使用拉曼染料进行高度多重组织成像
2022年4月21日
彩虹状拉曼染料的电子预共振受激拉曼散射（epr-SRS）成像是高度多重表位蛋白质成像的新平台。在这里，我们提供了一个实用指南，包括抗体制备，组织样品染色，SRS显微镜组装和epr-SRS组织成像。
高度多重振动成像提供了一种单次光学方法，以亚细胞分辨率询问组织中的多种蛋白质标记物。该平台提供了生物系统蛋白质相互作用的全面图片。该技术的主要优点是其无周期的多重性。
该技术特别适用于循环策略不能很好地发挥作用的应用，例如在厚组织切片中。该方法能够原位表征单个细胞，以了解复杂系统的结构，例如构建组织图谱，表型肿瘤微环境和分析脑回路。首先，在PHA 0.3的PBS缓冲液中制备约0.1摩尔碳酸氢钠，用作共轭缓冲液并将其储存在四摄氏度。
然后在无水二甲基亚砜中制备三毫摩尔正羟基琥珀酰亚胺酯功能MARS探针溶液。将抗体固体溶解在偶联缓冲液中，浓度为每毫升两毫克。对于溶解在其他缓冲液中的抗体，将它们浓缩在离心过滤器中，然后加入到偶联缓冲液中，浓度为每毫升一到两毫克。
为了进行二抗的偶联反应，在搅拌下缓慢地向玻璃瓶中的抗体溶液中加入15倍摩尔过量的染料溶液，并在室温下搅拌孵育反应混合物一小时。为了进行纯化，通过在50毫升管中将10毫升凝胶过滤树脂粉末加入40毫升PBS缓冲液中来制备浆料。将溶液保持在90摄氏度的水浴中一小时。
然后倾析上清液，加入PBS至40毫升，并将浆料储存在4摄氏度。将尺寸排阻柱与浆液一起包装至10至15厘米的高度，然后用约10毫升PBS冲洗并洗涤柱以进一步包装树脂。随后，将偶联反应混合物移液到色谱柱中。
加载反应混合物后，立即加入一毫升PBS作为洗脱缓冲液。然后，通过观察柱上的颜色或通过测量280纳米处的吸光度来收集共轭溶液的淋洗液。使用离心过滤器，将收集的溶液浓缩至每毫升一至两毫克。
使用疏水笔，在载玻片上的组织部分周围绘制一个边界。然后将组织用0.3至0.5%PBST孵育10分钟，并用封闭缓冲液孵育30分钟。为了制备初级染色溶液，将所有一抗以所需浓度加入200至500微升染色缓冲液中。
将初级染色溶液以13， 000倍G离心5分钟，如果出现沉淀物，则使用上清液。然后将组织在一抗溶液中以四摄氏度孵育一至两天。用0.3至0.5%PBST在室温下在载玻片立罐中洗涤载玻片三次，并确保组织浸入溶液中。
之后，将组织在200至500微升封闭缓冲液中孵育30分钟。为了制备二次染色溶液，将所有二抗加入200至500毫升具有所需浓度的染色缓冲液中。然后将二次染色溶液以13， 000倍G离心五分钟，如果出现沉淀物，则使用上清液。
接下来，将组织在200至500微升的二抗溶液中以4摄氏度孵育一至两天。然后在室温下用0.3至0.5%PBST洗涤载玻片两次，每次洗涤五分钟。此外，用200至500微升DAPI溶液孵育30分钟。
再次，在室温下用PBS洗涤载玻片三次，每次洗涤五分钟，并用玻璃滴管将漂浮的组织切片转移到载玻片上。用纸巾刷铺开纸巾，并在需要时用湿巾清洁周围。随后，将组织安装在一滴带有玻璃盖玻片的防褪色试剂中，并用指甲油固定。
要执行多通道 eprSRS 成像，请在激光控制面板上将泵浦光束的激光功率设置为 10 至 40 毫瓦，将斯托克斯光束设置为 40 至 80 毫瓦。然后将像素停留时间设置为两到四微秒，并在显微镜软件上使用多个帧，平均为10到20帧。此外，将锁相放大器的时间常数设置为像素停留时间的一半。
通过免疫标记对不同蛋白质标志物和HeLa细胞多聚甲醛固定小鼠脑皮层和湿润肾FFPE组织进行拉曼染料成像。具有α-微管蛋白的HeLa细胞的免疫- eprSRS成像揭示了精细的亚细胞结构，如微管。小鼠脑组织中MARS 2145染色星形胶质细胞和MARS 2228染色小脑颗粒神经元的eprSRS成像显示出亚细胞分辨率的三维模式。
对冷冻小鼠胰岛组织上的激素和转录因子进行七色SRS荧光串联成像。获得的图像显示出良好的对比度和正确的图案。对多聚甲醛固定小鼠小脑组织上的细胞类型标记物进行8色SRS荧光串联成像。
鉴定出不同类型的细胞，如小脑颗粒神经元，浦肯野神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞和GABA能神经元。该过程可以进一步与组织清除相结合，以在厚的完整组织中进行高度多重的蛋白质成像。我们的团队为其开发了一种拉曼染料定制的组织清除方案。
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概述
本文介绍电子预共振受激拉曼散射（epr-SRS）成像作为一种高度多重化蛋白质成像的新平台。该技术允许对生物组织中的蛋白质相互作用进行亚细胞分辨率的详细探测。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 成像技术
背景
- 高度多重化的振动成像使一次性光学分析成为可能。
- 该方法对于厚组织切片有效，在这些切片上循环策略无效。
- 它允许对单个细胞进行原位表征。
- 应用包括建立组织图谱和描绘肿瘤微环境。
研究目的
- 提供epr-SRS成像的实用指南。
- 促进抗体制备和组织样品染色。
- 详细说明SRS显微镜的组装和成像协议。
使用的方法
- 制备PBS缓冲液中的碳酸氢钠用于结合。
- 用类似彩虹的拉曼染料对组织样品进行染色。
- 组装SRS显微镜进行成像。
- 在组织样品上实施epr-SRS成像技术。
主要结果
- 展示了蛋白质成像的无循环多重化。
- 实现了蛋白质相互作用的全面可视化。
- 促进了复杂生物系统中单个细胞的表征。
- 显示了在肿瘤微环境表型分析中的潜在应用。
结论
- epr-SRS成像是一种用于多重化蛋白质分析的强大工具。
- 该技术增强了对生物系统在细胞水平上的理解。
- 它为神经科学和生物学研究开辟了新途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
Highly-multiplexed tissue imaging with Raman dyes enables simultaneous visualization of numerous protein markers in complex tissues, overcoming the spectral limitations of conventional immunofluorescence. This capability is critical for comprehensive mapping of cellular phenotypes and microenvironments, supporting high-confidence target validation and mechanistic de-risking in discovery-stage biopharma pipelines. The platform's compatibility with standard tissue preparations and thick sections positions it as a reusable asset for translational research and portfolio-wide biomarker strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of multiple protein targets and pathways in situ for robust hypothesis testing.
- Supports biological de-risking by revealing spatial protein interactions at subcellular resolution.
- Facilitates predictive confidence in target selection through comprehensive tissue phenotyping.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multiplexed tissue systems for downstream screening and compound evaluation.
- Delivers quantitative, reproducible imaging outputs for assay standardization.
- Enables scalable, cycle-free multiplexity for high-throughput biomarker analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant tissue models for translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting thick, intact tissue imaging.
- Reduces risk in advancement decisions by providing comprehensive cellular and microenvironmental profiles.
Pipeline & Workflow Integration
This highly-multiplexed imaging platform integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, enabling seamless data continuity and cross-functional reuse.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway mapping by visualizing multiple markers in complex tissues.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible imaging outputs for compound and biomarker evaluation.
- Analytics: Generates quantitative, multi-channel readouts for robust statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling biomarker alignment in disease-relevant tissues.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, cycle-free multiplexing capability adaptable across tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable imaging workflows for diverse tissue formats.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling comprehensive tissue profiling.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody conjugation and advanced vibrational imaging instrumentation.
- Demands access to SRS microscopy and analytical infrastructure for multi-channel data acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of staining and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptable to various tissue preparations, including FFPE, frozen, and paraformaldehyde-fixed samples.
- Cycle-free multiplexity is especially advantageous for thick tissue sections where cycling is impractical.
