Name: 小鼠原代视网膜色素上皮细胞的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: 学习从小鼠眼球中分离原代视网膜色素上皮细胞的简化实验方案。该方法通过酶解处理和显微解剖技术获取具有活性的RPE细胞，适用于研究视网膜疾病和血-视网膜外屏障功能。

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本工作由国家眼科研究所（NEI）及国家眼科研究所（NEI）基金R01 EY029751-04资助。我们感谢Pamela Martin博士在RPE分离初期阶段提供的帮助。

动物使用遵循奥克兰大学IACUC动物实验方案编号21063以及眼科与视觉研究中动物使用ARVO声明的指导原则。
1. 溶液配制
<ol>
	<li>通过在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基/F-12 营养混合物（DMEM/F12）中添加 25% 胎牛血清（FBS）、1.5% 青霉素/链霉素和 0.02% 庆大霉素，配制完全的 RPE 细胞培养基。</li>
	<li>通过将 741 µL 的 Hank 平衡盐溶液（HBSS）与 127 µL 胶原酶储备液和 132 µL 透明质酸酶储备液混合，配制酶 A。最终体积为 1 mL，可用于处理四只眼睛。
	<ol>
		<li>通过将 1 mg 来自Clostridium histolyticum的胶原酶溶解于 41 mL HBSS 中，配制胶原酶储备液（19.5 单位/mL）。</li>
		<li>通过将 1 mg 来自牛睾丸的透明质酸酶溶解于 18.4 mL HBSS 中，配制透明质酸酶储备液（38 单位/mL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将两份 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 与三份 HBSS 混合，配制酶 B。注意总体积取决于解剖的眼数；1 mL 酶 B 可用于处理四只眼睛。</li>
</ol>
2. 去核
<ol>
	<li>使用二氧化碳（CO₂）以符合伦理的方式对小鼠实施安乐死2) 吸入，依据IACUC标准21.
	<ol>
		<li>简而言之，将动物放入 CO2 腔室以引入100% CO2 以每分钟30%–70%的腔室体积速率用CO填充2 在2至3分钟内使小鼠失去意识，同时尽量减少其痛苦。</li>
		<li>确认死亡（无呼吸且眼球颜色变暗）后，将小鼠从笼中移至清洁的灭菌手术区域（用酒精擦拭），该区域需配备灭菌的手术器械。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠置于无菌垫上。</li>
	<li>用5/45型镊子按压眼眶区域以诱导眼球突出，随后将镊子移至眼球后方。轻柔牵拉眼球，连同完整的视神经一起从眼眶中摘出。</li>
	<li>用镊子将眼球放入含有1 mL 5%聚维酮碘的2 mL微量离心管中，室温孵育2–3分钟。</li>
	<li>将眼球从聚维酮碘溶液中取出，放入培养皿中。使用无菌移液管，用HBSS清洗眼球，直至聚维酮碘的橙色消失。此过程大约需要清洗两到三次。</li>
	<li>将眼球置于新的60 mm培养皿中，并浸入步骤1.1中制备的冷（2-8 °C）完全RPE细胞培养基中。</li>
</ol>
3. 解剖
<ol>
	<li>在手术显微镜下，使用 M5S 型镊子和 Vannas 剪刀去除巩膜周围结缔组织和眼外肌。 
	注意：解剖操作应在组织培养罩内无菌环境中进行。但出于拍摄视频的目的，解剖显微镜被置于罩外以获得更高质量的演示/拍摄效果。在眼球下方放置一小块无尘纸巾可提高解剖过程中的稳定性。眼球随后可暂时保存于冷的 RPE 细胞培养基中（不超过 1 小时）。然而，建议在清洁眼球后立即进入下一步操作。</li>
	<li>将眼球转移至含有酶 A 溶液的 2 mL 微量离心管中，每四只眼球使用 1 mL 酶 A 溶液。随后将眼球置于 37 °C 培养箱中孵育 40 分钟。</li>
	<li>从培养箱和微量离心管中取出眼球，转移至另一含有酶 B 溶液的新微量离心管中，每四只眼球使用 1 mL 酶 B 溶液。将离心管置于 37 °C 培养箱中孵育 50 分钟。</li>
	<li>将眼球放入新的 60 mm 悬浮培养皿中，加入 10 mL 完全 RPE 细胞生长培养基，随后在 4 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>将培养皿置于手术显微镜下，开始解剖操作。</li>
	<li>将眼球前部（角膜、虹膜和晶状体）与眼杯后部（视网膜后部）分离。
	<ol>
		<li>用 M5S 型镊子夹住眼球，使用 #11 手术刀片或注射器针头在锯齿缘区域（视网膜最前部，浅蓝色终止处）做一切口。</li>
		<li>用一对镊子夹住切口内侧，另一对镊子夹住角膜，缓慢牵拉或撕开角膜与视网膜之间的连接。务必小幅度逐步撕裂，并在去除角膜过程中向下移动撕裂位置，以确保 RPE 层基本完整，获得更清晰的分离效果。 
		注意：角膜完全脱离后，即可观察到虹膜和晶状体。</li>
		<li>将角膜和虹膜分别分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过轻柔挤压眼球后半部分，将晶状体从眼杯中分离。</li>
	<li>为去除神经视网膜层，用一对镊子夹住眼杯外层，将另一对镊子的臂插入 RPE 层与神经视网膜层之间，轻轻牵拉或刮取神经视网膜，使其与 RPE 层分离。弃去神经视网膜。 
	注意：视频中神经视网膜与晶状体被一并移除。但对于初学者而言，分别单独移除会更容易操作。剩余部分为 RPE 层、脉络膜和巩膜。</li>
	<li>弃去角膜、虹膜、晶状体和神经视网膜，将剩余的眼杯转移至培养皿中无碎片的新区域。</li>
	<li>为将 RPE 层与脉络膜及巩膜分离，使用 5/45 型镊子轻轻刮擦眼杯内表面，以确保 RPE 细胞充分分离。RPE 细胞在完全 RPE 细胞生长培养基中悬浮时呈浑浊状。</li>
	<li>使用 3.2 mL 无菌移液管吸取细胞悬液，转移至含有完全 RPE 细胞生长培养基的新 15 mL 离心管中。</li>
</ol>
4. 离心
<ol>
	<li>将含有原代RPE细胞的15 mL离心管放入离心机中，在室温下以300 × g离心10分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并用10 mL完全RPE生长培养基重悬沉淀。完全RPE生长培养基对RPE细胞的生长比其他污染细胞（如Müller细胞或脉络膜内皮细胞）更具特异性。Müller细胞需要高糖培养基，而脉络膜内皮细胞则需要特定的生长因子。通过更换培养基并传代培养，只有RPE细胞会持续生长。</li>
</ol>
5. 细胞培养
<ol>
	<li>将重悬的原代RPE细胞接种至无菌的100 mm培养皿中，并放入培养箱孵育（在使用特异性RPE/穆勒细胞标志物对细胞进行染色以验证纯度后，按指示进行） 图1E-N。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下孵育2. 
	注意：所使用的标记物在文中已提及 材料表此步骤在培养建立后进行。</li>
	<li>将细胞孵育约5天以促进生长。在此期间，不要更换培养基、扰动细胞或移动细胞培养板（此步骤为本方案中的关键环节；细胞分离后应孵育且5天内不得扰动）。 
	注意：细胞数量取决于用于分离的眼数。分离的眼数越多，获得的细胞数量也越多。从两只眼中分离的视网膜色素上皮细胞（RPE）可获得约 440,000–880,000 个细胞，占可容纳 880 万个细胞的 100 mm 培养皿的 5%–10%。</li>
</ol>
6. 传代
<ol>
	<li>吸弃培养基，加入 2 mL PBS 洗涤，随后吸弃 PBS。</li>
	<li>加入 4 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1x），或足量覆盖培养皿底部的体积。于室温孵育 5–10 分钟。</li>
	<li>加入 8 mL 预热的 RPE 培养基，或加入步骤 6.2 中所用胰蛋白酶体积的两倍量。收集细胞并转移至 15 mL 离心管中。</li>
	<li>于室温以 300 x g 离心 7 分钟。吸弃上清液，将沉淀重悬于 10 mL 完全 RPE 细胞培养基中。将全部悬液接种至无菌 100 mm 培养皿中。 
	注意：细胞可传代四至五次18。然而，最稳定的实验结果通常出现在传代两到三次后。传代两到四次后，细胞形态发生变化（如 图 1D 所示），变得更为细长，聚集于培养皿中央，停止增殖并脱落。</li>
	<li>采用既往发表的方法8,14,15,16 中描述的免疫荧光实验方案，对细胞进行染色以验证其 RPE 特异性。</li>
</ol>
7. 免疫荧光
注意：免疫荧光染色按照先前发表的方法8,14,15,16,17,18进行，以染色并验证视网膜色素上皮（RPE）的特异性。原代RPE细胞的染色通常在P1和P2代进行。此处简要概述免疫荧光实验方案。
<ol>
	<li>将细胞接种于细胞培养腔室载玻片中（8孔腔室载玻片每孔接种30,000个细胞）。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下，使用完全RPE细胞培养基培养细胞24–48小时。</li>
	<li>当细胞融合度达到80%–90%时，吸除培养基，并用1× PBS清洗腔室载玻片。</li>
	<li>用4%多聚甲醛固定载玻片10–15分钟。</li>
	<li>吸除4%多聚甲醛，然后用封闭液（见材料表）进行封闭。</li>
	<li>吸除封闭液，加入一抗RPE65，在37 °C孵育3小时（抗体稀释比例为1:200–1:250，封闭缓冲液体积为每张载玻片150–200 µL）；随后用PBS/TX-100洗涤3次，每次5–10分钟。</li>
	<li>吸除一抗，加入二抗（抗体稀释比例为1:1,000，封闭缓冲液体积为每张载玻片150–200 µL），在37 °C孵育1小时。</li>
	<li>吸除二抗，用PBS/Triton X-100洗涤3次，每次5–10分钟。</li>
	<li>滴加一滴DAPI封片剂以标记细胞核，盖上盖玻片，确保盖玻片下无气泡。</li>
	<li>然后使用荧光显微镜配合高分辨率显微成像相机（HRM）及图像处理软件进行成像（见材料表）。</li>
</ol>

<ol><li>Young, R. W., Droz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+renewal+of+protein+in+retinal+rods+and+cones%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The renewal of protein in retinal rods and cones.</a> The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).</li>
<li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in health and disease.</a> Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).</li>
<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+recessive+retinal+dystrophy+associated+with+two+novel+mutations+in+the+RPE65+gene%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene.</a> European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).</li>
<li>Morimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+RPE65+gene+in+patients+with+autosomal+recessive+retinitis+pigmentosa+or+leber+congenital+amaurosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).</li>
<li>Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pigment+epithelial+lipofuscin+and+melanin+and+choroidal+melanin+in+human+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).</li>
<li>Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+human+RPE%3A+morphometric+analysis+of+macular%2C+equatorial%2C+and+peripheral+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).</li>
<li>Ibrahim, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperhomocysteinemia+disrupts+retinal+pigment+epithelial+structure+and+function+with+features+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration.</a> Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).</li>
<li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%3A+review+of+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration: review of pathogenesis.</a> European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).</li>
<li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARPE-19%2C+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).</li>
<li>Flannery, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+animal+models+for+the+study+of+inherited+retinal+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies.</a> ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).</li>
<li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li>
<li>Samra, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+N-Methyl-d-Aspartate+receptor+in+homocysteine-induced+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356(2021).</li>
<li>van Marum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+use+of+memantine+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychiatric+Disease+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Update on the use of memantine in Alzheimer's disease.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).</li>
<li>Elsherbiny, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homocysteine+induces+inflammation+in+retina+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Homocysteine induces inflammation in retina and brain.</a> Biomolecules. 10 (3), 393(2020).</li>
<li>Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homocysteine+and+age-related+central+nervous+system+diseases%3A+role+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259(2021).</li>
<li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997(2018).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+spontaneous+mouse+retinal+pigment+epithelial+cell+line+B6-RPE07%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).</li>
<li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2020).</li>
<li>Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPE65%3A+role+in+the+visual+cycle%2C+human+retinal+disease%2C+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Genetics%22%5BJournal%5D)">RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy.</a> Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).</li>
<li>Pérez-Álvarez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+isoform+expression+in+the+human+retina+characterized+with+the+monoclonal+antibody+3CB2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2.</a> Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).</li>
<li>Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+hyperhomocysteinemia+in+blood+retinal+barrier+%28BRB%29+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction.</a> Biomolecules. 10 (8), 1119(2020).</li>
<li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomethylfumarate+induces+%CE%B3-globin+expression+and+fetal+hemoglobin+production+in+cultured+human+retinal+pigment+epithelial+%28RPE%29+and+erythroid+cells%2C+and+in+intact+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).</li>
</ol>

作者声明不存在与本文内容相关的利益冲突。

本方案是一种已报道、经修改并简化的从小鼠眼球中分离视网膜色素上皮（RPE）细胞的详细操作流程。该方案包括小鼠眼球摘除、解剖、细胞收集、接种、培养以及从小鼠眼球中分离出的RPE细胞的鉴定。
成功的视网膜色素上皮（RPE）细胞分离存在一些限制因素和关键步骤，例如小鼠的年龄、解剖眼的数量、组织培养皿或培养板的尺寸，以及接种后在储存和传代过程中的注意事项。为了能够将分离的细胞传代三到四次，最佳的小鼠年龄为18至21天。为了获得足够数量且能够生长和增殖的分离细胞，单次分离至少需要两个眼球。分离所得的细胞数量与解剖的眼球数量成正比（约每眼220,000个细胞）。建议使用无菌的100 mm培养皿或培养瓶，以便在早期传代（P0）时获得较多细胞。接种后，至少5天内不应移动培养板或将培养板从培养箱中取出，也不应更换培养基。&#160;此外，该技术的另一个局限性在于分离细胞的保存和传代。细胞不能冷冻保存后再复苏使用，且最多只能传代三到四次。传代超过第4代后，细胞开始改变其大小和形态，变得细长（呈纺锤形），同时细胞色素明显减少（图1D）。...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion&#160;section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
<ol start="24">
	<li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).</li>
</ol>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.

Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

视网膜色素上皮（RPE）细胞位于脉络膜与神经视网膜之间，形成一层简单的立方形细胞单层，位于光感受器（PR）细胞后方1视网膜色素上皮（RPE）在维持光感受器细胞的健康环境中起着关键作用，主要通过减少活性氧（ROS）的过度积累及其引发的氧化损伤来实现。1.&#160;视网膜色素上皮细胞（RPE）负责多种功能，包括视黄类物质的转化与储存、散射光的吸收、液体和离子的转运，以及对脱落的光感受器外节膜进行吞噬。2,3视网膜色素上皮细胞（RPE）的形态或功能改变可损害其正常功能，进而导致视网膜病变，这是多种眼病共有的特征4许多眼部疾病与视网膜色素上皮（RPE）细胞的形态和功能改变有关，包括一些遗传性疾病，如视网膜色素变性、Leber先天性黑蒙和白化病4,5,6以及与年龄相关的眼部疾病，如糖尿病视网膜病变（DR）和年龄相关性黄斑变性（AMD）7,8人类细胞是最理想的，因此在形成视网膜色素上皮（RPE）单层细胞时，使用原代人RPE细胞研究RPE相关疾病最为理想。然而，由于大多数此类疾病会导致患者发病，可用于研究的人体供体极为有限，加之伦理问题的限制9，但不一定影响死亡率10从而避免了原代人视网膜色素上皮（RPE）细胞分离的困难，使得利用非人类动物供体培养RPE细胞成为更可取的替代方案。啮齿类动物，尤其是小鼠，由于在这些物种中转基因技术已得到更广泛的发展，因此被认为是研究多种眼病的理想模型。11尽管使用原代培养的视网膜色素上皮（RPE）细胞具有诸多优势，但长期维持细胞增殖、保存及重复使用仍存在困难。本方案的主要局限性在于小鼠的年龄：用于RPE细胞分离的小鼠必须处于非常年轻的阶段（最佳年龄为18至21日龄），因为从成年小鼠中培养RPE细胞较为困难。11,12,13RPE细胞可从任意年龄的小鼠眼球中分离，但仅在年轻小鼠（18至21日龄）中成功实现最多四次细胞传代。通过使用C57BL/6小鼠以及RPE细胞中缺失N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDARs）的转基因小鼠进行视网膜色素上皮（RPE）细胞的分离，以研究同型半胱氨酸水平升高对年龄相关性黄斑变性（AMD）发生与进展的影响。14此外，分离的原代RPE细胞通过抑制RPE细胞上的NMDARs，有助于提出针对年龄相关性黄斑变性（AMD）的治疗靶点。14有一些NMDAR阻断剂已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，目前用于治疗与阿尔茨海默病（AD）相关的中重度认知障碍（痴呆），例如美金刚（memantine）16，这可能是年龄相关性黄斑变性（AMD）的一个潜在治疗靶点14此外，采用高同型半胱氨酸水平的遗传修饰小鼠（CBS）分离出原代小鼠视网膜色素上皮（RPE）细胞，用于检测炎症标志物，并探讨炎症反应的潜在诱导作用，作为同型半胱氨酸引发年龄相关性黄斑变性（AMD）和阿尔茨海默病（AD）特征的潜在机制16,17.
本方案用于从野生型 C57BL/6 小鼠及本实验室构建的转基因小鼠中分离视网膜色素上皮（RPE）细胞，系对其他已发表的分离方案13,18,19 的简化改进，旨在建立一种简便且可靠的实验流程。本方案对小鼠性别无特殊要求。尽管小鼠年龄对分离过程至关重要，但本研究中使用了幼龄小鼠（18–21 日龄）以及任意年龄的成年小鼠（最长至 12 个月）进行 RPE 细胞的分离。然而，我们观察到，从幼龄小鼠分离的 RPE 细胞存活时间更长，可传代至四次；而从成年小鼠分离的 RPE 细胞通常仅能传代一至两次，之后其生长速度减缓，细胞形态变为更细长的纤维细胞样。此外，还观察到细胞色素沉着减少、对培养皿的黏附能力下降，最终导致细胞脱落。

<table><tbody><tr><td>烧杯：100 mL</td><td>KIMAX</td><td>14000</td><td></td></tr><tr><td>溶组织梭菌胶原酶&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657-25MG</td><td>用于工作酶A</td></tr><tr><td>一次性刻度移液管：3.2 mL，无菌</td><td></td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>&amp;nbsp;gibco&amp;nbsp;</td><td>11330</td><td>用于RPE细胞培养的培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>gibco</td><td>26140079</td><td>用于完全RPE细胞培养基</td></tr><tr><td>庆大霉素试剂溶液</td><td>gibco</td><td>15750-060</td><td>用于完全RPE细胞培养基</td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Thermo Scientific</td><td>88284</td><td>用于工作酶（A&amp;B）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Heracell VISO 160i CO2 培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>牛睾丸透明质酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506-500MG</td><td>用于工作酶A</td></tr><tr><td>Kimwipes 擦拭纸</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>带针鲁尔锁注射器，21 G × 1 1/2 英寸，无菌，一次性使用，3 mL</td><td>B-D</td><td>309577</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管：2 mL</td><td>Grainger</td><td>11L819</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗RPE65抗体&amp;nbsp;</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab78036</td><td>用于免疫荧光染色&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen Strep）</td><td>gibco</td><td>15140-122</td><td>用于完全RPE细胞培养基</td></tr><tr><td>正向作用镊子，型号5/45</td><td>Dumont</td><td>72703-DZ</td><td></td></tr><tr><td>标准直头虹膜剪，11.5 cm</td><td>GARANA INDUSTRIES</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall St8 离心机</td><td>ThermoScientific</td><td>75007200</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片，#11，不锈钢</td><td>Bard-Parker</td><td>371211</td><td></td></tr><tr><td>悬浮培养皿，60 mm × 15 mm 型</td><td>Corning</td><td>430589</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿：100 mm × 20 mm 型</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Tornado 管：15 mL</td><td>Midsci</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>Tornado 管：50 mL</td><td>Midsci</td><td>C50R</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶EDTA（1×）0.25%</td><td>gibco</td><td>2186962</td><td>用于工作酶B</td></tr><tr><td>镊子5MS，8.2 cm，直头，尖端0.09×0.05 mm</td><td>Dumont</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>正向作用弹簧镊，型号5，生物用，Dumostar，抛光表面，全长110 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td><td>50-241-57</td><td></td></tr><tr><td>中等吸水垫：23&quot; × 36&quot;</td><td>McKesson</td><td>4033</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 弹簧剪，2.5 mm 刃口</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>蔡司AxioImager Z2 显微镜</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>蔡司Zen Blue 2.6 软件</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

原代小鼠视网膜色素上皮细胞的分离

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

视网膜色素上皮（RPE）层位于光感受器后方，具有复杂的代谢系统，在维持光感受器功能方面发挥多种关键作用。因此，RPE的结构与功能对于维持正常视觉至关重要。本文介绍了一种已建立的小鼠原代RPE细胞分离方案。RPE分离是研究不同小鼠眼病模型中RPE病理机制的重要工具。此外，RPE分离有助于比较来自野生型与基因修饰小鼠的原代RPE细胞，并可用于测试药物，从而加速视觉障碍治疗策略的开发。本文提供了一步一步的RPE分离操作流程，整个过程从眼球摘除到细胞接种约需4小时。接种后5–7天内不应更换培养基，以确保分离细胞在无干扰条件下生长。随后对细胞的形态、色素沉积及特异性标志物进行表征分析

视网膜色素上皮，原代细胞分离，小鼠模型，眼部疾病，细胞培养，光感受器，代谢功能，分子机制，药物筛选，细胞表征 通过 免疫荧光。细胞最多可传代三到四次。

验证分离的视网膜色素上皮细胞的特异性、纯度及屏障功能/形成 
分离的细胞在光学显微镜下进行观察，以验证其活力、形态和色素沉着情况。P0 和 P1 代细胞的图像图 1A,B）并在 P0 和 P4 时采集图像（图1C,D）以显示细胞在传代过程中形态、大小和色素的变化，直至第四代（黑箭头指向P4代中分离出的RPE细胞）。使用RPE65蛋白抗体以验证分离细胞的身份。对分离的细胞进行免疫荧光染色，采用抗RPE65抗体孵育后，通过荧光显微镜观察（图1E,F：低倍镜下，以及 图 1G,H：高倍放大，显示呈绿色阳性染色的视网膜色素上皮（RPE）细胞以及蓝色的细胞核标记物DAPI。RPE65是一种在视网膜色素上皮中表达的异构水解酶，对视杆细胞和视锥细胞介导视觉所必需的视觉色素的再生至关重要21 .为了验证分离的屏障功能 
细胞中细胞骨架蛋白F-actin和紧密连接蛋白ZO...

本文描述了一种从小鼠眼球中逐步分离视网膜色素上皮（RPE）细胞的简化方案。该方案包括小鼠眼球的摘除与解剖，随后进行RPE细胞的分离、接种与培养。

视网膜色素上皮（RPE）层位于光感受器后方，含有一个复杂的代谢系统，在多种关键生理过程中发挥重要作用……

本方案将介绍一种简便高效的方法，用于成功分离小鼠原代视网膜色素上皮细胞。视网膜色素上皮细胞在维持感光细胞功能及确保视网膜正常运作方面具有重要作用。本实验室长期将分离小鼠原代色素上皮细胞作为重要工具，用于研究外层血-视网膜屏障及相关疾病，如年龄相关性黄斑变性。为摘取小鼠眼球，需根据所在机构批准的方法对小鼠实施人道安乐死，随后将小鼠置于无菌垫上，使用5/45型镊子按压眼眶区域以诱导眼球突出，再将镊子移至眼球后方，轻柔牵拉以摘除眼球，确保视神经保持完整。使用镊子操作时，将眼球浸入含有5%聚维酮碘的2毫升微量离心管中。在室温下孵育2至3分钟。将眼球从聚维酮碘中取出，并放入培养皿中。使用无菌移液管，用Hanks'平衡盐溶液冲洗眼球，直至聚维酮碘的橙色完全消失。此过程大约需要冲洗2至3次。将眼球置于新的培养皿中，并浸入冷的完全RPE细胞生长培养基中。随后，可在解剖显微镜下开始解剖操作。在显微镜下，使用镊子和/或Vannas剪刀牵拉或剪除眼外肌中的结缔组织。随后可将眼球在冷的RPE细胞培养基中保存一小时。但建议在清洁眼球后直接进行下一步操作。将眼球转移至含有酶A溶液的2毫升微量离心管中，然后在37摄氏度的培养箱中孵育40分钟。将眼球从酶A溶液中取出，放入含有酶B溶液的新的2毫升微量离心管中，然后置于培养箱内，在37摄氏度下孵育50分钟。将眼球从酶B溶液中取出，放入60毫米的培养皿中，浸入完全RPE细胞生长培养基中，然后在4摄氏度下孵育30分钟。将培养皿置于解剖显微镜下，开始进行解剖操作。使用 M5S 镊子和注射器针头在锯齿缘部位做一切口。现在用两把镊子，一把镊子夹住切口内侧部分，另一把镊子夹住角膜。通过牵拉角膜，开始缓慢将角膜从视网膜上撕离。务必小幅度撕取，并在去除角膜时逐步向下移动撕裂位置。这样可确保视网膜色素上皮（RPE）基本保持完整，并获得更干净的撕裂边缘。一旦角膜完全脱离，即可观察到虹膜和晶状体。使用镊子移除虹膜和晶状体，以保持分离的纯度。为将神经视网膜从视网膜色素上皮（RPE）层分离，用一把镊子夹住眼杯的外层，并将第二把镊子的一个臂插入RPE层与神经层之间。随后轻轻牵拉或刮除神经视网膜，使其脱离RPE层，然后弃去神经视网膜。将RPE层移至培养皿上无碎片的区域。为分离RPE与脉络膜及巩膜，使用5/45型镊子轻轻刮擦眼杯内侧，以确保RPE细胞完全分离。RPE细胞在悬浮状态下呈浑浊状，并置于完全的RPE细胞生长培养基中。使用 3.2 毫升无菌移液管吸弃细胞，并转移至含有完全RPE细胞培养基的新15毫升离心管中。可在室温下以 300g 离心 10 分钟。随后吸除上清液，并将沉淀重悬于预温的 RPE 细胞培养基中。将细胞接种至100毫米的培养皿中，在37摄氏度和5%CO2条件下培养。这些图像显示了传代0代和1代时成功的分离结果，表现为视网膜色素上皮（RPE）细胞的色素沉着。到第4代时，细胞特征性减弱，色素减少，呈现纺锤样形态，或变得更为粗大，表面积增大。我们使用视网膜色素上皮细胞特异性标志物RPE65和细胞骨架蛋白F-actin对RPE细胞进行了验证。同时，通过使用Muller细胞特异性标志物波形蛋白（vimentin）进行染色，检测了是否存在Muller细胞污染。本方案是对现有方案的简化改进版本。该方案使用大多数研究实验室中常见的材料和相关设备，有助于以有效的方式分离小鼠原代视网膜色素上皮（RPE）细胞。

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生物学

小鼠原代视网膜色素上皮细胞的分离

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在本视频中，我们介绍了一种从猪眼分离虹膜和视网膜色素上皮细胞的技术，以获得这些细胞的原代培养物，用于体内和离体研究。这些色素细胞可进行基因改造，以研究治疗眼部疾病所需的再生医学方法。...

分离IPE和RPE细胞：一种从离体猪眼中获取色素上皮细胞的技术

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小鼠视网膜色素上皮原代细胞培养

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本文描述了一种从小鼠眼球中分离视网膜胶质穆勒细胞的详细实验方案。该方案从小鼠眼球的摘除和解剖开始，随后进行穆勒细胞的分离、接种和培养。...

原代小鼠视网膜胶质穆勒细胞的分离

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在本视频中，我们将演示如何从小鼠眼球的睫状上皮中分离视网膜干细胞，并在体外培养以形成克隆性视网膜球体。所获得的球状细胞集落具有干细胞的核心特性：自我更新能力与多向分化潜能。...

从小鼠眼球中分离视网膜干细胞

在本实验方案中，我们描述了在小鼠妊娠第10.5天时分离胎盘组织，并通过Percoll梯度分离滋养层细胞的方法。随后，我们展示了将分离得到的细胞用于Matrigel侵袭实验的操作过程。...

小鼠滋养层细胞的分离及滋养层细胞侵袭实验

学习从小鼠眼球中分离原代视网膜色素上皮细胞的简化实验方案。该方法通过酶解处理和显微解剖技术获取具有活性的RPE细胞，适用于研究视网膜疾病和血-视网膜外屏障功能。

原代小鼠视网膜色素上皮细胞的分离

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