Name: 使用拉曼染料进行高度多重组织成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 学习电子预共振受激拉曼散射成像技术，用于厚组织切片的多重蛋白标记分析。该方法实现亚细胞分辨率的无循环多重成像，适用于肿瘤微环境表型和脑回路分析。

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感谢 Ruth A. Singer 和 Richard K.P. Benninger 提供小鼠胰腺组织。W.M. 感谢美国国立卫生研究院（NIH）R01（GM128214）、R01（GM132860）、R01（EB029523）以及美国陆军（W911NF-19-1-0214）提供的资助支持。

该实验方案遵循哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会批准的动物实验方案（AC-AABD1552）进行。
1. 拉曼染料偶联抗体的制备
<ol>
	<li>配制偶联缓冲液：在 PBS 缓冲液中加入约 0.1 M 的 NaHCO3，调节 pH 至 8.3，4 °C 保存。</li>
	<li>将 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯功能化的 MARS 探针（补充材料）配制成 3 mM 的无水 DMSO 溶液。MARS 探针的合成方法可参考先前的文献报道13,17,18。 
	注意：为便于储存，染料 NHS 酯溶液必须避光保存，并置于 -20 °C。</li>
	<li>将抗体固体溶解于偶联缓冲液中，使其浓度达到 2 mg/mL。对于溶解在其他缓冲液中的抗体，使用离心过滤器将其置换至偶联缓冲液中，浓度调整为 1–2 mg/mL。 
	注意：为减少交叉反应性，多重染色应优先选用高度交叉吸附的二抗。所用二抗列于 表 1 和 材料表 中。</li>
	<li>进行偶联反应。
	<ol>
		<li>对于二抗，将染料溶液以 15 倍摩尔过量的比例缓慢加入玻璃小瓶中的抗体溶液中，同时搅拌。例如，在 0.5 mL 浓度为 2 mg/mL 的抗体溶液中，加入 35 µL 的 3 mM 染料溶液。</li>
		<li>室温（RT）下搅拌孵育反应混合物 1 小时，反应过程需避光。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纯化。
	<ol>
		<li>按照步骤 1.5.2–1.5.4，在 PBS 缓冲液中配制凝胶过滤树脂（材料表）的悬浮液。</li>
		<li>在 50 mL 离心管中，将 10 mL 凝胶过滤树脂粉末加入 40 mL PBS 缓冲液中。</li>
		<li>将溶液置于 90 °C 水浴中保温 1 小时。</li>
		<li>倾去上清液，重新加入 PBS 至 40 mL。将悬浮液于 4 °C 保存。</li>
		<li>用上述悬浮液装填尺寸排阻层析柱（直径 1 cm，重力流层析柱），装填高度为 10–15 cm。</li>
		<li>用约 10 mL PBS 缓冲液冲洗并洗涤层析柱，进一步压实树脂。</li>
		<li>将偶联反应混合物（约 0.5 mL）用移液器加至层析柱上。待全部样品加载后，立即加入 1 mL PBS 缓冲液作为洗脱液。持续补充洗脱液（PBS）至层析柱中。</li>
		<li>通过观察层析柱上颜色（MARS 染料呈浅绿色至蓝色）或测定 280 nm 处的吸光度（A280），收集偶联产物的洗脱液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用离心过滤器将收集的溶液浓缩至 1–2 mg/mL。</li>
	<li>使用 Nano 微孔板读板仪测定偶联产物溶液的紫外-可见（UV-Vis）吸收光谱，以确定其浓度和平均标记度（DOL，染料与蛋白的摩尔比）。 
	&#8203;注意：补充材料 提供了用于计算的 MARS 染料 NHS 酯的性质参数。二抗的典型 DOL 约为 3。</li>
</ol>
2. 组织样本制备
<ol>
	<li>多聚甲醛固定的 小鼠脑组织。
	<ol>
		<li>使用异氟烷麻醉小鼠（C57BL/6J，雌性，出生后25天）。通过脚趾夹捏试验评估麻醉是否充分。</li>
		<li>通过颈椎脱位处死小鼠。立即经心脏灌注4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PBS）。</li>
		<li>收集小鼠脑组织，参照步骤2.1.4–2.1.5进行操作。</li>
		<li>从脑干开始沿矢状缝向上剪开颅骨，将颅骨两侧掀开，用镊子取出脑组织。</li>
		<li>将收集的脑组织在4% PFA PBS溶液中4 °C固定24小时。随后在4 °C PBS缓冲液中洗涤24小时以去除多余的PFA。</li>
		<li>将固体琼脂糖加入水中，配制成终浓度为7%（w/v）的溶液，置于烧杯中并盖上松动的盖子。用玻璃搅拌棒搅拌溶液，并在微波炉中加热至溶液澄清。</li>
		<li>让琼脂糖冷却至45–55 °C。</li>
		<li>将液态琼脂糖倒入小模具中，然后将脑组织从PBS转移至液态琼脂糖中，用刮勺调整其方向以完成包埋。等待组织-琼脂糖块完全凝固。</li>
		<li>使用振动切片机将组织-琼脂糖块切成40 µm厚的冠状切片。</li>
		<li>将切片转移至4孔板中用于后续染色。用镊子去除琼脂糖，并用1 mL PBS洗涤组织三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定并冷冻的小鼠胰腺组织。
	<ol>
		<li>将小鼠胰腺组织在4% PFA PBS溶液中4 °C条件下振荡固定16–20小时。</li>
		<li>用1 mL PBS（4 °C）洗涤样本三次，以去除PFA。</li>
		<li>将样本（大小约0.3–0.5 cm）包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中。在塑料冷冻模具中加入两滴OCT，将组织置于正确方向后，继续加入OCT直至完全覆盖组织，无暴露部分。</li>
		<li>将胰腺组织切成8 µm厚的切片，并将其固定在组织粘附载玻片上，于-80 °C保存。</li>
		<li>染色前将样本平衡至室温。用PBS洗涤组织以去除OCT包埋剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>石蜡包埋组织样本（FFPE）。
	<ol>
		<li>将FFPE组织切片在60 °C烘箱中烘烤10分钟。</li>
		<li>脱蜡和复水：将样本依次置于50 mL离心管中的以下溶液中，室温下轻度振荡，每次3分钟： 
		二甲苯两次， 
		乙醇两次， 
		95%&#160;（vol/vol）乙醇水溶液两次， 
		70%&#160;（vol/vol）乙醇水溶液两次， 
		50%&#160;（vol/vol）乙醇水溶液一次， 
		去离子水一次。</li>
		<li>将样本转移至玻璃瓶中的20 mM柠檬酸钠溶液（pH 8.0），于100 °C加热。确保组织完全浸没于溶液中。</li>
		<li>将玻璃瓶置于60 °C水浴中孵育45分钟。</li>
		<li>用去离子水在室温下洗涤样本5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 组织免疫-表面增强拉曼散射染色
<ol>
	<li>使用疏水性笔在载玻片上的组织切片周围画出边界。 
	注意：后续孵育步骤中，载玻片上的组织使用切片染色缸进行处理。漂浮组织（40 µm 厚的小鼠脑切片）则在孔板中染色。</li>
	<li>将组织与 0.3–0.5% PBST（PBS 中含 Triton X-100）在室温下孵育 10 分钟。</li>
	<li>将组织与封闭缓冲液（PBS 中含 5% 驴血清和 0.5% Triton X-100）在室温下孵育 30 分钟。</li>
	<li>配制一抗染色液：将所有一抗按所需浓度加入 200–500 µL 染色缓冲液（PBS 中含 2% 驴血清和 0.5% Triton X-100）中。将一抗染色液在 13,000 × g 离心 5 分钟。若出现沉淀，则仅使用上清液。</li>
	<li>将组织在 4 °C 下与一抗溶液孵育 1–2 天。 
	注意：对载玻片上的组织切片染色时，应将样本置于染色盒中，并放入湿巾以维持湿度。</li>
	<li>用 0.3–0.5% PBST 在室温下洗涤载玻片三次，每次 5 分钟。漂浮组织使用 1 mL PBST 进行洗涤。对于载玻片上的组织，应在切片染色缸中洗涤，并确保所有组织完全浸入溶液中。</li>
	<li>将组织在 200–500 µL 封闭缓冲液中孵育 30 分钟。</li>
	<li>配制二抗染色液：将所有二抗（如需要，还包括凝集素）按所需浓度加入 200–500 µL 染色缓冲液中（通常为 10 µg/mL）。将二抗染色液在 13,000 × g 离心 5 分钟。若出现沉淀，则仅使用上清液。</li>
	<li>将组织在 200–500 µL 二抗溶液中于 4 °C 孵育 1–2 天。</li>
	<li>用 0.3–0.5% PBST 在室温下洗涤载玻片两次，每次 5 分钟。</li>
	<li>加入 200–500 µL DAPI 溶液，孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 PBS 在室温下洗涤载玻片三次，每次 5 分钟。</li>
	<li>对于漂浮的组织切片，使用玻璃移液管将其转移至玻璃载玻片上。用组织刷将组织铺展，必要时用擦拭纸清洁周围区域。</li>
	<li>在抗荧光淬灭试剂中滴加一滴，覆盖盖玻片，并用指甲油封固。</li>
</ol>
4. SRS 显微镜组装
注意：在串联SRS-荧光成像中使用商用共聚焦荧光系统。更多描述可参见先前的报告17。本方案将重点介绍使用窄带激发的SRS成像部分。
<ol>
	<li>在具有温度控制的房间内准备一个隔振光学平台。</li>
	<li>将一套同步双激光系统（泵浦光和斯托克斯光）放置在光学平台上（图2A），并连接冷却器。 
	注意：该双激光系统的基频激光器输出脉冲序列，波长为1064 nm，脉宽为6 ps，重复频率为80 MHz。斯托克斯光束来自该基频激光器，其强度通过内置的电光幅度调制器（EOM）以8 MHz正弦方式调制，调制深度超过90%。基频激光器的另一部分被倍频至532 nm，用于同步泵浦一个皮秒光学参量振荡器（OPO），产生脉宽为5–6 ps的锁模脉冲序列（OPO的闲频光束通过干涉滤光片被阻断）。OPO的输出波长可在720–950 nm范围内调节，作为泵浦光束。</li>
	<li>将反射镜（波长范围：750–1100 nm）、二向色分束镜（DBS，980 nm长通滤光片，矩形）和透镜（消色差，650–1050 nm增透镀膜）安装至各自的镜架上。反射镜和二向色分束镜应使用高度稳定的运动学镜架。</li>
	<li>测量激光输出高度以及泵浦光和斯托克斯光束的光斑尺寸。调节反射镜和透镜的高度，确保光束照射到所有光学元件的中心位置。</li>
	<li>将反射镜M1放置在光学平台上，使其与激光输出方向成约45°角（图2B）。利用运动学镜架上的调节旋钮进行俯仰和倾斜调整，确保光束沿平台长度方向保持相同高度并沿直线传播。</li>
	<li>放置并调整二向色分束镜（980 nm长通滤光片）和反射镜，以分离泵浦光和斯托克斯光束（图2A-B）。</li>
	<li>在每条光路中放置并调整透镜对（L1、L2 和 L3、L4），以准直光束并将光束直径扩展至与物镜后瞳相匹配（图2A-B）。</li>
	<li>使用M7和M8反射镜将合并后的激光束导入显微镜（图2C）。先将一束光对准显微镜，再利用另一束光的反射镜对，确保两束光在空间上完全重叠。</li>
	<li>搭建检测部分。
	<ol>
		<li>安装一个镀有红外涂层的油浸聚光镜（1.4 NA），用于收集穿过样品后的前向传播的泵浦光和斯托克斯光束（图2C）。</li>
		<li>将大面积硅光电二极管安装至带BNC接头的屏蔽盒内（图2E）。为安装好的光电二极管提供64 V直流电源，以提高其饱和阈值和响应带宽。</li>
		<li>使用一个2英寸反射镜将前向传播的光束反射，并在经过光学滤光片（用于阻断调制的斯托克斯光束）后重新聚焦到光电二极管上（图2D）。</li>
		<li>将光电二极管的输出电流送入一个以50 Ω终端匹配的高速锁相放大器进行信号解调。同时将8 MHz触发信号作为参考信号输入锁相放大器。</li>
		<li>将锁相放大器的同相X分量输出送入显微镜的模拟接口盒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过在显微镜下测量纯D2O液体的SRS信号，利用内置的电动延迟台优化两束激光的时间重叠。</li>
</ol>
5. 图像采集与分析
<ol>
	<li>通过顺序调节泵浦波长进行多通道 epr-SRS 成像。
	<ol>
		<li>在激光控制面板上将激光功率设置为 Ppump = 10–40 mW 和 PStokes = 40–80 mW。</li>
		<li>将像素驻留时间设为 2–4 µs，并在显微镜软件中使用多帧平均，通常为 10–20 帧。 
		注意：应避免高激光功率（Ppump&#62; 40 mW，PStokes&#62; 80 mW）与小像素尺寸（&#60;0.2 µm）的组合使用，这可能因多光子激发导致拉曼染料出现“漂白效应”。</li>
		<li>将锁相放大器的时间常数设置为像素驻留时间的一半。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>线性光谱解混。 
	注意：epr-SRS 在整个浓度范围内具有严格的信号与浓度线性依赖关系；因此，线性光谱解混可有效消除通道间的潜在串扰。对于使用 N 种 MARS 探针的 N 通道 epr-SRS 测量，测得的信号（S）可表示为 S = MC，其中 C 为 MARS 探针的浓度，M 为由 MARS 探针拉曼截面决定的 N × N 矩阵。
	<ol>
		<li>在用不同 MARS 探针标记的单色免疫 epr-SRS 样本上测量矩阵 M。</li>
		<li>利用公式 C = M−1·S，根据多路复用样本信号测量值 S 确定 MARS 探针的浓度矩阵。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了免疫-电子顺磁共振SRS（immuno-eprSRS）技术方案，该方法广泛适用于多种常见组织类型，包括新鲜保存的小鼠组织、福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的人体组织以及冷冻小鼠组织。该技术已在细胞和组织中针对一系列抗原表位进行了验证，具体如表1所列。这一单次检测平台特别适用于循环标记策略难以有效实施的应用场景。例如，在厚组织中进行循环荧光标记具有较高挑战性，因为多轮三维免疫标记过程在实际操作中耗时过长且难以实现17。此外，由于非线性的三维组织学形变，循环方法还极易引入图像配准误差11,17。免疫-epRSRS技术克服了此类情况下循环荧光方法的实际障碍，为在大体积样本中揭示蛋白质相互作用网络提供了新的可能17。
目前多重检测的主要限制因素是二抗的可用性。尽管本实验方案主要关注间接免疫标记（即MARS探针与二抗偶联），但直接免疫标记...

复杂的组织系统由不同的细胞亚群组成，其空间位置和相互作用网络与其功能和功能障碍密切相关1,2。为了揭示组织结构并解析其复杂性，必须掌握单细胞分辨率下蛋白质的空间定位信息。因此，高通量多重蛋白质成像技术日益受到重视，有望成为研究组织生物学的核心工具3,4,5。目前常见的多重蛋白质成像方法可分为两大类：一类是依赖多轮组织染色与成像的连续免疫荧光成像，另一类是结合重金属标记抗体的成像质谱流式技术6,7,8,9,10,11,12。
本文介绍了一种基于抗体的多重蛋白质成像替代策略。与主流的荧光成像方式不同，拉曼显微镜具有更窄的光谱线宽（半高全宽（FWHM）约10 cm-1），而荧光成像由于其较宽的激发和发射光谱（半高全宽（FWHM）约500 cm-1），通常只能同时可视化4至5个通道，因此拉曼显微镜可实现更高通量的多重检测。近年来，利用其窄谱特性，发展出一种名为电子预共振受激拉曼散射（epr-SRS）显微镜的新型拉曼成像方法，为多重成像提供了有力的技术手段13。通过探测拉曼染料中电子耦合的振动模式，epr-SRS可使拉曼截面产生高达1013倍的显著增强效应，从而克服了传统拉曼显微镜的灵敏度瓶颈（图1A）13,14,15。因此，epr-SRS的检测限已达到亚微摩尔（sub-µM）水平，使得对细胞内特定蛋白质和细胞器等重要分子标志物的拉曼检测成为可能13,16。特别是，通过使用拉曼染料标记的抗体，已实现了对细胞和组织中特定蛋白质的epr-SRS成像（称为免疫-eprSRS），其灵敏度可与标准免疫荧光方法相媲美（图1B）13,17。仅需将泵浦光波长调节2 nm，epr-SRS信号即可完全消失（图1B），显示出极高的振动对比度。
在探针方面，已开发出一组彩虹般的拉曼探针，称为曼哈顿拉曼散射（Manhattan Raman scattering, MARS）染料，用于抗体偶联13,18,19,20。这一独特的拉曼调色板包含一系列具有π-共轭三键的新型染料（补充材料），每种染料在生物正交拉曼光谱范围内均表现出单一且窄的增强型受激拉曼散射（epr-SRS）峰（图1C）。通过修饰核心发色团结构并对三键的两个原子进行同位素编辑（补充材料），已开发出光谱上相互分离的拉曼探针。利用其可扩展的多重检测能力，epr-SRS显微技术结合MARS染料调色板为细胞和组织中的单次多重蛋白质成像提供了一种光学策略。
免疫-增强型受激拉曼散射（immuno-eprSRS）为当前多重蛋白成像方法提供了一种具有独特优势的替代策略。与需要循环进行染色、成像和信号清除的荧光方法相比，这种基于拉曼的技术实现了单轮染色和成像，从而避免了循环操作中的实际复杂性，显著简化了实验流程，开辟了多重蛋白成像的新领域。例如，通过结合专为拉曼染料定制的组织透明化方案，免疫-epRSRS 已被拓展至三维空间，可在厚而完整的组织中实现高度多重的蛋白定位17。已有研究在毫米级厚度的小鼠脑组织中实现了超过10种蛋白靶标的可视化17。最近，将免疫-epRSRS 与优化的生物分子保留型膨胀显微镜（ExM）方案相结合21，还实现了多靶标的一次性纳米级成像22。与成像质谱技术4,9相比，epRSRS 具有非破坏性，并具备固有的光学切片能力。此外，epRSRS 在组织扫描中具有更高的时间效率。通常，对一个面积为 0.25 mm2、像素尺寸为 0.5 µm 的组织区域，单个 epr-SRS 通道的成像仅需几分钟。例如，图4中四个 SRS 通道加四个荧光通道的总成像时间约为 10 分钟。

<table><tbody><tr><td>16% 甲醛，电镜级</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-tubulin</td><td>Abcam</td><td>ab18251</td><td>一抗</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-tubulin</td><td>BioLegend</td><td>625902</td><td>一抗</td></tr><tr><td>&amp;beta;-III-微管蛋白</td><td>BioLegend</td><td>657402</td><td>一抗</td></tr><tr><td>&amp;beta;-III-微管蛋白</td><td>Abcam</td><td>ab41489</td><td>一抗</td></tr><tr><td>&amp;beta;-tubulin</td><td>Abcam</td><td>ab131205</td><td>一抗</td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414</td><td>用于脑组织包埋</td></tr><tr><td>兔源抗α-微管蛋白抗体（&amp;alpha;-微管蛋白)</td><td>Abcam</td><td>ab52866</td><td>一抗</td></tr><tr><td>小鼠抗钙结合蛋白抗体（Calbindin）</td><td>Abcam</td><td>ab82812</td><td>一抗</td></tr><tr><td>抗GABA B受体R2&amp;nbsp; 豚鼠来源的抗体（GABA B 受体 R2）</td><td>默克生命科学</td><td>AB2255</td><td>一抗</td></tr><tr><td>山羊抗GFAP抗体（GFAP）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>PA5-18598</td><td>一抗</td></tr><tr><td>抗胰高血糖素&amp;nbsp; 小鼠产生的抗体（胰高血糖素）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-514592</td><td>一抗</td></tr><tr><td>由豚鼠产生的抗胰岛素抗体（insulin）</td><td>DAKO</td><td>IR00261-2</td><td>一抗</td></tr><tr><td>大鼠源抗MBP抗体（MBP）</td><td>Abcam</td><td>ab7349</td><td>一抗</td></tr><tr><td>兔源抗 NeuN 抗体（NeuN）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>PA5-78639</td><td>一抗</td></tr><tr><td>抗胰多肽（PP）山羊源抗体 - 胰多肽（PP）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SAB2500747</td><td>一抗</td></tr><tr><td>兔源抗 Pdx1 抗体（Pdx1）</td><td>Millipore</td><td>06-1379</td><td>一抗</td></tr><tr><td>抗生长抑素抗体（大鼠来源）（生长抑素）</td><td>Abcam</td><td>ab30788</td><td>一抗</td></tr><tr><td>鸡源抗波形蛋白抗体（Vimentin）</td><td>Abcam</td><td>ab24525</td><td>一抗</td></tr><tr><td>带通滤光片</td><td>KR Electronics</td><td>KR2724</td><td>8 MHz</td></tr><tr><td>BNC 50 欧姆终端电阻器</td><td>Mini Circuits</td><td>STRM-50</td><td></td></tr><tr><td>BNC 电缆</td><td>Thorlabs</td><td>2249-C</td><td>同轴电缆，BNC公对公</td></tr><tr><td>宽带介电镜</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E03</td><td>750 - 1100 nm</td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚光镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>油镜，1.4 数值孔径</td></tr><tr><td>细胞角蛋白18</td><td>Abcam</td><td>ab7797</td><td>一抗</td></tr><tr><td>细胞角蛋白18</td><td>Abcam</td><td>ab24561</td><td>一抗</td></tr><tr><td>直流电源</td><td>TopWard</td><td>6302D</td><td>偏置电压为 64 V</td></tr><tr><td>二向色镜支架</td><td>Thorlabs</td><td>KM100CL</td><td>适用于最大1.3的运动学支架&quot; （33 毫米）高矩形光学元件，左手型</td></tr><tr><td>驴抗鸡IgY（H+L）</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>703-005-155</td><td>用于MARS偶联的二抗</td></tr><tr><td>驴抗山羊IgG（H+L）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-005-147</td><td>用于MARS偶联的二抗</td></tr><tr><td>驴抗豚鼠IgG（H+L）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-005-148</td><td>用于MARS偶联的二抗</td></tr><tr><td>驴抗小鼠IgG（H+L）</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>715-005-151</td><td>用于MARS偶联的二抗</td></tr><tr><td>驴抗兔IgG（H+L）</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>711-005-152</td><td>用于MARS偶联的二抗</td></tr><tr><td>驴抗大鼠IgG（H+L）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-005-153</td><td>用于MARS偶联的二抗</td></tr><tr><td>驴抗羊IgG（H+L）</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>713-005-147</td><td>用于MARS偶联的二抗</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM</td><td>Abcam</td><td>ab71916</td><td>一抗</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>443611</td><td></td></tr><tr><td>高速采样放大器</td><td>苏黎世仪器</td><td>HF2LI</td><td>DC - 50 MHz</td></tr><tr><td>FFPE 肾脏样本</td><td>USBiomax</td><td>HuFPT072</td><td></td></tr><tr><td>纤维蛋白原</td><td>Abcam</td><td>ab5821</td><td>一抗</td></tr><tr><td>Giantin</td><td>Abcam</td><td>ab24586</td><td>一抗</td></tr><tr><td>胰高血糖素</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-514592</td><td>一抗</td></tr><tr><td>H2B</td><td>Abcam</td><td>ab1790</td><td>一抗</td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>高光密度带通滤光片</td><td>Chroma Technology</td><td>ET890/220m</td><td>过滤斯托克斯光束并透射泵浦光束</td></tr><tr><td>疏水笔</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1384846</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>701265</td><td>一抗</td></tr><tr><td>集成SRS激光系统</td><td>应用物理学 &amp;安培电子有限公司</td><td>picoEMERALD</td><td>picoEMERALD 在 1,064 nm 处提供脉宽为 6 ps、重复频率为 80 MHz 的输出脉冲序列，用作斯托克斯光束。532 nm 的倍频光用于同步泵浦一台皮秒光学参量振荡器（OPO），以产生脉宽为五至六皮秒的锁模脉冲序列（OPO 的闲频光通过干涉滤光片被阻断）。OPO 的输出波长可在 720 范围内调谐&amp;ndash;950 nm，作为泵浦光束。1,064 nm的斯托克斯光束由picoEMERALD内置的电光调制器（EOM）以8 MHz频率进行正弦调制，调制深度超过90%。泵浦光束与斯托克斯光束通过picoEMERALD内部的二向色镜实现空间重叠。泵浦脉冲与斯托克斯脉冲之间的时间重叠通过内置延迟装置实现，并利用显微镜下纯D2O的受激拉曼散射（SRS）信号进行优化。</td></tr><tr><td>倒置激光扫描显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV1200MPE</td><td></td></tr><tr><td>运动学镜架</td><td>Thorlabs</td><td>POLARIS-K1-2AH</td><td>2 个低剖面六角调节器</td></tr><tr><td>普通小麦（小麦）凝集素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L0636-5 mg</td><td></td></tr><tr><td>长通二向色分光镜</td><td>Semrock</td><td>Di02-R980-25x36</td><td>980 nm 激光 BrightLine&amp;nbsp;单刃激光平面二向色分光镜</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>BioLegend</td><td>801810</td><td>一抗</td></tr><tr><td>显微成像软件</td><td>Olympus</td><td>FluoView</td><td></td></tr><tr><td>NanoQuant板</td><td>Tecan</td><td></td><td>用于酶标仪上的基于吸光度的小体积分析。</td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue 固定细胞即用型探针试剂（DAPI）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R37606</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 4孔培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-566-300</td><td></td></tr><tr><td>物镜</td><td>Olympus</td><td>XLPlan N</td><td>×25，1.05 数值孔径，MP，工作距离&amp;thinsp;=&amp;thinsp;2&amp;thinsp;毫米</td></tr><tr><td>画笔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>潜望镜组件</td><td>Thorlabs</td><td>RS99</td><td>包括上部和下部组件， &amp;Oslash;1&quot; 后部及夹持叉。</td></tr><tr><td>pH计</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Tecan</td><td>Infinite 200 PRO</td><td>一款易于使用的多功能酶标仪。可在230 nm的光谱范围内进行吸光度检测。&amp;ndash;1000 nm</td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>PSD95</td><td>Invitrogen</td><td>51-6900</td><td>一抗</td></tr><tr><td>Sephadex G-25 Medium</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-0033-01</td><td>用于脱盐和缓冲液置换的凝胶过滤树脂</td></tr><tr><td>带BNC接头的屏蔽箱</td><td>Pomona Electronics</td><td>2902</td><td>带盖铝盒，BNC 母/母</td></tr><tr><td>硅光电二极管</td><td>Thorlabs</td><td>FDS1010</td><td>350&amp;ndash;1100 纳米，10 毫米 × 10 毫米有效面积</td></tr><tr><td>突触素2</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>OSS00073G</td><td>一抗</td></tr><tr><td>组织病理学 Superfrost Plus Gold 载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-035813</td><td>黏附载玻片，用于吸引并化学结合新鲜或福尔马林固定的组织切片，使其牢固附着于载玻片表面（组织黏附玻璃载玻片）</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1000</td><td></td></tr><tr><td>波形蛋白</td><td>Abcam</td><td>ab8069</td><td>一抗</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr></tbody></table>

使用拉曼染料进行高重组织成像

Highly-Multiplexed Tissue Imaging with Raman Dyes

在组织中可视化大量特定生物标志物对于探索复杂生物系统的精细结构具有重要作用。因此，高通量成像技术日益受到重视。本文介绍一种新兴的高通量振动成像平台，该平台通过电子预共振受激拉曼散射（epr-SRS）成像技术，利用彩虹样拉曼染料实现对特定蛋白质的检测，其灵敏度可与标准免疫荧光技术相媲美。该方法突破了传统免疫荧光技术中光谱可分辨通道数量的限制，提供了一种单次光学成像即可在亚细胞分辨率下检测组织中多种标志物的方法。该技术普遍适用于标准组织样本制备方式，包括多聚甲醛固定的组织、冷冻组织以及福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的人体组织。我们预期该平台将为生物样本中的蛋白质相互作用提供更全面的图景，尤其适用于较厚的完整组织。本实验方案涵盖了从抗体制备、组织样本染色、SRS显微镜组装到epr-SRS组织成像的完整工作流程。

图3展示了epr-SRS在不同样本中的示例图像，包括固定细胞（图3A）、多聚甲醛（PFA）固定的鼠类组织（图3B）以及福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的人体标本（图3C）。SRS显微镜的空间分辨率受衍射极限限制，使用近红外光激发时，典型的横向分辨率为~300 nm，轴向分辨率为1–2 µm。因此，通过α-微管蛋白的免疫-eprSRS成像，可真实呈现HeLa细胞中微管等精细的亚细胞结构（图3A）。此外，epr-SRS通常适用于FFPE组织（图3C），而FFPE组织是临床诊断和病理学研究中常见的活检标本形式。与双光子荧光显微镜类似，作为一种非线性过程，epr-SRS具备光学切片能力，可实现具有亚细胞分辨率的三维结构成像（图3D–...

基于电子预共振受激拉曼散射（epr-SRS）的彩虹样拉曼染料成像，是一种用于高重数基于表位的蛋白质成像的新平台。本文中，我们提供了一份实用指南，包括抗体准备、组织样本染色、SRS显微镜组装以及epr-SRS组织成像。

在组织中可视化大量特定生物标志物对于探索复杂生物系统的精细结构具有重要作用。

高度多重化的振动成像提供了一种单次光学方法，可对组织中多个蛋白质标志物进行亚细胞分辨率的检测。该平台能够全面呈现生物系统中蛋白质相互作用的图景。该技术的主要优势在于其无需循环的多重检测能力。该技术特别适用于循环策略效果不佳的应用场景，例如厚组织切片。此方法能够对单个细胞进行原位表征，以帮助理解复杂系统的结构，如构建组织图谱、表征肿瘤微环境以及解析脑环路。首先，配制浓度约为 0.1 摩尔的碳酸氢钠 PBS 缓冲液，pH 调至 8.3，用作偶联缓冲液，并于 4 摄氏度保存。然后在无水二甲基亚砜中配制3毫摩尔的N-羟基琥珀酰亚胺酯功能化MARS探针溶液。将抗体固体溶解于偶联缓冲液中，使其浓度达到每毫升2毫克。对于溶解在其他缓冲液中的抗体，先使用离心过滤器进行浓缩，再加入偶联缓冲液，使其浓度达到每毫升1至2毫克。为了进行二抗的偶联反应，将染料溶液以15倍摩尔过量的比例缓慢加入玻璃小瓶中的抗体溶液中，同时搅拌，并在室温下继续搅拌孵育反应混合物1小时。为进行纯化，取10毫升凝胶过滤树脂粉末加入50毫升离心管中的40毫升PBS缓冲液中，配制成悬浊液。将该溶液置于90摄氏度水浴中保温1小时。然后倾去上清液，加入 PBS 至 40 毫升，将悬液于 4 摄氏度保存。用悬液溶液装填尺寸排阻层析柱至 10 至 15 厘米高度，随后用约 10 毫升 PBS 冲洗并洗涤层析柱，以进一步压实树脂。接着，用移液器将偶联反应混合物加至层析柱中。加入反应混合物后，立即加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）作为洗脱缓冲液。随后，通过观察柱上的颜色或在280纳米处测定吸光度来收集偶联溶液的洗脱液。使用离心过滤器将收集的溶液浓缩至每毫升一至二毫克。使用疏水性笔在载玻片上的组织切片周围画出边界。随后将组织与0.3%至0.5% PBST孵育10分钟，并用封闭缓冲液孵育30分钟。配制一抗染色液时，将所有一抗按所需浓度加入200至500微升染色缓冲液中。若出现沉淀，将一抗染色液在13,000 × g条件下离心5分钟，并使用上清液。然后将组织在4°C下于一抗溶液中孵育1至2天。在室温下，用0.3%至0.5% PBST在切片架中洗涤切片3次，每次5分钟，并确保组织完全浸没于溶液中。随后，将组织在 200 至 500 微升封闭缓冲液中孵育 30 分钟。为配制二抗染色液，将所有二抗按所需浓度加入 200 至 500 毫升染色缓冲液中。然后以 13,000 × g 离心 5 分钟，若出现沉淀，则使用上清液。接着，将组织在 200 至 500 微升二抗溶液中于 4 摄氏度孵育 1 至 2 天。然后在室温下用 0.3% 至 0.5% PBST 洗涤切片两次，每次 5 分钟。随后加入 200 至 500 微升 DAPI 溶液孵育 30 分钟。再次于室温下用 PBS 洗涤载玻片三次，每次五分钟，并用玻璃滴管将漂浮的组织切片转移至玻璃载玻片上。用组织刷将组织展开，必要时用擦拭纸清洁周围区域。随后，在组织上滴加抗荧光淬灭封片试剂，盖上玻璃盖玻片并用指甲油封固。进行多通道-eprSRS成像时，在激光控制面板上将泵浦光束的激光功率设置为10至40毫瓦，斯托克斯光束的激光功率设置为40至80毫瓦。然后在显微镜软件中将像素驻留时间设置为2至4微秒，并采用多帧平均，通常为10至20帧。此外，将锁相放大器的时间常数设置为像素驻留时间的一半。通过免疫标记法对不同蛋白质标志物、HeLa细胞、经多聚甲醛固定的鼠脑皮层以及福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的湿润肾脏组织进行拉曼染料成像。利用α-微管蛋白对HeLa细胞进行增强型受激拉曼散射（eprSRS）成像，揭示了微管等精细的亚细胞结构。对经MARS 2145染色的星形胶质细胞和经MARS 2228染色的小脑颗粒神经元进行eprSRS成像，展示了具有亚细胞分辨率的三维分布模式。对冷冻的小鼠胰岛组织进行了七色SRS荧光串联成像，以检测激素和转录因子。所获得的图像显示出良好的对比度和正确的分布模式。对多聚甲醛固定的鼠小脑组织进行了八色SRS荧光串联成像，以检测细胞类型标志物。鉴定了多种类型的细胞，如小脑颗粒神经元、浦肯野神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞以及GABA能神经元。该方法可进一步与组织透明化技术联用，以实现对厚而完整的组织进行高重蛋白成像。本课题组已为此开发了一种针对拉曼染料优化的组织透明化方案。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

使用拉曼染料进行高度多重组织成像

来源： Espinoza, R., et al．利用实时双色受激拉曼散射成像技术对小鼠脑组织进行组织学诊断． J. Vis. Exp. (2022)．...

双色受激拉曼散射成像小鼠脑组织

我们介绍一种对冷冻组织进行多光谱成像的快速染色方法。...

一种用于冷冻组织切片多光谱荧光成像的快速方法

受激拉曼散射（SRS）显微技术能够基于特定化学键的固有振动，实现对生物分子的无标记成像。本实验方案描述了一种集成式受激拉曼散射与双光子荧光显微镜的仪器装置，用于在活体小鼠脊髓中可视化细胞结构。...

体内 生物组织成像：双光子荧光与受激拉曼散射显微技术结合

受激拉曼散射（SRS）显微技术是一种强大、无损且无需标记的成像技术。其中一个新兴应用是受激拉曼组织学，该方法利用蛋白质和脂质拉曼跃迁处的双色SRS成像生成类似苏木精和伊红染色的图像。本文中，我们展示了一种用于组织诊断的实时双色SRS成像方案。...

小鼠脑组织诊断的实时双色受激拉曼散射成像

本文介绍了光谱聚焦模块与双输出脉冲激光器的集成，实现了对金纳米颗粒和癌细胞的快速高光谱成像。本研究旨在展示在标准激光扫描显微镜上实现多模态非线性光学技术的详细方法。...

利用多模态非线性光学显微技术对细胞摄取纳米颗粒的生物分子成像

我们提出了一种利用宽带受激拉曼散射（SRS）显微技术获取化学图像的实验方案。该方案基于采用多通道差分锁相检测的SRS显微镜，详细描述了样品制备、SRS仪器调节以及化学计量学方法，用于解析化学非均质样品中不同组分的成分信息。...

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用于石蜡组织样本单细胞分析中免疫谱型与空间定位特征的多重条形码图像分析

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本方案介绍了一种多模态方法，结合拉曼光谱与层析相位显微技术，用于无标记、非侵入性地对活体人乳腺癌细胞进行表型分析。该方法包含一个用户友好、无主观偏倚的分析流程，可实现快速、定量的形态-化学分析，为癌症研究和细胞生物学提供详细的分子与结构信息。...

一种多模态成像框架推动无标记活体乳腺癌细胞表型分析

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利用光谱共聚焦显微镜进行高重成像以最小化非特异性组织自发荧光

学习电子预共振受激拉曼散射成像技术，用于厚组织切片的多重蛋白标记分析。该方法实现亚细胞分辨率的无循环多重成像，适用于肿瘤微环境表型和脑回路分析。

使用拉曼染料进行高重组织成像

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