Name: 成像引导的生物反应器，用于生成生物工程气道组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T13:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 了解成像引导生物反应器技术，用于大鼠气管内源性上皮选择性去除与外源性细胞均匀分布。该方法支持长期体外培养及气道组织再生研究，适用于疾病建模与药物筛选。

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本研究部分得到了美国胸科学会基金会研究项目、新泽西健康基金会和美国国家科学基金会（CAREER奖2143620）对J.K.的资助；以及美国国立卫生研究院（P41 EB027062）对G.V.N.的资助。

以下动物组织实验方案已获得斯蒂文斯理工学院动物护理与使用委员会（IACUC）的动物福利指南和法规批准，并符合美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物使用的指南。
1. 成像引导大鼠气管生物反应器的设计与构建
<ol>
	<li>大鼠气管生物反应器的设计与构建
	<ol>
		<li>使用计算机辅助设计（CAD）软件创建生物反应器腔室的计算机辅助设计模型，包括相关结构设计，如入口、出口和组织培养腔室。在本研究中，采用如下所示的几何形状和尺寸 图1A- CCAD生成器软件的使用教程可参见16,17.</li>
		<li>将生成的CAD模型导出至计算机数控（CNC）控制器软件，并使用CNC机床切割聚四氟乙烯（PTFE）塑料，以制作生物反应器腔室。CNC控制器软件的使用教程可参见18. 
		注意：除了聚四氟乙烯（PTFE）之外，也可使用其他塑料材料（如超高分子量聚乙烯（UHMWPE）和聚醚酰亚胺）来制备培养室。</li>
		<li>对所有生物反应器组件（如鲁尔接头和螺丝）进行灭菌，以避免装置中培养的组织和细胞受到污染。在洁净环境中将所有生物反应器组件组装到主组织培养室上图1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基于梯度折射率（GRIN）透镜的成像装置构建
	<ol>
		<li>为了构建 原位 成像设备，将管镜插入可堆叠的镜筒中，并用固定环固定。将镜筒组件安装到科学级CMOS相机上 通过 C型接口转接器</li>
		<li>使用 Micro-Manager 等软件控制相机并采集照片和视频。将相机对准远处的物体（例如距离相机 10 m 处），调节物镜管与相机成像传感器之间的距离，直至所用成像软件在计算机屏幕上形成该物体的清晰图像。</li>
		<li>使用光学笼式系统组件（包括安装杆、螺纹笼式板和笼式立方体），将滤光片镜头和激光器安装到双边缘超分辨率二向色镜装置上。</li>
		<li>将物镜（20倍）连接至设备。在透镜管的远端安装一个梯度折射率（GRIN）透镜（直径 = 500 µm）。 通过 XY 转换器。调节梯度折射率（GRIN）透镜与物镜之间的距离，以形成聚焦的显微图像（图2A，B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 大鼠气管的分离
<ol>
	<li>手术前，使用高压灭菌器在 121 °C 下对手术区域和手术器械进行 30 分钟的灭菌处理。</li>
	<li>将大鼠放入诱导室，通过小型蒸发器输送 2.5% 异氟烷，持续 15 分钟以麻醉动物。通过足底反射评估麻醉深度：用力捏压脚趾，确认动物对捏压无反应。</li>
	<li>麻醉后，从诱导室中移除异氟烷，并通过侧尾静脉注射 1 mL 浓度为 1,000 单位/mL 的肝素，以防止肺血管内血液凝固。</li>
	<li>为实施安乐死，将动物暴露于 5% 异氟烷中额外 15–20 分钟。随后将动物从诱导室中取出，仰卧位固定于手术板上。</li>
	<li>使用胶带固定大鼠的四肢和尾巴，将其固定在手术板上。接着使用 70% 异丙醇（IPA）对大鼠颈部和胸部区域进行消毒。用剪刀在皮肤上做 3–4 cm 的切口，打开腹腔。 
	注意：操作剪刀时应将尖端朝上，避免过深切割皮肤。</li>
	<li>使用剪刀横断下腔静脉（IVC），并通过放血确认动物已安乐死。</li>
	<li>在颈部正中线用剪刀做切口，暴露气管，实施气管切开术。在胸壁做正中切口，沿肋骨间隙剪开，直至暴露与肺相连的气管末端。随后使用镊子和剪刀剪断气管两端，分离出气管。</li>
	<li>分离后，用 20 mL 的 1× 磷酸盐缓冲液（1× PBS）冲洗气管。使用灭菌镊子将气管转移至生物反应器中，并用 4-0 缝合线将气管两端固定在鲁尔接头上。</li>
	<li>通过连接至生物反应器腔室的管路，使用可编程注射泵以 5 mL/min 的流速向生物反应器腔室输送 5 mL 培养基。 
	注意：培养基成分为 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）、重组人碱性成纤维细胞生长因子（0.1 ng/mL）、胎牛血清（FBS，10%）以及抗生素-抗真菌剂（1%）。</li>
	<li>用丙烯酸塑料盖和螺丝紧密关闭生物反应器盖子。使用公/母鲁尔接头堵头封闭生物反应器腔室的管路连接处，防止培养基在管路中流动。</li>
</ol>
3. 影像引导下气管上皮的去除
<ol>
	<li>为了在明场或荧光下观察气管管腔，将生物反应器置于成像载物台上（图3A).</li>
	<li>使用1×PBS稀释CFSE细胞标记试剂盒中的CFSE溶液，配制浓度为100 μM的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）溶液。 
	注意：原始CFSE溶液的浓度为10 mM（溶于二甲基亚砜（DMSO）中）。</li>
	<li>经气管注入500 µL CFSE溶液 通过 通过连接至气管套管的管路，以5 mL/min的流速使用注射泵灌注CFSE溶液，当CFSE溶液充满气管时停止泵送。静置10分钟，随后使用注射泵灌注10 mL的1×PBS冲洗气管腔，以去除未结合的残留CFSE试剂。</li>
	<li>将GRIN透镜的远端成像端插入气管 通过 将鲁尔接头连接至气管一端。然后，轻柔地移动气管内的GRIN透镜，直至气管表面清晰对焦，以20倍放大倍数在明场或荧光模式下拍摄照片和视频。</li>
	<li>在 Micro-Manager 软件中采集明场图像，请遵循以下步骤。
	<ol>
		<li>通过笼式立方体引入白光，以照亮气管管腔。点击 活体 实时显示气管腔面的图标。使用 成像设置 &#62; 曝光时间（ms） 将曝光时间调整至所需值。本研究中使用的曝光时间范围为10 ms至50 ms。</li>
		<li>调整图像对比度和亮度，请使用 直方图与强度缩放 通过移动交互式直方图显示末端的黑白箭头来调整窗口。或者，使用 自动拉伸 可自动将亮度和对比度调整至最佳水平的选项。</li>
		<li>点击 快照 图标以冻结图像。然后，使用 设置 &#62; 导出图像为位移模式 以所需格式保存图像。或者，使用 设置 &#62; ImageJ 直接将图像导出至 ImageJ 软件并保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用笼式立方体通过CFSE特异性激光照射气管腔（CFSE：激发波长：488 nm，发射波长：515 nm），以获取荧光模式下的照片和视频。按照步骤3.5.2–3.5.3采集图像。拍摄完成后，轻柔地将GRIN透镜从气管中取出。</li>
	<li>按以下所述进行去上皮化操作。
	<ol>
		<li>配制2%十二烷基硫酸钠（SDS）脱细胞溶液于去离子（DI）水中。通过气管插管连接注射泵，以6.3 mL/min的流速向气管内注入50 µL SDS溶液，使去污剂溶液在气管腔内形成一层薄膜。</li>
		<li>使用公/母鲁尔接头堵头封闭生物反应器的管路连接处，并将生物反应器转移至培养箱中。在37 °C条件下使SDS在气管内保留10分钟。通过气管再次注入50 µL SDS溶液，并孵育10分钟。</li>
		<li>用 500 µL 1x PBS 冲洗气管腔以去除裂解的上皮细胞和 SDS 通过 以10 mL/min的流速用注射泵冲洗3次。将生物反应器置于摇床上，以20 Hz的频率和约0.3 mm的位移振幅进行机械振动，以物理方式促进经SDS处理的上皮细胞从气管腔脱落。 
		注意：本研究中使用的摇床通过组装低音扬声器、低音功放板和加速度计自行构建。正弦波信号由计算机生成并输入至摇床 通过 放大器，同时监测振动台的响应 通过 加速度计（图3B此外，可使用常规摇床（如电磁摇床和惯性摇床）促进细胞脱离。操作时，将摇床的频率和加速度分别设置为 20 Hz 和 0.5 g（相当于 0.3 mm 的位移振幅）。</li>
		<li>通过气管腔将500 µL 1×PBS注入两次，同时机械振动气管，以去除残留的SDS和细胞碎片。上皮去除步骤完成后，使用步骤3.6中的GRIN透镜成像装置检测CFSE荧光强度，评估上皮层的清除情况。图3C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 气管组织的制备以用于后续分析
<ol>
	<li>为确认上皮组织的去除，需进行进一步的组织学分析，如苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色、三色染色、五色染色及免疫组织化学染色。具体操作为：将气管从生物反应器中取出，置于含有30 mL 4%中性缓冲甲醛溶液（溶于1×PBS，pH = 7.4）的容器中，于4 °C条件下固定过夜。</li>
	<li>按照以下步骤对固定后的气管组织进行脱水和包埋。
	<ol>
		<li>固定完成后，用10 mL 1×PBS清洗气管组织，随后将其转移至30 mL 70%乙醇中，于4 °C条件下保存过夜。使用锋利刀片将气管切割成小的圆柱形片段（约5 mm长），并将组织片段放入组织包埋盒（长×宽×高：4 cm × 2.5 cm × 0.5 cm）中，每个包埋盒放置两个气管片段。</li>
		<li>将组织片段依次浸入异丙醇（IPA）溶液系列（85%、90%、95%、100%），每种浓度使用30 mL，浸泡1小时。每次更换溶液前需彻底移除前一种溶液。</li>
		<li>完成脱水后，将包埋盒浸入30 mL透明剂（如二甲苯）中2小时，以完全置换组织片段中的异丙醇。此步骤应在通风良好的通风橱中进行。</li>
		<li>将包埋盒浸入石蜡中2小时，随后于4 °C条件下石蜡包埋过夜。接着使用切片机将石蜡包埋的组织切成薄片（5–8 μm），用于H&amp;#38;E染色、三色染色、五色染色及免疫组织化学染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为进行扫描电子显微镜（SEM）分析，将气管置于30 mL 2.5%戊二醛溶液（溶于1×PBS，pH = 7.4）中，于4 °C条件下固定过夜。随后按照以下步骤对固定后的气管组织进行SEM专用脱水处理。
	<ol>
		<li>固定完成后，用10 mL 1×PBS冲洗气管组织。使用剪刀沿纵向将气管组织切成小的半圆柱形片段（长度约5 mm），并将组织片段插入包埋盒中。</li>
		<li>将组织片段依次浸入异丙醇（IPA）溶液系列（35%、50%、70%、85%、95%、100%），每种浓度使用30 mL，浸泡10分钟。每次更换溶液前需彻底移除前一种溶液。</li>
		<li>采用六甲基二硅氮烷（HMDS）干燥法：依次将组织浸入以下溶液中：100% IPA : HMDS（2:1, v/v）10分钟，随后100% IPA : HMDS（1:2, v/v）10分钟，最后浸入100% HMDS中过夜。 
		注意：HMDS具有毒性，所有干燥步骤均需在通风橱中操作。</li>
		<li>将组织从HMDS溶液中取出，在通风橱中干燥1小时。使用碳双面导电胶带或银导电糊将组织片段固定在铝制样品台（pin stubs）上，用于SEM成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 外源细胞在去上皮气管腔内的均匀分布
<ol>
	<li>使用第3步中的方案制备去上皮化的鼠气管。将冻存的间充质干细胞（MSCs）在37 °C水浴中解冻30秒。 
	注意：在本研究中，我们采用间充质干细胞（MSCs）作为模型细胞，以展示外源性细胞在去上皮化气管上的分布情况。理想情况下，可用于上皮再生的细胞包括原代气道上皮细胞、基底细胞或诱导性人多能干细胞（iPSCs）。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，并配制浓度为 5 x 10 的细胞悬液6 细胞/mL。将细胞与2 mL CFSE溶液（浓度：100 µM）在室温下孵育15分钟，进行荧光标记。用5 mL 1×PBS洗涤细胞3次，然后将细胞重悬于新鲜培养基中，最终浓度为3 × 107 cells/mL</li>
	<li>制备水凝胶预凝胶溶液作为细胞递送载体。本研究中使用I型胶原蛋白作为间充质干细胞（MSCs）的递送载体，并按照制造商说明书配制预凝胶溶液。例如，为获得3.6 mg/mL的胶原蛋白预凝胶，取一份冷的中和溶液与九份大鼠尾部来源的I型胶原蛋白在1.5 mL无菌离心管中混合，然后轻轻吹打混合液数次以确保充分混匀。 
	注意：根据研究和用户需求，可使用其他生物相容性水凝胶替代 I 型胶原。</li>
	<li>一旦水凝胶溶液配制完成，立即将细胞以所需浓度加入溶液中（例如，5 x 106 细胞/mL）。为获得均匀的细胞-水凝胶混合物，使用移液枪轻柔吹打，将细胞与凝胶溶液混匀。</li>
	<li>通过鲁尔接头将气管的一端连接至生物反应器内的可编程注射泵。使用注射泵以5 mL/min的流速将5 mL、37 °C的新鲜培养基注入生物反应器腔室，以覆盖气管的外表面。</li>
	<li>使用注射泵以5 mL/min的流速，将10 µL细胞-水凝胶混合物推注到生物反应器内去上皮化的气管中，以在气管管腔内形成细胞-水凝胶层（图4).</li>
	<li>细胞接种后，将生物反应器置于37 °C、5% CO₂的无菌细胞培养孵箱中2 用于凝胶化。对于I型胶原，凝胶化在30分钟内完成。</li>
	<li>为观察移植细胞的分布情况，使用70%异丙醇或乙醇擦拭GRIN透镜进行消毒，并将生物反应器置于成像载台上。根据需要在明场和荧光模式下拍摄照片和视频。</li>
	<li>细胞接种30分钟后，使用注射泵以1 mL/min的流速向气管腔内注入1 mL培养基。</li>
	<li>将接种细胞的气管置于生物反应器中，在37 °C培养箱内培养至所需时间。对于长期培养，每隔24小时更换气管腔内及生物反应器腔室中的培养基。细胞培养期间，保持气管腔内的培养基静置，每24小时更换一次；而气管外部的培养基则持续灌流。 通过 5 mL/min 的单向流速。</li>
	<li>在将细胞培养一定时间后（例如本研究中的1天和4天），从生物反应器中取出气管。在第1天和第4天，使用剪刀将气管沿纵轴方向剪成两个半圆柱形部分（即上半部分和下半部分）。 体外 培养以暴露内表面，便于监测细胞生长和计算细胞密度。使用常规荧光显微镜观察内表面上的细胞。</li>
	<li>使用 Micro-Manager 软件获取图像，请遵循步骤 3.5 和 3.6。在荧光模式下，使用异硫氰酸荧光素（FITC）滤光片观察 CFSE 标记的细胞。利用 ImageJ 软件分析荧光显微镜拍摄的图像，并计算上部和下部区域的细胞密度。按照以下步骤计算细胞数量和细胞密度。
	<ol>
		<li>在 ImageJ 软件中打开图像，并将图像转换为二值图像（16 位） 图像 &#62; 类型 &#62; 16位使用标尺设置图像比例尺 分析 &#62; 设定比例尺.</li>
		<li>调整图像阈值以突出显示待计数的细胞结构。使用 图像 &#62; 调节 &#62; 阈值使用 分析 &#62; 分析颗粒 统计细胞数量。通过将细胞数量除以图像的表面积来计算细胞密度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为评估细胞接种后的存活率，使用细胞活力检测试剂盒。本研究中，将气管组织和细胞在生物反应器中于 37 °C 培养 6 小时，随后在室温下用 4 mM calcein-AM 和 2 mM ethidium homodimer-1 溶于 1 mL 1x PBS 中染色 15 分钟。</li>
	<li>用1×PBS冲洗后，使用荧光显微镜观察细胞。按照步骤5.12中所述方法计数活细胞和死细胞。以活细胞（经钙黄绿素-AM染色）占总细胞数（包括活细胞和死细胞）的百分比计算细胞活力。</li>
</ol>

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作者声明不存在竞争性财务利益。

在本研究中，我们构建了一种成像引导式生物反应器，可实现（i）对气管管腔的监测 原位 在细胞清除和外源性细胞递送后（ii）长期 体外 细胞接种气管组织的培养。利用这种定制的生物反应器，我们实现了：（i）使用去污剂结合振动辅助气道冲洗，选择性去除气管管腔内的内源性上皮细胞；（ii）通过负载细胞的I型胶原预凝胶，将外源性细胞均匀分布于去上皮化气管的管腔表面。此外，基于GRIN透镜的成像方法证实了上皮层的去除 原位此外，通过进一步分析，包括H&amp;#38;E、三色染色、五色染色、免疫荧光染色和扫描电镜观察，我们证实了上皮层已被去除，而下层组织的结构和组分得以保留。此外，基于GRIN透镜的成像显示，当使用I型胶原预凝胶作为递送载体时，新植入的外源性间充质干细胞（MSCs）呈均匀分布。最后，植入的细胞在去上皮化的气管上存活并增殖，凸显了该生物反应器在细胞接种气道组织长期培养中的有效性。
脱上皮化方案中的关键步骤是在气管腔内形成一层薄薄的去垢剂溶液。在目前的脱细胞方案中，需要长时间使用多种化学试剂和酶的循环处理，这会减少胶原纤维、糖胺聚糖...

呼吸道腔面由一层上皮覆盖，主要由多纤毛细胞、克拉拉细胞、杯状细胞和基底干细胞组成1,2上皮层作为肺部的主要防御机制，发挥着生物物理屏障的作用，可保护下层气道组织免受吸入性病原体、颗粒物或化学气体的侵害。它能够保护气道组织 通过 多种机制，包括细胞间紧密连接的形成、黏液纤毛清除作用，以及抗菌和抗氧化物质的分泌3,4受损的气道上皮与慢性阻塞性肺疾病（COPD）等严重的呼吸系统疾病相关5，原发性纤毛运动障碍（PCD）6，以及囊性纤维化（CF）7.
肺芯片（lung-on-chip, LOC）技术的进步为研究人类肺部发育、模拟多种肺部疾病以及开发新型治疗材料提供了机遇，且可在高度可控的环境中进行 体外 环境。例如，可将气道上皮和内皮细胞培养在一层薄的多孔膜的相对两侧，以模拟进行气体交换的肺组织，从而实现可靠的疾病建模和药物测试8同样地， 体外 已创建疾病模型以模拟气道疾病 体外，例如慢性阻塞性肺疾病（COPD）9 和囊性纤维化10然而，器官芯片装置面临的一个主要挑战是重现肺组织复杂的三维（3D）结构以及动态的细胞-组织基质相互作用 体外11.
近年来，已开发出创新的组织工程技术，可实现对 离体 肺组织12利用这些方法，可通过去除肺组织中的内源性细胞，制备去细胞化的同种异体或异种组织移植物 通过 化学、物理和机械处理13此外，脱细胞肺支架中保留的天然组织细胞外基质（ECM）为植入细胞提供了仿生的结构、生化和生物力学信号，促进其黏附、增殖和分化。14,15.
此处通过结合芯片实验室（LOC）与组织工程技术，构建了一种成像引导的生物反应器系统，可实现 体外 报道了离体大鼠气管组织的操作与培养方法。利用该气道组织生物反应器，本方案展示了在不破坏气道组织下方的上皮下细胞及生化组分的前提下，选择性去除内源性上皮细胞的方法。接着，通过滴加负载细胞的I型胶原预凝胶溶液，实现了新接种的外源性细胞（如间充质干细胞，MSCs）在去上皮化气道腔内的均匀分布与即时沉积。此外，借助集成于生物反应器中的微光学成像装置，可在去除上皮及递送内源性细胞的过程中实时观察气管腔内情况。进一步结果显示，气管组织及新植入的细胞可在该生物反应器中培养长达4天，且无明显细胞死亡或组织降解现象。我们预期，本研究中所采用的具备成像功能的生物反应器平台、基于薄膜的去上皮化技术以及细胞递送方法，可为构建气道组织提供有效工具 体外 疾病建模与药物筛选
生物反应器包含一个矩形腔室，连接至可编程注射泵、灌注泵和呼吸机，用于培养分离的大鼠气管。该生物反应器设有入口和出口，与气管或组织培养室相连，可分别向气管的内腔和外腔空间独立供给试剂（如培养基）图1）。可使用定制的成像系统来观察其内部结构 体外-在细胞水平上培养的大鼠气管（图2气管的内源性上皮被去除 通过 基于洗涤剂的脱细胞溶液灌注，随后进行振动辅助气道清洗图3）。水凝胶溶液（如I型胶原）被用作递送载体，以在去上皮化的气管腔内均匀且即时地接种外源性细胞（图4）。用于构建生物反应器并开展实验的所有材料均在下文列出 材料表.

<table><tbody><tr><td>1&amp;times; PBS</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技</td><td>10-010-031</td><td></td></tr><tr><td>三通连接器</td><td>世界精密仪器公司</td><td>14048-20</td><td></td></tr><tr><td>4端口连接器</td><td>World Precision Instruments</td><td>14047-10</td><td></td></tr><tr><td>加速度计</td><td>意法半导体</td><td>IIS3DWBTR</td><td></td></tr><tr><td>消色差双合透镜</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>铝制样品台</td><td>TED PELLA</td><td>16111</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>组装杆</td><td>Thorlabs</td><td>ER1</td><td></td></tr><tr><td>圆头螺丝</td><td>McMaster-Carr</td><td>91255A274</td><td></td></tr><tr><td>笼式立方体</td><td>Thorlabs</td><td>C4W</td><td></td></tr><tr><td>碳双面导电胶带</td><td>TED PELLA</td><td>16073</td><td></td></tr><tr><td>CFSE 标记试剂盒</td><td>Abcam</td><td>ab113853</td><td></td></tr><tr><td>Citrisolv（透明剂）</td><td>去污</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>C型接口转接器</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A9</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原蛋白</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5153</td><td></td></tr><tr><td>导电液态银漆</td><td>TED PELLA</td><td>16034</td><td></td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>Semrock</td><td>DI03-R488</td><td>反射激光波长：&amp;nbsp; 473.0 ± 2 nm 488.0 +3/-2 nm</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔&amp;rsquo;s 培养基</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>雌性鲁尔接头转软管接头适配器</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45501-30</td><td></td></tr><tr><td>雌性鲁尔接头转管齿接头</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45508-03</td><td></td></tr><tr><td>雌性至雄性鲁尔接头</td><td>Cole-Parmer</td><td>ZY-45508-80</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>滤光片</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET535/50m</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>尼康</td><td>Eclipse E1000 - D</td><td></td></tr><tr><td>Fusion 360</td><td>Autodesk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>六角螺母</td><td>McMaster-Carr</td><td>91813A160</td><td></td></tr><tr><td>六甲基二硅氮烷（HMDS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC120585000</td><td></td></tr><tr><td>成像光纤</td><td>SELFOC，NSG 集团</td><td>GRIN透镜</td><td></td></tr><tr><td>激光</td><td>Opto Engine</td><td>MDL-D-488-150mW</td><td></td></tr><tr><td>透镜管</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L40</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 存活率/细胞毒性检测试剂盒（Invitrogen）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>MACH 3 数控控制软件</td><td>新式解决方案</td><td></td><td></td></tr><tr><td>物镜</td><td>奥林巴斯</td><td>UCPLFLN20X</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Cole Parmer</td><td>L/S 标准数字泵系统</td><td></td></tr><tr><td>重组人碱性成纤维细胞生长因子</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>卡环</td><td>Thorlabs</td><td>SM1RR</td><td></td></tr><tr><td>科学级CMOS相机</td><td>PCO 熊猫</td><td>PCO Panda 4.2</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>VWR</td><td>97064-472</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks（2019）</td><td>达索系统&amp;egrave;间充质干细胞</td><td></td><td></td></tr><tr><td>可堆叠透镜管</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L10</td><td></td></tr><tr><td>低音炮板载放大器</td><td>Dayton Audio</td><td>SPA250DSP</td><td></td></tr><tr><td>低音扬声器</td><td>Dayton Audio</td><td>RSS21OHO-4</td><td>膈肌直径：21 cm</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>世界精密仪器公司</td><td>AL-4000</td><td></td></tr><tr><td>螺纹笼板</td><td>Thorlabs</td><td>CP33</td><td></td></tr><tr><td>螺纹鲁尔接头适配器</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45513-81</td><td></td></tr><tr><td>管镜</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 管</td><td>Cole-Parmer</td><td>13-200-110</td><td></td></tr><tr><td>XY 转换器</td><td>Thorlabs</td><td>CXY1</td><td></td></tr></tbody></table>

成像引导式生物反应器用于生成生物工程化气道组织

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

反复损伤气道组织可能损害肺功能，并导致慢性肺部疾病，例如慢性阻塞性肺疾病。再生医学和生物反应器技术的进步为体外培养功能性组织和器官结构提供了可能，这些结构可用于药物筛选、疾病建模以及组织工程替代物的开发。本文介绍一种微型化生物反应器，结合成像技术，可实现 原位 移植大鼠气管内腔的可视化观察期间 体外 组织操作和&#160;描述了一种培养方法。利用该生物反应器，本方案演示了在保留气道组织基质固有生化特性及超微结构的前提下，通过成像引导选择性去除内源性细胞成分的过程。此外，还实现了外源细胞在脱细胞气道腔内的递送、均匀分布以及后续的长期培养，并通过光学监测进行观察 原位 结果显示，成像引导的生物反应器有望用于促进功能性组织的生成 体外 气道组织

基于GRIN透镜的 原位 成像方式可实现气管内腔的可视化 原位 (图5A）。利用该成像方法，可获得天然气管和去上皮化气管的明场与荧光图像（图5B, C）。在CFSE标记前，未观察到天然气管有荧光信号图 5Bii）。然而，当使用CFSE染料标记气管上皮时，可在整个上皮中观察到均匀的荧光信号（绿色）图5Ci。脱上皮处理后 通过 SDS 和振动辅助气道灌洗后，荧光信号强度显著降低（图 5Cii)，表明上皮已被消融。
去上皮化气管的H&amp;E染色图像显示，气管管腔内的假复层上皮已被去除，而下层组织中的细胞及细胞外基质（ECM）微结构得以保留（图6A</strong...

该方案描述了一种可进行成像的生物反应器，可用于选择性去除大鼠气管的内源性上皮，并在外源细胞接种后使其在管腔表面均匀分布，随后实现长期培养 体外 细胞-组织构建物的培养。

反复损伤气道组织可能损害肺功能，并导致慢性肺部疾病，例如慢性阻塞性肺疾病。随着……的进展

本方案允许在体外培养分离的气道组织，并在不同的组织操作过程中（如去上皮化和气道组织再生）实现直接的显微观察。本研究提出的原位成像方法可在成像引导下对内源性上皮进行可控去除以及外源性细胞递送的过程中，快速、无损地监测气管管腔的变化。该成像引导的生物反应平台及组织操作方案可用于构建生物工程化气道组织，以用于疾病建模和药物筛选。本研究团队的两名博士生 Mohammad Mir 和 Jiawen Chen 将演示成像功能气道组织生物反应器的构建与使用。要开始制作原位成像装置，请将一个管镜插入可堆叠的镜筒中，并使用固定环将其固定。然后，通过 C 型接口适配器将镜头支架组件安装到科学级 CMOS 相机上。使用 Micromanager 软件操作相机以采集照片和视频。当对准位于相机 10 米处的物体时，调节筒镜与相机成像传感器之间的距离，直至计算机屏幕上形成该物体的清晰图像。接下来，使用光学笼式系统组件（如安装杆、螺纹笼板和笼式立方体），将滤光镜安装到双边缘超分辨率二向色镜上，并将激光器连接至装置。将20倍物镜连接到设备上。然后，通过X-Y平移装置将直径为500微米的绿色透镜安装在透镜管的远端。调节绿色透镜与物镜之间的距离，以形成聚焦的显微图像。为了在明场或荧光下观察分离的大鼠气管管腔，将生物反应器置于成像载物台上。接着，通过连接气管插管管路的注射泵，以每分钟5毫升的流速向气管内灌注500微升新配制的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）溶液。当CFSE溶液充满气管后，停止泵送。10分钟后，使用注射泵向气管腔内注入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS），以冲洗未结合的CFSE试剂残留物。清洗后，将绿色镜头的远端成像端通过连接在气管一端的鲁尔接头插入气管内。然后，轻柔地在气管内移动绿色镜头，直至气管表面清晰对焦。在 Micromanager 软件中捕获明场图像时，通过笼式立方体（cage cube）以白光照射气管管腔。然后，单击“实时”（Live）图标，实时显示气管的管腔表面。使用“成像设置”（Imaging setting）和“曝光”（Exposure）选项卡，将曝光时间调整至所需数值。为调整图像的对比度和亮度，请使用直方图和强度缩放窗口，移动交互式直方图显示末端的黑色和白色箭头。单击“停止实时”以激活“捕获”图标，然后单击“捕获”图标以冻结图像。接下来，使用“导出”设置，然后选择“图像”作为独立选项卡，以所需格式保存图像。为了以荧光模式获取图像和视频，通过笼式滤光立方体用CFSE特异性激光照射气管腔，并通过前后移动成像探头实时采集图像。获得图像和视频后，轻柔地将绿色镜头从气管上取下。进行气管去上皮化时，经气管插管注入50 µL新配制的2%十二烷基硫酸钠，使去垢剂溶液在气管腔内形成一层薄膜。灌注后，使用公或母鲁尔接头堵头封闭生物反应器的管路连接处，并将生物反应器转移至37°C培养箱中孵育10分钟，使SDS在气管内停留。重复灌注一次。第二次灌注后，通过注射泵以每分钟10毫升的流速，用500微升磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗气管腔三次，以去除裂解的上皮组织和SDS。然后，将生物反应器置于摇床上，以20赫兹的频率和0.3毫米的位移振幅进行机械振动，以促进经SDS处理的上皮细胞从气管腔中物理脱离。在气管机械振动的同时，通过气管腔分两次注入各500微升的PBS，以去除残留的SDS和细胞碎片。上皮层去除后，使用绿色荧光成像装置检测CFSE的荧光强度，评估上皮层的清除情况。制备去上皮化的 大鼠气管后，将冻存的间充质干细胞（MSCs）在 37°C 水浴中解冻 30 秒。随后使用血细胞计数板对细胞进行计数，并配制浓度为 5 × 10⁶ 个细胞/毫升的细胞悬液。然后，在室温下用 2 毫升 100 微摩尔的 CFSE 溶液孵育细胞，对细胞进行荧光标记。孵育15分钟后，用5毫升PBS洗涤细胞三次，然后将细胞重悬于新鲜DMEM培养基中，终浓度为每毫升3×10⁷个细胞。按照文章中所述方法制备I型胶原水凝胶后，立即将细胞以所需浓度加入水凝胶溶液中。随后，使用微量移液器将细胞与凝胶溶液混合，以获得均匀的细胞-水凝胶混合物。接下来，通过鲁尔接头将生物反应器内气管的一端连接至可编程注射泵，并以37摄氏度的温度向生物反应器腔室中注入5毫升新鲜培养基，以覆盖气管的外表面。然后，向生物反应器内去上皮化的气管中注入10微升的细胞-水凝胶混合物，以在气管管腔内形成一层细胞-水凝胶层。细胞注射完成后，立即将生物反应器置于37摄氏度、5%二氧化碳的无菌细胞培养孵箱中，孵育30分钟，以促进凝胶化。为了观察植入细胞的分布情况，使用70%异丙醇或乙醇对绿色镜头进行灭菌，将生物反应器置于成像平台上，以获取明场和荧光模式下的照片和视频。细胞接种30分钟后，以每分钟1毫升的流速向气管腔内灌注1毫升培养基。最后，将接种细胞的气管置于生物反应器中，在37°C的培养箱中培养至所需时间。在细胞培养过程中，保持管腔内的培养基静止，而气管外的培养基则通过单向流动持续灌注。在去上皮化气管的明场和荧光图像中，CFSE标记前未观察到荧光信号。使用CFSE后，上皮组织中 throughout 观察到均匀的荧光信号。去上皮化后，荧光强度显著降低，表明上皮已被清除。去上皮化气管的苏木精-伊红染色显示，气管腔内的假复层上皮已被去除，而下层组织中的细胞及细胞外基质（ECM）微结构得以保留。此外，五色染色和三色染色证实了气管组织结构以及细胞外基质成分（如胶原蛋白和蛋白聚糖）的完整性。上皮细胞和胶原蛋白I的免疫荧光结果显示，上皮层被完全去除，而上皮下组织中的胶原蛋白I得以保留。扫描电子显微镜图像显示，天然气管组织中分布有多个纤毛细胞和杯状细胞。在去上皮化的气管中，基底膜暴露，表现为细胞外基质纤维形成的网状结构，并且无上皮细胞存在。此处展示了经脱上皮处理的气管在使用 PBS 和胶原蛋白接种后的荧光图像。与通过培养基接种的细胞相比，通过水凝胶递送的荧光标记细胞在管腔内壁上的黏附更为均匀。细胞活力研究表明，细胞递送过程未对细胞活力产生影响，超过 90% 的细胞保持存活状态。在去上皮化过程中形成一层薄薄的去污剂膜，并使用水凝胶作为细胞递送载体，是本方案成功的关键步骤。我们下一步的研究目标是将实验室培养的气道原代细胞或干细胞植入去上皮化的气道组织，以探究是否能够构建出具有功能的气道组织。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

成像引导的生物反应器，用于生成生物工程气道组织

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本方案概述了在细胞外基质水凝胶支架上由A549肺泡上皮细胞和MRC-5肺成纤维细胞生成类器官，随后将其包埋于三维胶原凝胶中，并利用细胞拉伸生物反应器施加机械应变，以研究肺泡机械生物学。...

利用机械细胞拉伸生物反应器生成三维胶原嵌合A549/MRC-5肺泡类器官

了解成像引导生物反应器技术，用于大鼠气管内源性上皮选择性去除与外源性细胞均匀分布。该方法支持长期体外培养及气道组织再生研究，适用于疾病建模与药物筛选。

成像引导式生物反应器用于生成生物工程化气道组织

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