N突变体的方法，这对于利用SPR技术研究CV-N和CVN2如何与糖基化蛋白及合成甘露糖基化肽段结合具有重要意义10,12。
串联连接的二聚体 CVN2L027 及其结合位点变体（V2-V5）通过重组表达获得，其中部分变体含有二硫键替换（C58E 和 C73R）（图 2A）。此外，还制备了在 E41A 位点发生单点突变的突变体，因为该位点被认为是分子间交叉接触的关键残基。该突变体是表面等离子共振（SPR）结合实验中研究凝集素与高甘露糖型寡糖之间相互作用的另一种重要分子，可用于解析结合结构域，并与二聚体形式进行比较。CVN2 的结构域交换晶体结构显示其连接区具有柔性，长度介于 49 至 54 个残基之间。两个结构域可作为刚性体围绕铰链区域自由运动，通过分子内结构域相互作用形成单体（结构域 A：残基 1-39 和 90-101；结构域 B：残基 40-89），或通过分子间结构域交换形成二聚体［第一个单体的结构域 A 与第二个单体的结构域 B 配对，第一个单体的结构域 B 与第二个单体的结构域 A 配对］。除 Glu4128 外，两个原体的结构域 A 与 B 之间不存在紧密的相互作用。CV-N 基因可通过重复 PCR 方法构建，使用合成的 40-mer 寡核苷酸片段29，随后亚克隆至 pET11a 载体的 NdeI 和 BamHI 位点，并按 Keeffe, J.R.27 所述方法通过电穿孔转化至电感受态细胞中。用于解析相应晶体结构（PDB ID 3S3Y）的蛋白在其 N 端包含一个 6×组氨酸纯化标签，其后接一个 Xa 因子蛋白酶切割位点。定点突变技术被用于引入点突变、改变密码子，或插入或删除单个或多个碱基/密码子以实现氨基酸替换。这些改造为理解蛋白质功能与结构提供了宝贵信息。重组表达并纯化的 CV-N、CVN2 和 CVN3 已在生物物理层面得到深入研究20,21,27，且生产成本低廉，因此被广泛用于表征结合在 SPR 传感器芯片上的糖类配体的结合实验。传统的酶联免疫吸附测定（ELISA）在糖配体固定化技术方面重现性较差，且将 SPR 所能呈现的实时结合过程转化为终点检测，无法动态反映不同结合位点变体的结合行为。
结合亲和力变异体 CVN2L0-V2（具有二硫键替换的完整同源二聚体 CV-N 折叠结构）10) 在带有 His 标签的情况下表达 大肠杆菌 (E. coli), 通过镍-NTA亲和层析柱纯化，并利用表面等离子共振技术检测其与HA（H3N2）、单甘露糖基化HA肽段及双甘露糖基化HA肽段的结合能力。化学甘露糖基化的肽段、HA蛋白和S蛋白均作为配体，通过胺偶联法固定于亲水芯片表面 通过 活性酯或生物素-链霉亲和素蛋白工程。对这些配体采用相同的连续运行程序，注入不同稀释浓度的CV-N及其变体（以及CVN2），以获得分子相互作用分析的动力学信息，如下所述。30使用RBD固定的SPR传感器芯片进行CV-N与S肽的结合研究，并将亲和力与SARS-CoV-2与人ACE2的结合进行比较。

<table><tbody><tr><td>&amp;Auml;kta primeplus</td><td>Cytiva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon 离心管</td><td>Merck</td><td>C7715</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5354</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Cooler Allegra X-30R 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>B06320</td><td></td></tr><tr><td>涂布棒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HS86655</td><td>银质不锈钢，棒长 33&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>定制 DNA 寡核苷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>OLIGO</td><td></td></tr><tr><td>定制基因合成</td><td>GenScript</td><td>#1390661&amp;nbsp;</td><td>克隆载体：pET27b(+)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cytiva&amp;nbsp;HBS-EP+ 缓冲液 10, 4x50 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>50-105-5354</td><td></td></tr><tr><td>Dionex UlitMate 3000</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAAGABHFAPBMBFB</td><td></td></tr><tr><td>Dpn I 限制性内切酶 (10 U/&amp;mu;L)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>ER1701</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Merck</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Merck</td><td>39391</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 管</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 管</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Minispin&amp;nbsp;和 MiniSpin Plus 微型离心机</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z606235</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Merck</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>乙醇胺盐酸盐</td><td>Merck</td><td>E6133</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14 mL 圆底聚苯乙烯试管，带卡扣盖，无菌，25 个/包</td><td>Corning</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Merck</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸盐酸盐</td><td>Merck</td><td>55097</td><td></td></tr><tr><td>HA H3 蛋白</td><td>Abcam</td><td>ab69751</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>His-select Ni²⁺</td><td>Merck</td><td>H0537</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Merck</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Merck</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1377</td><td></td></tr><tr><td>Kromasil 300-5-C4</td><td>Nouryon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td>Merck</td><td>52062</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td>Merck</td><td>19344</td><td></td></tr><tr><td>LB Lennox</td><td>Merck</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Merck</td><td>10837059001</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Merck</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Merck</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop UV-Vis 2000c 分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>NHS</td><td>Merck</td><td>130672</td><td></td></tr><tr><td>NZ 胺（酪蛋白水解物）</td><td>Merck</td><td>C0626</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck</td><td>806552</td><td></td></tr><tr><td>PD MidiTrap G-10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE28-9180-11</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Merck</td><td>70171</td><td></td></tr><tr><td>pET11a</td><td>Merck Millipore (Novagen)</td><td>69436&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Merck</td><td>PMSF-RO</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 (1000)</td><td>Qiagen</td><td>27106X4</td><td></td></tr><tr><td>Reichert 软件包 Autolink1-1-9</td><td>Reichert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reichert SPR SR7500DC 双通道系统</td><td>Reichert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于数据分析的 Scrubber2-2012-09-04</td><td>Reichert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Merck</td><td>11667289001</td><td></td></tr><tr><td>定点突变试剂盒（含 pUC18 对照质粒）</td><td>Stratagene</td><td>#200518</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Merck</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠三水合物</td><td>Merck</td><td>236500</td><td></td></tr><tr><td>SPR 传感器芯片 C19RBDHC30M</td><td>XanTec bioanalytics</td><td>SCR C19RBDHC30M</td><td></td></tr><tr><td>SPR 传感器芯片 CMD500D</td><td>XanTec bioanalytics</td><td>SCR CMD500D</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin 标准 90 mm 培养皿</td><td>Thermo Scientific</td><td>101R20</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td>Merck</td><td>T5912</td><td>10x 溶液</td></tr><tr><td>吐温-100</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Merck</td><td>93657</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Merck</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2 混匀仪</td><td>Merck</td><td>Z258423</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Merck</td><td>XGAL-RO</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue 超感受态细胞</td><td>Stratagene</td><td>#200236</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Merck</td><td>Y1625</td><td></td></tr></tbody></table>

设计抗病毒药物 通过 表面等离子体共振

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

表面等离子体共振（SPR）用于测量血凝素（HA）与结构域交换的蓝藻病毒素-N（CV-N）二聚体的结合，并监测甘露糖化肽与CV-N高亲和力结合位点之间的相互作用。已有报道指出，病毒包膜刺突蛋白gp120、HA和埃博拉糖蛋白（GP）1,2可结合于二聚体CVN2上的高亲和力和低亲和力结合位点。双甘露糖基化HA肽也被证实可结合至一种工程化CVN2分子的两个低亲和力结合位点，该分子含有针对相应配体的高亲和力结合位点，并通过突变将碳水化合物结合口袋中的稳定二硫键替换为极性残基对（谷氨酸与精氨酸），从而验证了多价结合的存在。HA与伪抗体CVN2的一个高亲和力结合位点结合，其解离常数（KD为275 nM，该结合可通过寡聚化进一步中和1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）。在结构域交换的CVN2中，通过将半胱氨酸替换为谷氨酸和精氨酸的极性残基对，二硫键数量从4个减少至2个，导致其对血凝素（HA）的结合亲和力降低。在已知最强的相互作用中，CVN2利用不含跨膜结构域的包膜糖蛋白，在低纳摩尔范围内通过两个高亲和力结合位点结合埃博拉病毒GP1,2。在本研究中，多特异性单体CV-N与严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）刺突（S）糖蛋白的结合亲和力测得KD = 18.6 &#181;M，与纳摩尔级的 KD 与其他病毒刺突蛋白相比，以及 通过 其受体结合域，处于中等微摩尔浓度范围&#181;微摩尔范围

二聚体结构域交换型CVN2L0分子在三次独立的表面等离子共振实验中检测其与血凝素顶部区域的结合能力，结合亲和力以K值表示D 值。假设B区包含氢键结合位点，这些位点在二硫键被替换为离子残基时会受到影响，而A区则形成L10,18首先通过单次注射CVN2L0及其变体V2（三个二硫键）和V5（两个二硫键）至HA偶联的传感器芯片，检测其结合能力，以评估结合容量，随后使用自动进样器和运行表编辑器设置动力学测定图3A 和 补充图2）。在纳米摩尔浓度范围内，对一系列CVN2L0、V2和V5进行重复注射的自动化操作 µ-摩尔范围随时间在系统中的变化（图3B- D）。通过关联完整Cys-Cys键的数量，CVN2L0与固定的HA结合，其结合常数为KD = 255 nM 时达到良好饱...

本方案介绍了用于 SPR 结合分析的新工具，以研究 CV-N 与 HA、S 糖蛋白、相关杂合型聚糖以及高甘露糖寡糖的结合。SPR 用于测定二聚体或单体 CV-N 与这些聚糖结合的 KD 值。

表面等离子共振（SPR）用于检测血凝素（HA）与结构域交换的蓝藻病毒素-N（CV-N）二聚体的结合，并监测相互作用……

表面等离子体共振光谱法已用于中等通量条件下检测介质中的蛋白质配体。该方法展示了同一分子不同结合位点变体的结合亲和力差异，特别是病毒上铁结合型高甘露糖寡糖的结合特性。SPR是一种无需标记的实时检测技术，可用于研究固定在表面的受体与大分子之间的相互作用。在动力学分析中，无论研究中的特定区域大小如何，多结合位点相互作用均可通过竞争性结合来识别。表面等离子共振（SPR）的应用领域包括药物开发中的抑制剂筛选以及抗体表征。动力学常数和亲和力可直接从传感器响应值计算得出。实验开始时，将100 µL溶液转移至LB-琼脂平板上，使用无菌涂布棒轻轻涂布均匀。使用双链DNA模板进行一系列样本反应，模板浓度范围为5至50纳克，同时保持引物浓度恒定。然后在矿物油覆盖层下方加入DpnI限制性内切酶，并立即在37摄氏度孵育一小时，以消化亲本的超螺旋双链DNA。解冻XL1-Blue超感受态细胞时，将细胞分装至预冷的小型圆底离心管中。接下来，将每个对照和样品反应中经 DpnI 处理的单链 DNA 各取一微升，分别转移至合成互补链的超感受态细胞分装管中。轻轻涡旋混匀转化反应体系后，将反应物置于冰上孵育 30 分钟。随后在 42 摄氏度条件下对转化反应进行 45 秒的热激处理，再将反应物放回冰上放置 2 分钟。然后加入 0.5 毫升 NZY+ 培养基，将转化反应物在 37 摄氏度下振荡培养 1 小时，转速为 225 至 250 转/分钟。随后，按照之前所示方法，将每种转化反应的适当体积涂布于 LB 氨苄青霉素琼脂平板上。对于种子培养，从转化平板上挑取单菌落，接种至含氨苄青霉素的 LB 培养基中进行小量培养。使用过夜培养物接种表达培养液，添加物包括10毫摩尔的氯化镁、10毫摩尔的硫酸镁和20毫摩尔的葡萄糖，将种子培养物按1:100稀释。随后，在37摄氏度下剧烈振荡培养细胞，使其在600纳米处的吸光度达到0.4至0.6，然后将细胞冷却至20摄氏度，加入1毫摩尔的IPTG进行诱导，并继续培养过夜。接着，在4摄氏度下以4,000 g离心15分钟收集细胞，并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于磷酸盐缓冲液中后，在4,000 g、4摄氏度条件下离心15分钟。然后用移液器弃去上清液。接着将剩余沉淀重悬于10毫升裂解缓冲液中，并在37摄氏度孵育1小时。然后在4°C下以4,000 g离心15分钟，分离可溶性和不溶性组分。此外，使用HIS-Select Ni2+亲和凝胶分别装入14毫升离心管中，用于结合并重悬在含有20毫摩尔咪唑和250毫摩尔咪唑的缓冲溶液中表达的组氨酸标签重组氰病毒素-N。各步骤之间需进行至少30分钟的批式孵育。加入含有 250 毫摩尔/升咪唑的洗脱缓冲液以洗脱蛋白质。将蛋白质溶液转移至截留分子量为 10 千道尔顿的超滤管中，在 4,500 ×g 及 4 °C 条件下离心 10 分钟进行浓缩。用 SPR 运行缓冲液按 1:10 的稀释比例稀释，并在 4,500 ×g 及 4 °C 条件下每次离心 10 分钟，重复四次，浓缩至初始体积。随后，根据主要蛋白质 CVN2L0 的计算消光系数（其分子量为 23,474 道尔顿），使用 NanoDrop 紫外-可见分光光度计在 280 纳米处测定蛋白质浓度。对于双通道 SPR 系统，使用 HBSCP plus 作为运行缓冲液，pH 1.5 至 1.6 的 10 毫摩尔甘氨酸盐酸缓冲液作为再生缓冲液，并开启仪器的脱气装置、自动进样器和泵。然后用双蒸水清洗整个系统一小时。接下来，在检测器上滴加浸油，并将涂有薄金膜且上表面经羧甲基葡聚糖水凝胶功能化的玻璃传感器芯片直接安装到三通道流通池下方的检测器上。然后通过向下拉动操作手柄固定装置。为了将蛋白质配体固定到传感器芯片上，请在菜单栏中点击“Form”，打开集成SPP自动链接软件中的运行表编辑器。然后从可用的运行表列表中选择并点击“Basic Immobilization”，并按照计算机屏幕上显示的实验步骤进行操作。接下来，在表单部分点击“Sample Set Editor”，填写自动进样器中两个样品架所用试剂的列表，以进行后续分析。在菜单栏中点击“自动进样器直接控制”工具，将样品架移出或移回原位，并将运行温度设为四摄氏度。通过点击“工具”和“泵直接控制”启动泵，以注入双蒸水。通过点击“SPR 仪器直接控制”来记录数据。每次操作均需在新出现的窗口中开始。将偶联试剂加入300 µL小瓶后，将其放入自动进样器样品架中，并点击“运行”以启动运行表。对于简单的蛋白质-蛋白质相互作用，在以25,000 µL/min流速重新填充泵后，进行30秒的基线校正。用双蒸水进行1.5分钟的后续基线调整，然后用1摩尔的盐酸乙醇胺（pH 8.5）淬灭活化的芯片表面。接着，将液体进样器中的管路从双蒸水切换至脱气装置中的HBS-EP+溶液瓶；点击表单，向下滚动，通过点击此操作模式切换至“后处理”。然后点击“添加”，以选择数据平台中每个流动池随时间生成的结合曲线，并将叠加图导出为scrubber文件。接下来，单击“文件”以打开文件保存选项，通过将左侧和右侧曲线对齐，并从配体通道信号中减去第二参考通道的信号，获得响应曲线。首先使用自动进样器和运行表编辑器，测试 CVN2L0 以及 V2 和 V5 变体单次注射与偶联血凝素的传感器芯片的结合情况，以估算结合容量。在系统中随时间对不同浓度（纳米摩尔至微摩尔范围）进行重复注射，结果表明芯片表面未达到饱和，也未实现平衡结合。绘制了CVN野生型与RBD结合的浓度-响应曲线，假设其特异性靶向RBD S1亚基上可能保守的碳水化合物，其亲和力较弱，解离速率常数为260微摩尔。CVN2L0-V4与DM结合的相同亲和力曲线由于二硫键被替换，干扰了其与小分子糖基化肽段的高亲和力结合，导致响应值超过最大响应值，因而无法再进行分析。CVN野生型与SARS-CoV-2的RBD结合显示，其对S蛋白和RBD的解离速率常数分别为18.6微摩尔和260微摩尔。尽管分析物浓度的 SPR 响应会产生较高的响应单位，CVN 野生型和 E41A 结合的典型 SPR 传感图也是如此。然而，该突变体在稀释时不稳定。SPR 生物传感可用于研究纯化蛋白及其变体与配体的高亲和力和低亲和力结合。在本例中，糖蛋白利用传感器芯片表面的光学读出和双通道流动系统。酶联免疫吸附测定作为一种替代性免疫学方法，不仅可识别蛋白质表位，还能提供复杂基质中肽段和小分子浓度的数据。通过表面等离子共振（SPR）结合实验检测重组表达的蛋白质，可实现对构象变化的生物传感，这在利用计算蛋白质学方法验证和预测蛋白质稳定性方面具有重要意义。

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