Name: 小鼠小肠上皮类器官与先天性淋巴细胞的共培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 学习建立小鼠小肠类器官与1型先天淋巴细胞共培养体系，用于研究肠道上皮与免疫细胞的双向相互作用。该方法为探索肠道稳态调控及炎症性肠病机制提供可控体外模型。

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E.R. 感谢惠康信托基金（Wellcome Trust，项目编号：215027/Z/18/Z）提供的博士研究生奖学金。G.M.J. 感谢惠康信托基金（Wellcome Trust，项目编号：203757/Z/16/A）提供的博士研究生奖学金。D.C. 感谢英国国家卫生研究所盖伊与圣托马斯生物医学研究中心（NIHR GSTT BRC）提供的博士研究生助学金。J.F.N. 感谢玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里奖学金、国王奖学者项目、RCUK/UKRI卢瑟福基金奖学金（MR/R024812/1）以及惠康信托基金科学种子奖（204394/Z/16/Z）。我们还感谢位于盖伊医院的BRC流式细胞术核心团队。Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 报告基因小鼠由 G. Eberl（法国巴黎巴斯德研究所）慷慨惠赠。CD45.1 C57BL/6 小鼠由 T. Lawrence（伦敦国王学院，伦敦）和 P. Barral（伦敦国王学院，伦敦）惠赠。

<ol><li>Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mend+your+fences%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mend your fences.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).</li>
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<li>Hoyler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+GATA-3+controls+cell+fate+and+maintenance+of+type+2+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-25-responsive%2C+lineage-negative+KLRG1hi+cells+are+multipotential+%27inflammatory%27+type+2+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells.</a> Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).</li>
<li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529, 221-225 (2016).</li>
<li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+tuft+cells+initiate+type+2+mucosal+immunity+to+helminth+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites.</a> Nature. 529, 226-230 (2016).</li>
<li>Eberl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+function+for+the+nuclear+receptor+RORgamma%28t%29+in+the+generation+of+fetal+lymphoid+tissue+inducer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells.</a> Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).</li>
<li>Spits, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cells--a+proposal+for+uniform+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature.</a> Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).</li>
<li>Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+lymph+nodes+collect+CD4%2BCD3-+LTbeta%2B+cells+that+can+differentiate+to+APC%2C+NK+cells%2C+and+follicular+cells+but+not+T+or+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells.</a> Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).</li>
<li>Lindemans, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-22+promotes+intestinal-stem-cell-mediated+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration.</a> Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).</li>
<li>Meininger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+features+of+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific features of innate lymphoid cells.</a> Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).</li>
<li>Dutton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+innate+lymphoid+cell+populations+at+different+sites+in+mice+with+defective+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Open+Research%22%5BJournal%5D)">Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity.</a> Wellcome Open Research. 2, 117(2018).</li>
<li>Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+innate+lymphoid+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of innate lymphoid cell subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).</li>
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<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
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<li>Bartfeld, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+infectious+diseases+and+host-microbe+interactions+in+gastrointestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids.</a> Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Tallapragada, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflation-collapse+dynamics+drive+patterning+and+morphogenesis+in+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Inflation-collapse dynamics drive patterning and morphogenesis in intestinal organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (9), 1516-1532 (2021).</li>
<li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+lymphocytes+from+the+mouse+small+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281(2018).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li>
<li>O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+maintenance+of+mouse+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells.</a> Bio-protocol. 6 (4), 1733(2016).</li>
<li>Serra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+and+symmetry+breaking+in+intestinal+organoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development.</a> Nature. 569 (7754), 66-72 (2019).</li>
<li>Lukonin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+intestinal+organoid+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration.</a> Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).</li>
<li>Cardoso, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regulation+of+type+2+innate+lymphoid+cells+via+neuromedin+U%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U.</a> Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).</li>
<li>Gury-BenAri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+and+regulatory+landscape+of+intestinal+innate+lymphoid+cells+are+shaped+by+the+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome.</a> Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).</li>
<li>Seehus, C., Kaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+murine+innate+lymphoid+cells+from+common+lymphoid+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of murine innate lymphoid cells from common lymphoid progenitor cells.</a> Bio-protocol. 6 (6), 1770(2016).</li>
</ol>

作者无利益冲突。

本方案描述了建立小鼠小肠类器官、通过最大限度减少肠道解离过程中淋巴细胞丢失来分离稀有ILC1细胞，以及在这两类组分之间建立共培养体系的方法。该方案包含多个步骤，其中部分步骤虽针对ILC1细胞，但此方法亦可应用于其他肠道免疫细胞类型，共培养体系亦可根据具体研究问题进行模块化调整。本文重点指出了若干关键步骤（建议不得偏离）以及针对技术上较具挑战性环节的故障排除指南。
利用单个Lgr5+-eGFP肠干细胞培养小鼠小肠类器官的方法已日益成熟33,34；然而，本方案建议从CD45.1动物中分离完整的利贝昆隐窝（crypts of Lieberk&uuml;hn）。完整的隐窝不仅比单个Lgr5+细胞恢复更快，而且使用无GFP报告基因的CD45.1动物可确保在类器官共培养体系中不会混入污染性的CD45.2+固有淋巴样细胞（ILC），同时也兼容含有GFP报告系统的免疫细胞的使用。根据作者的经验，类器官经过1-3次传代...

肠道上皮与肠道定居免疫系统之间的相互作用对于维持肠道稳态至关重要1。这些相互作用的紊乱与局部及全身性疾病相关，包括炎症性肠病（IBD）和胃肠道癌症2。近年来研究发现一个对稳态具有重要调控作用的例子，即天然淋巴细胞（ILCs）的研究，这类细胞已被确认为肠道免疫环境中的关键参与者3。ILCs 是一组异质性的天然免疫细胞，主要通过细胞因子介导的信号传导来调节肠道稳态并协调炎症反应4。
小鼠ILC根据转录因子、受体和细胞因子表达谱 broadly 分为亚型51型固有淋巴细胞（ILC1s），包括具有细胞毒性的自然杀伤（NK）细胞和辅助样1型固有淋巴细胞（ILC1s），其特征是表达转录因子eomesodermin（Eomes）以及T细胞中表达的T-box蛋白（T-bet）。6，分别分泌与T辅助细胞1型（TH1）免疫：在白细胞介素（IL）-12、IL-15 和 IL-18 刺激下产生的干扰素-γ（IFNγ）和肿瘤坏死因子（TNF）7在稳态条件下，组织驻留的 ILC1 分泌转化生长因子 β（TGF-β），以促进上皮细胞增殖和基质重塑。82型固有淋巴细胞（ILC2s）主要响应蠕虫感染 通过 2型辅助性T细胞（T helper type-2, Th2）的分泌H2）相关细胞因子：IL-4、IL-5 和 IL-13，其特征为视黄酸相关孤儿受体（ROR）α（ROR-α）的表达9 和GATA结合蛋白3（GATA-3）10,11,12在小鼠中，肠道 &#34;炎症的&#34; ILC2细胞的特征还包括表达杀伤细胞凝集素样受体（G亚家族成员1，KLRG）13 它们对上皮簇细胞分泌的IL-25产生反应14,15最后，3型固有淋巴细胞（ILC3s），包括淋巴组织诱导细胞和辅助样3型固有淋巴细胞，依赖于转录因子ROR-γt16，并聚集成群，分别在局部IL-1β和IL-23信号刺激下分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IL-17或IL-2217淋巴组织诱导细胞在派伊尔集合淋巴结中聚集，对于发育过程中这些次级淋巴器官的形成至关重要18，而ILC3是成年小鼠小肠固有层中数量最多的固有淋巴细胞亚型。早期建立的小鼠肠道类器官与ILC3共培养体系之一，被用于解析细胞因子IL-22对信号转导及转录激活蛋白3（STAT-3）介导的富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5（Lgr5）的影响+ 肠道干细胞增殖19，一个强大的再生性ILC-上皮相互作用实例。ILC在不同器官间表现出印记异质性20,21 并在极化细胞因子的作用下在不同亚群间表现出可塑性22是什么驱动了这些组织特异性的表观遗传印记和可塑性差异，它们在炎症性肠病等慢性疾病中又发挥着怎样的作用？23仍然是引人入胜的研究课题，有望通过类器官共培养技术加以解决。
肠道类器官已成为研究肠上皮的一种成功且可靠的模型24,25。这些类器官通过培养肠上皮Lgr5+干细胞或包含潘氏细胞（作为Wnt家族成员3A（Wnt3a）内源性来源）的完整分离隐窝而生成。这些三维结构可在合成水凝胶26或模拟基底膜固有层的生物材料（例如热交联基底膜外基质（TBEM））中维持培养，并额外添加模拟周围微环境的生长因子，其中尤为关键的是表皮生长因子（EGF）、骨形态发生蛋白（BMP）抑制剂Noggin，以及Lgr5配体和Wnt激动剂R-Spondin127。在此条件下，类器官保持上皮细胞顶-基底极性，并重现肠上皮隐窝-绒毛结构：芽状的干细胞隐窝在类器官中心终末分化为吸收细胞和分泌细胞，随后通过失巢凋亡（anoikis）脱落至内部假腔中28。尽管肠道类器官作为简化模型，在独立研究上皮发育与动态过程方面已展现出巨大优势29,30，但其在未来理解这些行为如何受到免疫组分调控、影响甚至破坏方面仍具有巨大潜力。
在以下方案中，描述了一种小鼠小肠类器官与固有层来源的ILC1细胞共培养的方法，该方法最近被用于发现此类细胞群体出乎意料地降低肠道炎症相关特征，反而促进上皮细胞增殖增强 通过 TGF-β 在此系统中8.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45 (BV510)</td><td>BioLegend</td><td>103137</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 NK1.1 (PE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-5941-83</td><td></td></tr><tr><td>B-27 补充剂 (50X)，无血清</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CD127 单克隆抗体 (APC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-1271-82</td><td></td></tr><tr><td>CD19 单克隆抗体 (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>CD3e 单克隆抗体 (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0051-82</td><td></td></tr><tr><td>CD5 单克隆抗体 (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 D，500 mg</td><td>Merck</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex HA-RSpondin1-Fc HEK293T 细胞</td><td>该细胞系用于收集条件培养基中的 RSpondin1 上清液，细胞系及材料转移协议由 Leland Stanford Junior University 董事会（Calvin Kuo，医学博士，哲学博士，斯坦福大学）提供</td><td></td><td></td></tr><tr><td>中性蛋白酶 II（中性蛋白酶，II 型级）</td><td>Merck</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1X) 改良 Eagle 培养基与 F-12 营养混合物（高级 DMEM/F12）</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I，II 型级</td><td>Merck</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良 Eagle 培养基 (1X)</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2482-100</td><td></td></tr><tr><td>FC 封闭剂</td><td>2B Scientific</td><td>BE0307</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，经鉴定，热灭活</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100X)</td><td>Gibco</td><td>3050-038</td><td></td></tr><tr><td>Hanks 平衡盐溶液 (10X)</td><td>Gibco</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1X)</td><td>Gibco</td><td>12549069</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293T-mNoggin-Fc 细胞</td><td>该细胞系用于收集条件培养基中的 Noggin 上清液，细胞系通过与荷兰乌得勒支 Uppsalalaan 8, 3584 CT 乌得勒支的 Hubrecht 研究所签订材料转移协议获得，基于 Farin、Van Es 和 Clevers 在 Gastroenterology（2012）发表的研究</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液 (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>KLRG1 单克隆抗体 (PerCP eFluor-710)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-5893-82</td><td></td></tr><tr><td>活/死可固定蓝色死细胞染色试剂盒，适用于紫外激发</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6G/Ly-6C 单克隆抗体 (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 生长因子减少型基底膜基质，无酚红，无 LDEV</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>N-2 补充剂 (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸 (500 mM)</td><td>Merck</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NKp46 单克隆抗体 (PE Cyanine7)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25-3351-82</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1X) pH 7.2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12549079</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Gibco</td><td>70013032</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Cytiva</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>重组人 EGF，无动物成分蛋白</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IL-15 GMP 蛋白，CF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>247-GMP</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IL-2（无载体）</td><td>BioLegend</td><td>589106</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-7（无载体）</td><td>R&amp;D Systems</td><td>407-ML-005/CF</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二盐酸盐（ROCK 抑制剂）</td><td>Bio-techne</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 管</td><td>Falcon</td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 管</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 移液管</td><td>StarLab</td><td>E4860-0010</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 管</td><td>Falcon</td><td>11507411</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 移液管</td><td>StarLab</td><td>E4860-0025</td><td></td></tr><tr><td>p10 移液器吸头</td><td>StarLab</td><td>S1121-3810-C</td><td></td></tr><tr><td>p1000 移液器吸头</td><td>StarLab</td><td>I1026-7810</td><td></td></tr><tr><td>p200 移液器吸头</td><td>StarLab</td><td>E1011-0921</td><td></td></tr><tr><td>标准组织培养处理的 24 孔板</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>CO₂ 和温度控制培养箱</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170 R/S</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞分选仪</td><td>BD equipment</td><td>FACS Aria II</td><td></td></tr><tr><td>加热振荡器</td><td>Stuart Equipment</td><td>SI500</td><td></td></tr><tr><td>冰盒</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>倒置光学显微镜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EVOS XL Core 成像系统 (AMEX1000)</td><td></td></tr><tr><td>p10 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3124000016</td><td></td></tr><tr><td>p1000 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3124000063</td><td></td></tr><tr><td>p200 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3124000032</td><td></td></tr><tr><td>移液枪</td><td>Eppendorf</td><td>4430000018</td><td></td></tr><tr><td>湿冰</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠小肠上皮类器官与固有淋巴细胞的共培养

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

类器官与免疫细胞的复杂共培养体系为研究黏膜稳态背后双向相互作用提供了多功能工具。这种三维多细胞系统为研究多因素疾病以及解决在分析组织驻留固有淋巴细胞（ILC）等稀有细胞类型时遇到的技术难题提供了一种简化的模型。本文描述了一种小鼠体系，将小肠类器官与来源于小肠固有层的辅助样1型固有淋巴细胞（ILC1s）相结合，该体系可轻松扩展至其他ILC或免疫细胞群体。ILC是一类在黏膜中尤为富集的组织驻留型细胞群体，能够促进稳态，并在组织损伤或感染时迅速响应。类器官与ILC的共培养已开始揭示肠道中上皮-免疫信号模块的新机制，阐明不同ILC亚群如何影响肠上皮屏障的完整性与再生能力。本实验方案将推动上皮细胞与免疫细胞之间双向相互作用的进一步研究，有望为黏膜稳态与炎症机制提供新的见解。

成功时，新分离的隐窝应在2-4天内形成出芽状的隐窝结构（图1A）。健康且状态良好的类器官培养物应处于活跃生长状态，可按照本方案中详述的步骤进行传代和扩增。
本方案描述了从小肠中分离RORγtGFP转基因报告小鼠品系的固有淋巴细胞1型（ILC1）的方法，该品系可用于通过流式细胞荧光分选（FACS）分离活的ILC1（图2）。采用本方案，预期可获得350–3,500个分离的ILC1细胞。
接种类器官后，可通过免疫细胞化学方法观察共培养体系（图3A-B）。ILC和上皮细胞也可通过流式细胞术进行分析，如图3C所示。ILC1可上调上皮细胞中CD44的表达，流式细胞术分析（图...

本方案提供了建立小鼠小肠类器官、从小鼠小肠固有层中分离1型固有淋巴细胞，以及在两种细胞类型之间建立三维（3D）共培养体系的详细操作步骤，用于研究肠上皮细胞与1型固有淋巴细胞之间的双向相互作用。

类器官与免疫细胞的复杂共培养为研究双向相互作用提供了多功能工具，这些相互作用是精细调控的……

本方案为研究肠道免疫细胞与上皮之间的相互作用，以及解析这些相互作用如何调控肠道稳态与炎症提供了重要的工具。该技术的主要优势在于，通过简化的体外模型实现了极高的实验可控性，可用于解答上皮生物学和免疫生物学中的相关问题。该系统已用于确定ILC1在CD44阳性上皮隐窝扩增中的作用，并有望进一步推动我们对炎症介导的胃肠道疾病的理解。首先，将热交联基础细胞外基质置于冰上解冻，并将标准组织培养处理的24孔板放入37°C培养箱中预热。随后，从培养箱中取出含有类器官的培养板，弃去待传代孔中的培养基。然后，向各孔中加入500 µL冰上预冷的高级DMEM/F12培养基，使用P-1000枪头将所有孔中的类器官收集至15 mL离心管中。用 250 至 300 微升冰上预冷的高级 DMEM/F12 培养基冲洗孔板底部，确保无类器官残留于孔中，并将其收集至含有已收获类器官的 15 毫升离心管中。将收获后培养一天至两天的类器官沉淀重悬于 1 毫升冰上预冷的高级 DMEM/F12 培养基中。根据固有淋巴细胞重复样本的数量，预先用 PBS2 包被若干 1.5 毫升离心管，然后使用经 PBS2 预包被的枪头，将约 100 至 200 个类器官分装至各管中。使用经 PBS2 包被的 P-1000 吸头，将根据分选步骤计算出的不少于 500 个 ILC1s 的体积加入至含有类器官的经 PBS2 包被的 1.5 毫升离心管中。在 4 摄氏度下以 300 G 离心 5 分钟，使 ILC1s 和类器官沉淀；注意避免使用小直径台式离心机，因其会将细胞沿管壁内侧甩开，而非在管底形成沉淀。随后，缓慢轻柔地移除上清液，切勿扰动沉淀，将样品置于冰上。将培养管置于冷表面，用至少10至15次吹打，将类器官和ILC重悬于30 µL温敏交联基础细胞外基质中，以确保均匀分布。将含有ILC类器官的30 µL温敏交联基础细胞外基质加入预热的24孔或48孔板的每个孔中，形成单个圆顶状结构。随后，将培养板直接放入37°C、5% CO₂的培养箱中孵育10至20分钟。然后，每孔加入 550 微升含有任何所需实验性细胞因子或阻断抗体的完全 ILC1 培养基，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养 24 小时。24 小时后，轻柔地将培养板从培养箱中取出，置于生物安全柜中静置 1 分钟，以确保淋巴细胞充分沉降。移除 200 至 250 微升培养上清，转移至 24 孔板中的一个空孔内。使用倒置显微镜检查上清液，确保未去除任何淋巴细胞。若上清液清澈，向原孔中的共培养体系加入 300 微升新鲜 ILC1 培养基。若上清液中存在淋巴细胞，则在 4 摄氏度下以 300 至 400 ×g 离心 3 至 5 分钟，并将沉淀重悬于 300 微升新鲜 ILC1 培养基中。然后，将细胞悬液加入原始孔中剩余的 200 至 250 微升培养基中。使用免疫荧光、流式细胞术或FACS对目标细胞群进行分选并收集至裂解缓冲液中，随后通过单细胞或批量RNA测序或RT-qPCR进行基因表达分析，具体方法如文中所述。传代成功后，健康的类器官培养物显示，新分离的隐窝应在2至4天内形成出芽状隐窝结构。通过流式细胞术分析，从小肠中分离出ROR gamma-T小鼠转基因报告基因品系的ILC1细胞，预期的ILC细胞数量范围为350至3,500个分离细胞。将类器官接种后，可通过免疫细胞化学染色观察共培养体系。共聚焦显微镜显示了单独培养以及在ILC1存在条件下培养的小肠类器官图像。免疫细胞化学染色显示，在类器官与ILC1共培养体系中，CD45阳性的ILC1与Zonula occludens蛋白-1阳性的上皮细胞紧密相邻。流式细胞术表明，上皮细胞黏附分子标记类器官中的肠道上皮细胞，而CD45标记ILC1。流式细胞术图谱及免疫化学分析显示，当肠道上皮细胞与ILC1共培养时，其CD44表达水平升高。RT-qPCR 研究表明，ILC1 共培养特异性上调了 CD44 变异体 6，而该上调作用可被 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 中和抗体所抑制，并在仅含小肠类器官的培养体系中被重组 TGF-β1 所增强。在操作类器官时应动作轻柔，以确保完整结构得以维持，并在离心后检查结构是否已充分沉淀。通过引入其他免疫和非免疫组分以增加系统的复杂性，该体外系统可用于进一步探究肠道生物学中的更多问题。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

小鼠小肠上皮类器官与先天性淋巴细胞的共培养

在本视频方案中，我们将逐步讲解如何对原代肠上皮类器官进行慢病毒转导，并介绍这些培养物的后续处理及定量RT-PCR、RNA微阵列和免疫组织化学分析方法。...

一种用于肠道类器官慢病毒转导及下游分析的实验方案

由干细胞衍生的培养物在模拟感染性疾病方面具有巨大潜力。本文介绍了源自成体干细胞的小鼠和人类胃类器官的培养方法。通过显微注射将胃部病原体Helicobacter...

类器官作为感染性疾病的模型：人和小鼠胃类器官的培养及幽门螺杆菌的显微注射

本文描述了一种从小鼠小肠类器官中收获、维持并用病原体相关分子模式（PAMPs）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria...

该 离体 小鼠肠道类器官的培养与模式识别受体刺激

在本实验方案中，我们描述了如何直接从肠隐窝分离并培养小鼠原代结肠上皮单层细胞。我们提供了在可渗透滤膜上生成汇合单层细胞的实验方法，用于划痕伤口愈合及生物化学研究的汇合单层细胞培养方法，以及用于免疫荧光分析的稀疏和汇合单层细胞培养方法。...

从小鼠肠道隐窝生成原代结肠上皮单层细胞

本文介绍了两种可用于模拟肠道顶膜特异性相互作用的实验方案。类器官来源的肠道单层细胞培养和气液界面（ALI）培养可形成高度分化的上皮层，且可同时从管腔侧和基底侧进行操作；而极性翻转的肠道类器官则将其顶膜暴露在外，适用于高通量检测。...

利用肠道类器官模型研究顶端特异性相互作用的培养方法

本实验方案描述了建立小鼠结肠类器官系统，用于研究在claudin-7基因敲除模型中结肠干细胞的活性与功能。...

小鼠结肠隐窝的三维培养用于研究肠道干细胞功能 离体

本文介绍了一种利用冷冻保存的猪肠上皮隐窝培养三维类器官的方案。同时，我们还描述了一种由三维类器官衍生建立细胞单层的方法，可实现对上皮细胞顶膜侧的接触与研究。...

从冷冻保存的肠上皮隐窝培养仔猪肠道三维类器官及建立单层细胞模型

我们描述了一种分离小鼠小肠隐窝并从隐窝培养肠道三维类器官的方案。此外，我们还介绍了一种在无上皮下细胞微环境的条件下，由单个肠干细胞生成类器官的方法。...

从小鼠肠隐窝及单个干细胞进行类器官的三维培养用于类器官研究

该研究提出了一种方法 体外 细菌感染的研究 利用组织干细胞来源的肠道类器官。该方案描述了如何在二维条件下培养和分化类器官，并用黏附侵袭性...

利用侵袭素或基底膜提取物进行二维类器官培养以研究宿主-细菌相互作用

本文介绍了在培养的人气道上皮细胞上培养Pseudomonas...

铜绿假单胞菌 生物膜与活体人呼吸道细胞共培养模型

学习建立小鼠小肠类器官与1型先天淋巴细胞共培养体系，用于研究肠道上皮与免疫细胞的双向相互作用。该方法为探索肠道稳态调控及炎症性肠病机制提供可控体外模型。

小鼠小肠上皮类器官与固有淋巴细胞的共培养

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