Name: E3泛素连接酶在哺乳动物细胞裂解物中底物泛素化的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 了解如何在哺乳动物细胞裂解物中评价E3泛素连接酶介导的底物泛素化。本方案利用HEK293T细胞系进行免疫沉淀和免疫印迹分析，无需昂贵试剂即可研究蛋白质翻译后修饰，为癌症和神经系统疾病的诊断治疗提供新思路。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

F.R.T. 受 FAPESP 资助项目（编号 2020/15771-6）和 CNPq Universal（编号 405836/2018-0）支持。P.M.S.P. 和 V.S. 受 CAPES 资助。C.R.S.T.B.C. 受 FAPESP 奖学金（编号 2019/23466-1）支持。我们感谢 Sandra R. C. Maruyama（FAPESP 2016/20258-0）提供的材料支持。

注意：哺乳动物细胞中泛素化实验方案的概述如图所示。 图1.
<img alt="蛋白质纯化流程图；转染设置、细胞培养、SDS-PAGE、免疫印迹。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63561/63561fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1. 泛素化检测实验流程概览。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63561/63561fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
1. 细胞培养
<ol>
	<li>在100 mm经TC处理的培养皿中，使用生长培养基（高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），添加10%胎牛血清（FBS）以及青霉素（100单位）、链霉素（100 µg）和L-谷氨酰胺（0.292 mg/mL）），将HEK293T细胞系培养至80%–90%汇合度。将培养物置于37 °C、5% CO2的湿化细胞培养箱中孵育。</li>
	<li>传代细胞时，使用移液管吸取培养皿中的培养基。用1 mL无菌的1×磷酸盐缓冲液（PBS 1×）清洗细胞一次。</li>
	<li>加入1 mL胰蛋白酶/EDTA（乙二胺四乙酸）溶液使细胞脱离。将培养皿在37 °C孵育5分钟。使用移液管在2 mL生长培养基中重悬细胞。</li>
	<li>将细胞悬液转移至新的15 mL离心管中，在室温（RT）下以500 × g离心5分钟。小心倾倒去除上清液。通过上下吹打，用3 mL生长培养基轻柔重悬细胞沉淀，获得均匀的细胞悬液。</li>
	<li>取1 mL细胞悬液转移至含有9 mL生长培养基的100 mm经TC处理的培养皿中。 
	注：若细胞状态良好，每个汇合度为80%–90%的HEK293T培养皿在传代后2天可扩增为三个汇合度达80%的培养皿。</li>
</ol>
2. 细胞转染
注意：如果细胞融合度低于80%，不建议进行细胞转染。
<ol>
	<li>转染前，确认细胞无污染且处于适合瞬时转染的汇合度。</li>
	<li>针对每个转染样本，按以下步骤制备DNA-聚乙烯亚胺（PEI，1 µg/µL，pH 7.2）复合物：
	<ol>
		<li>将每种质粒各3 µg溶于100 µL未添加补充物的Opti-MEM I低血清培养基中，通过上下吹打轻轻混匀。 
		注意：本实验中，细胞转染每种质粒4 µg：空载体（pcDNA3）或FLAG-Fbxo7构建体，以及UXT-V2-HA，同时转染或不转染6xHis-myc-泛素。总DNA量为12 µg。</li>
		<li>将PEI在室温下解冻，按每1 µg DNA加入3 µL PEI的比例加入上述溶液中，通过上下吹打混匀。室温孵育15分钟，以形成DNA-PEI复合物。 
		注意：每种细胞系所需的PEI体积与DNA量的最佳比例可能不同。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将全部体积的DNA-PEI复合物加入含细胞培养物的培养皿中，轻轻前后摇动培养板以混匀。将细胞置于37 °C、5% CO2的加湿细胞培养箱中孵育。</li>
	<li>5小时后更换培养基，因为长时间暴露于PEI可能对HEK293T细胞产生毒性。继续将细胞在37 °C、5% CO2的加湿细胞培养箱中孵育36小时。</li>
</ol>
3. 细胞裂解与免疫沉淀
<ol>
	<li>孵育期结束后，在细胞裂解前6小时，用以下处理转染后的细胞： 10 µM 蛋白酶体抑制剂MG-132。再次将细胞置于培养箱中孵育 37 °C 在含5% CO₂的湿润化细胞培养箱中2.</li>
	<li>使用移液管吸去每块培养皿中的培养基，加入 1 mL 1× PBS 洗涤一次。通过加入 1 mL 胰蛋白酶并将在培养皿中孵育以解离细胞 37 °C 孵育5分钟。用1 mL培养基重悬细胞。</li>
	<li>将细胞悬液转移至一个新的洁净15 mL离心管中，以500 x g离心 g 室温下孵育5分钟。</li>
	<li>小心倾倒去除上清液。轻柔地将细胞沉淀重悬于 200 µL 冰冷的NP-40裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.2，225 mM KCl，1% NP-40），添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（10 mM NaF 和 1 mM Na3视频操作4），并将溶液转移至一支洁净的1.5 mL离心管中。</li>
	<li>将细胞裂解液在冰上孵育 30 分钟。孵育结束后，于 16,900 x g 20 分钟 4 °C.</li>
	<li>同时，用预冷的NP-40裂解缓冲液平衡琼脂糖-抗HA磁珠。使用 15 µL 每份样品使用琼脂糖-抗HA珠。用缓冲液洗涤珠子 200 µL NP-40裂解缓冲液，通过在微量离心管中以3,000 x g短时离心处理 g 1 分钟 4 °C用移液器小心吸取并弃去上清液，重复此操作三次。随后将磁珠置于冰上平衡，直至使用。</li>
	<li>离心细胞裂解液后，收集上清。使用Bradford法测定总裂解液中的蛋白含量。16.</li>
	<li>确保用于免疫沉淀的每个样品含有等量的蛋白质。将所需体积的细胞裂解液与平衡后的琼脂糖-抗HA珠子在旋转孵育仪中轻轻旋转孵育4小时，温度为 4 °C，从而使UXT-V2-HA能够结合到琼脂糖-抗HA珠上。</li>
	<li>用微型离心机在3,000 x g下短时离心收集琼脂糖-抗HA珠子 g 1 分钟，于 4 °C小心吸除并弃去上清液。用预冷的NP-40细胞裂解缓冲液洗涤磁珠3次，再用预冷的FLAG/HA缓冲液（10 mM Hepes pH 7.9，15 mM MgCl₂，225 mM KCl，0.1% NP-40）洗涤2次。</li>
	<li>最后一次洗涤后，用移液器小心吸除全部上清液，并使用HA肽洗脱多聚泛素化蛋白300 µg/mL) 在FLAG/HA缓冲液中稀释。将琼脂糖-抗HA珠与HA肽在4℃下孵育1小时 4 °C 在摇床平台上。</li>
	<li>3,000 x g 离心 beads g 2 分钟 4 °C 小心吸取含有聚泛素化蛋白的上清液。如有需要，将洗脱液储存于干净的新微量离心管中，置于 -20 °C.</li>
	<li>在10% SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）中分离洗脱液和细胞裂解物17 和免疫印迹。</li>
	<li>本研究中进行了湿转法蛋白质印迹（WB）。对于此类转膜，将凝胶置于由滤纸-凝胶-膜-滤纸组成的转膜夹心中，加入垫片缓冲，并用支撑网压紧。将该体系垂直放入盛有转移缓冲液的转移槽中，并置于不锈钢/铂丝电极之间。在湿转缓冲液（甘氨酸 192 mM，Tris 碱 25 mM，0.025% SDS，20% 甲醇）中，150 V 恒压转移 90 分钟。 
	注意：由于细胞提取物已在步骤 3.7 中完成定量，因此每个样本应加载等量蛋白质进行 SDS-PAGE 分析。此外，为充分分辨洗脱液，各样本应加载等体积。</li>
	<li>使用选定的抗体探针检测免疫印迹膜 11确保在含有野生型E3连接酶、底物和myc-ub的样品中，通过免疫沉淀（IP）过程富集多聚泛素化底物后，使用抗myc抗体在洗脱液中检测到涂布状信号。在细胞裂解液（input）中，应检测到底物蛋白、Fbxo7蛋白、泛素化蛋白以及内参蛋白（如GAPDH和β-actin）的信号，以保证每泳道上样蛋白量一致。 
	注：每种抗体的稀释比例均按照生产商说明书进行配制。</li>
</ol>

<ol><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li>
<li>Callis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitination+machinery+of+the+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">The ubiquitination machinery of the ubiquitin system.</a> The Arabidopsis Book. 12, 0174(2014).</li>
<li>Koegl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ubiquitination+factor%2C+E4%2C+is+involved+in+multiubiquitin+chain+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly.</a> Cell. 96 (5), 635-644 (1999).</li>
<li>French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+functions+of+branched+ubiquitin+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">Emerging functions of branched ubiquitin chains.</a> Cell Discovery. 7 (1), 6(2021).</li>
<li>Komander, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+discrimination+of+structurally+equivalent+Lys+63-linked+and+linear+polyubiquitin+chains%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains.</a> EMBO Reports. 10 (5), 466-473 (2009).</li>
<li>Clague, M. J., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin%3A+Same+molecule%2C+different+degradation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143 (5), 682-685 (2010).</li>
<li>Davies, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vps9p+CUE+domain+ubiquitin+binding+is+required+for+efficient+endocytic+protein+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vps9p CUE domain ubiquitin binding is required for efficient endocytic protein traffic.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19826-19833 (2003).</li>
<li>Raasi, S., Wolf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+receptors+and+ERAD%3A+A+network+of+pathways+to+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin receptors and ERAD: A network of pathways to the proteasome.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 18 (6), 780-791 (2007).</li>
<li>Pan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+Ubr1-mediated+N-degron+polyubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural insights into Ubr1-mediated N-degron polyubiquitination.</a> Nature. 600 (7888), 334-338 (2021).</li>
<li>Raducu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+%28Fbxl17%29+ubiquitylation+of+Sufu+regulates+Hedgehog+signaling+and+medulloblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">SCF (Fbxl17) ubiquitylation of Sufu regulates Hedgehog signaling and medulloblastoma development.</a> The EMBO Journal. 35 (13), 1400-1416 (2016).</li>
<li>Spagnol, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E3+ubiquitin+ligase+SCF%28Fbxo7%29+mediates+proteasomal+degradation+of+UXT+isoform+2+%28UXT-V2%29+to+inhibit+the+NF-%CE%BAB+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">The E3 ubiquitin ligase SCF(Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-κB signaling pathway.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1865 (1), 129754(2021).</li>
<li>Teixeira, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gsk3%CE%B2+and+Tomm20+are+substrates+of+the+SCFFbxo7%2FPARK15+ubiquitin+ligase+associated+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Gsk3β and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson's disease.</a> Biochemical Journal. 473 (20), 3563-3580 (2016).</li>
<li>Tan, M. K. M., Lim, H. J., Bennett, E. J., Shi, Y., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+SCF+adaptor+capture+proteomics+reveals+a+role+for+SCFFBXL17+in+NRF2+activation+via+BACH1+repressor+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Parallel SCF adaptor capture proteomics reveals a role for SCFFBXL17 in NRF2 activation via BACH1 repressor turnover.</a> Molecular Cell. 52 (1), 9-24 (2013).</li>
<li>van Wijk, S. J., Fulda, S., Dikic, I., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+ubiquitination+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Visualizing ubiquitination in mammalian cells.</a> EMBO Reports. 20 (2), 1-18 (2019).</li>
<li>Kisselev, A. F., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibitors%3A+From+research+tools+to+drug+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibitors: From research tools to drug candidates.</a> Chemistry and Biology. 8 (8), 739-758 (2001).</li>
<li>Bradford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 228, 726-734 (1970).</li>
<li>Schröer, A., Schneider, S., Ropers, H. -H., Nothwang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+UXT%2C+a+novel+gene+in+human+Xp11%2C+which+is+widely+and+abundantly+expressed+in+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of UXT, a novel gene in human Xp11, which is widely and abundantly expressed in tumor tissue.</a> Genomics. 56 (3), 340-343 (1999).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UXT-V1+facilitates+the+formation+of+MAVS+antiviral+signalosome+on+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">UXT-V1 facilitates the formation of MAVS antiviral signalosome on mitochondria.</a> The Journal of Immunology. 188 (1), 358-366 (2012).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UXT-V1+protects+cells+against+TNF-induced+apoptosis+through+modulating+complex+II+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">UXT-V1 protects cells against TNF-induced apoptosis through modulating complex II formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (8), 1389-1397 (2011).</li>
<li>Sun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UXT+is+a+novel+and+essential+co-factor+in+the+NF-%CE%BAB+transcriptional+enhanceosome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">UXT is a novel and essential co-factor in the NF-κB transcriptional enhanceosome.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (2), 231-244 (2007).</li>
<li>Huang, X., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugging+the+undruggables%3A+Exploring+the+ubiquitin+system+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Drugging the undruggables: Exploring the ubiquitin system for drug development.</a> Cell Research. 26 (4), 484-498 (2016).</li>
<li>Rajkumar, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+myeloma%3A+2020+update+on+diagnosis%2C+risk-stratification+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Multiple myeloma: 2020 update on diagnosis, risk-stratification and management.</a> American Journal of Hematology. 95 (5), 548-567 (2020).</li>
<li>Hideshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteasome+inhibitor+PS-341+inhibits+growth%2C+induces+apoptosis%2C+and+overcomes+drug+resistance+in+human+multiple+myeloma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The proteasome inhibitor PS-341 inhibits growth, induces apoptosis, and overcomes drug resistance in human multiple myeloma cells.</a> Cancer Research. 61 (7), 3071-3076 (2001).</li>
<li>Tietsche, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+proteasome+inhibitors+in+the+treatment+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%2C+Transfusion+and+Cell+Therapy%22%5BJournal%5D)">New proteasome inhibitors in the treatment of multiple myeloma.</a> Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 76-83 (2018).</li>
<li>Vassilev, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+activation+of+the+p53+pathway+by+small-molecule+antagonists+of+MDM2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2.</a> Science. 303 (5659), 844-848 (2004).</li>
<li>Kuiken, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+F-box+only+protein+7+as+a+negative+regulator+of+NF-kappaB+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification of F-box only protein 7 as a negative regulator of NF-kappaB signalling.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (9), 2140-2149 (2012).</li>
<li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycin+A1+targets+both+autophagy+and+apoptosis+pathways+in+pediatric+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).</li>
<li>Iconomou, M., Saunders, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+approaches+to+identify+E3+ligase+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Systematic approaches to identify E3 ligase Substrates.</a> Biochemical Journal. 473 (22), 4083-4101 (2016).</li>
<li>Zhang, Z. R., Bonifacino, J. S., Hegde, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deubiquitinases+sharpen+substrate+discrimination+during+membrane+protein+degradation+from+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deubiquitinases sharpen substrate discrimination during membrane protein degradation from the ER.</a> Cell. 154 (3), 609-622 (2013).</li>
<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+age+of+crosstalk%3A+Phosphorylation%2C+ubiquitination%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The age of crosstalk: Phosphorylation, ubiquitination, and beyond.</a> Molecular Cell. 28 (5), 730-738 (2007).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

泛素化是一种重要的翻译后修饰，可调控多种蛋白质的水平，在众多信号通路和生物学过程中发挥关键作用，从而维持健康的细胞内环境。泛素-蛋白酶体系统（UPS）是近年来药物研究的主要焦点之一，为稳定肿瘤抑制因子或诱导致癌产物降解提供了可能22。例如，多发性骨髓瘤（MM）中负责单克隆免疫球蛋白分泌的浆细胞肿瘤异常增殖，会导致内质网（ER）中错误折叠和/或未折叠蛋白的积累，从而激活病理生理通路23。一旦发生内质网应激，便会激活包括泛素-蛋白酶体系统在内的多种细胞过程。使用蛋白酶体抑制剂（如硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米）诱导蛋白质积累并导致细胞死亡，在多发性骨髓瘤治疗中已显示出良好效果，作为抗肿瘤药物可减缓高危患者的疾病进展24,25。此外，其他针对蛋白质稳定性的研究也取得进展，例如靶向E3泛素连接酶MDM2的抑制剂，能够有效阻止p53的泛素化，从而避免其通过蛋白酶体途径被降解26。因此，一个以...

翻译后修饰（PTMs）是蛋白质调控的重要机制，对细胞稳态至关重要。蛋白质泛素化是一种动态且复杂的修饰过程，可在真核生物中产生多种不同的信号，导致多种细胞效应。泛素化是一个可逆过程，其特征是将含有76个氨基酸的泛素蛋白共价连接到底物蛋白上，该过程通过由三种不同反应组成的酶级联反应实现1。第一步是泛素的活化，依赖ATP水解，在泛素C末端与E1酶活性位点半胱氨酸残基之间形成高能硫酯键连接的泛素。随后，泛素被转移至E2酶，形成泛素与E2酶之间的硫酯键复合物。接着，泛素由E2酶或更常见的E3酶共价连接到底物蛋白上，其中E3酶负责识别并与底物相互作用2,3。在某些情况下，还需要E4酶（泛素链延伸因子）来促进多泛素链的组装3。
泛素含有七个赖氨酸残基（K6、K11、K27、K29、K33、K48 和 K63），可形成具有不同连接方式的多聚泛素链，从而产生不同的三维结构，这些结构可被多种效应蛋白识别4,5。因此，底物上形成的多聚泛素链类型对其细胞命运的决定至关重要6,7,8。此外，底物还可通过其N端残基（称为N-降解决定子）发生泛素化。特定的E3泛素连接酶负责识别N-降解决定子，从而介导邻近赖氨酸残基的多聚泛素化9。
目前，已有超过40种不同的SCF特异性底物被鉴定。其中包含多个生物学通路的关键调控因子，这些通路涉及细胞分化与发育，以及细胞存活与死亡10,11,12,13。因此，鉴定每种E3泛素连接酶的特异性底物对于构建各种生物学事件的完整图谱至关重要。尽管鉴定真实底物在生物化学上具有挑战性，但基于生物化学的方法非常适合评估泛素链的特异性以及单泛素化与多泛素化的区别14。本研究描述了一项完整的泛素化检测实验方案，使用过表达底物UXT-V2（普遍表达的类prefoldin分子伴侣异构体2）和E3泛素连接酶复合物SCF(Fbxo7)的哺乳动物细胞系HEK293T。UXT-V2是NF-κB信号通路的重要辅助因子，当该蛋白在细胞中被敲低后，会抑制TNF-α诱导的NF-κB激活11。因此，为了检测多泛素化的UXT-V2，实验中使用蛋白酶体抑制剂MG132，因其能够阻断蛋白酶体复合物26S亚基的蛋白水解活性15。此外，细胞裂解物经过小规模免疫沉淀（IP）以纯化底物，利用固定在琼脂糖树脂上的特异性抗体，随后通过选定的抗体进行蛋白质印迹（WB）检测。该方案对于在细胞环境中验证底物的泛素化非常有用，也可根据需要调整用于其他类型的哺乳动物细胞及其他E3泛素连接酶复合物。然而，还需通过体外（in vitro）泛素化实验对所测试的底物进行验证，因为这两种方案在鉴定真实底物方面互为补充。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Axygen</td><td>PMI110-06A</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 经组织培养处理的培养皿</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Cralplast</td><td>655111</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖-抗 HA 珠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6779</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠抗体</td><td>Seracare</td><td>5220-0341</td><td>山羊抗小鼠 IgG</td></tr><tr><td>抗兔抗体</td><td>Seracare</td><td>5220-0337</td><td>山羊抗兔 IgG</td></tr><tr><td>抗肌动蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3853</td><td>使用稀释比例：1:2000</td></tr><tr><td>抗 Fbxo7 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB1407251</td><td>使用稀释比例：1:1000</td></tr><tr><td>抗 HA 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3663</td><td>使用稀释比例：1:1000</td></tr><tr><td>抗 Myc 抗体</td><td>Cell Signalling</td><td>2272</td><td>使用稀释比例：1:1000</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916-500ML</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-100G</td><td>牛血清白蛋白</td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>Nuaire</td><td>NU-4850</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>500 × &lt;em&gt;g&lt;/em&gt; 离心 5 分钟</td></tr><tr><td>ChemiDoc</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>数字 pH 计</td><td>Kasvi</td><td>K39-2014B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基</td><td>Corning</td><td>10-017-CRV</td><td>高糖</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>F4135</td><td>使用前过滤</td></tr><tr><td>HA 肽</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2149</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR Life Science</td><td>0365-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kline 旋转仪</td><td>Global Trade Technology</td><td>GT-2OIBD</td><td></td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Boston Biochem</td><td>I-130</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5418R</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（正钒酸钠）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素印迹膜</td><td>GE Healthcare</td><td>10600016</td><td></td></tr><tr><td>NP40（IGEPAL CA-630）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896-100ML</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>OPTIKA microscopes</td><td>SN510768</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3</td><td>Invitrogen</td><td>V79020</td><td>用于哺乳动物表达</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7</td><td>&amp;nbsp;由 Marcelo Dam&amp;aacute;rio 博士惠赠</td><td></td><td>标签：2xFlag（N 末端）。限制性内切酶：EcoRI 和 XhoI</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-&amp;Delta;F-box</td><td>&amp;nbsp;由 Marcelo Dam&amp;aacute;rio 博士惠赠</td><td></td><td>标签：2xFlag（N 末端）。限制性内切酶：EcoRI 和 XhoI。&amp;Delta;335-367</td></tr><tr><td>pcDNA3-UXTV2-HA</td><td>&amp;nbsp;由 Marcelo Dam&amp;aacute;rio 博士惠赠</td><td></td><td>标签：HA（C 末端）。限制性内切酶：EcoRI 和 XhoI</td></tr><tr><td>pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin</td><td>&amp;nbsp;由 Marcelo Dam&amp;aacute;rio 博士惠赠</td><td></td><td>标签：6x-His-Myc（N 末端）。限制性内切酶：EcoRI 和 KpnI</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-谷氨酰胺 100 倍浓缩液</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>10 倍磷酸盐缓冲液（10x PBS）</td><td>AccuGENE</td><td>51226</td><td>将 10x PBS 用超纯水稀释，可获得 1x PBS</td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺（PEI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-98-6</td><td></td></tr><tr><td>丽春红 S</td><td>VWR Life Science</td><td>0860-50G</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物 SIGMAFAST</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>摇床振荡器</td><td>Kasvi</td><td>19010005</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 系统</td><td>BioRad</td><td>165-8004</td><td></td></tr><tr><td>溶液匀浆器</td><td>Phoenix Luferco</td><td>AP-22</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 基础缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶（TrypLe Express）</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Western 印迹发光试剂（Luminol）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2048</td><td></td></tr></tbody></table>

哺乳动物细胞裂解物中e3泛素连接酶介导底物泛素化修饰的评估

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

泛素化是一种发生在真核细胞中的翻译后修饰，对多种生物学通路的调控至关重要，包括细胞存活、增殖和分化。该过程是可逆的，通过至少三种不同酶（E1（泛素激活酶）、E2（泛素结合酶）和E3（泛素连接酶））参与的级联反应，将泛素共价连接到底物蛋白上。其中E3复合物在底物识别和泛素化过程中发挥重要作用。本文描述了一种在哺乳动物细胞中评估底物泛素化水平的实验方案，通过瞬时共转染编码目标底物、E3泛素连接酶以及带标签泛素的质粒来实现。在细胞裂解前，用蛋白酶体抑制剂MG132（羧基苄氧基-亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸醛）处理转染后的细胞，以防止底物经蛋白酶体降解。随后，对细胞裂解物进行小规模免疫沉淀（IP），以富集多泛素化底物，并利用针对泛素标签的特异性抗体通过蛋白质印迹（WB）进行检测。因此，本文提供了一种稳定且简便的哺乳动物细胞泛素化检测方法，有助于科研人员研究特定底物蛋白和E3泛素连接酶的泛素化过程。

UXT（普遍表达转录本）是一种类似prefoldin的蛋白质，在小鼠和人类的心脏、脑、骨骼肌、胎盘、胰腺、肾脏及肝脏等组织中形成普遍表达的蛋白质折叠复合物18。已发现UXT存在两种剪接异构体，分别称为UXT-V1和UXT-V2，二者具有不同的功能和亚细胞定位。UXT-V1主要定位于细胞质及线粒体内部，参与TNF-α诱导的细胞凋亡以及抗病毒信号体的形成19,20。目前大多数研究集中于主要定位于细胞核的UXT-V2，其作为多种转录因子的共因子，参与调控细胞增殖、分化以及炎症通路。UXT-V2参与NF-κB信号通路，作为NF-κB增强子体（enhanceosome）中的关键共激活因子发挥作用21。已有研究证实，UXT-V2是E3泛素连接酶SCF(Fbxo7)的经典底物，可通过蛋白酶体介导其多聚泛素化和降解，从而抑制NF-κB信号通路的激活11。
<p class="jove_c...

我们提供了一种在哺乳动物细胞中针对特定底物和E3泛素连接酶的泛素化检测的详细实验方案。采用HEK293T细胞系进行蛋白过表达，通过免疫沉淀法从细胞裂解液中纯化多泛素化修饰的底物蛋白，并利用SDS-PAGE进行分离。通过免疫印迹技术检测该翻译后修饰。

哺乳动物细胞裂解物中E3泛素连接酶介导底物泛素化修饰的评估

泛素化是一种发生在真核细胞中的翻译后修饰，对多种生物通路的调控至关重要，……

本方案可用于评估特定底物被E3泛素连接酶泛素化的过程。我们已知，泛素连接酶与底物相互作用的表征对于理解其在细胞中的功能至关重要。该技术无需昂贵的试剂或复杂的设备。需要含有目的基因的质粒，利用细胞裂解液建立免疫沉淀实验，并通过蛋白质印迹法检测底物的泛素化。多种人类疾病，如癌症和神经系统疾病，均与E3连接酶的失调有关。因此，鉴定特定E3连接酶介导的底物泛素化可能有助于这些疾病的治疗或诊断。该实验操作将由Valentine Spagnol进行演示。首先，在添加了10%胎牛血清、100单位青霉素、100微克链霉素和0.292毫克/毫升L-谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基中，将HEK293T细胞系培养至80%至90%汇合度。然后，将该培养物置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润细胞培养孵箱中孵育。使用血清移液管吸去培养皿中的培养基，并用一毫升无菌的1×磷酸盐缓冲液清洗细胞一次。接着，加入一毫升胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液使细胞脱离，于37摄氏度孵育五分钟，然后使用血清移液管将细胞重悬于两毫升培养基中。将细胞悬液转移至一个新的洁净15毫升离心管中，在室温下以500 × g离心五分钟。然后，轻轻吸除上清液，并用移液器将细胞沉淀重悬于3 mL培养基中，上下吹打以获得均匀的细胞悬液。接着，取1 mL该细胞悬液转移至一个含有9 mL培养基的100 mm TC处理培养皿中。转染前，需确认细胞无污染且达到瞬时转染所需的适当汇合度。对于每个转染样品，通过将每种质粒各3微克溶于100微升未添加补充物的Opti-MEM 1减血清培养基中，并用移液器轻轻吹打混匀，制备DNA-聚乙烯亚胺复合物。接着，将DNA-聚乙烯亚胺在室温下解冻，并按照每1微克DNA加入3微升DNA-聚乙烯亚胺的比例将其加入溶液中。通过移液器上下吹打使溶液混匀。然后，在室温下孵育15分钟，以促进DNA-聚乙烯亚胺复合物的形成。将全部体积的DNA-聚乙烯亚胺复合物加入含有细胞培养物的每块培养皿中，并通过前后轻轻摇动培养板使其混匀。随后，将这些细胞置于37摄氏度、加湿的细胞培养孵育箱中孵育。孵育后，在细胞裂解前六小时，用10微摩尔蛋白酶体抑制剂MG132处理转染的细胞，并将细胞置于加湿的细胞培养箱中继续孵育。接着，使用血清移液管吸去每个培养皿中的培养基，并用一毫升1×PBS洗涤细胞一次。然后，加入一毫升胰蛋白酶使细胞脱落，并将培养皿在37摄氏度下孵育五分钟。将细胞重悬于1毫升培养基中，将细胞悬液转移至一个新的洁净2毫升微量离心管中，在室温下以500 × g离心5分钟。离心结束后，小心倾倒去除上清液，并将细胞沉淀轻轻重悬于200微升预冷的含蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的MP40裂解缓冲液中。然后将此溶液转移至一个洁净的1.5毫升微量离心管中。将该细胞裂解液置于冰上孵育30分钟，孵育结束后，在4°C条件下以16,900 × g离心20分钟。同时，用预冷的MP40裂解缓冲液平衡agarose anti-HA beads。每个样品使用15 µL agarose anti-HA beads。用200微升MP40裂解缓冲液洗涤磁珠，在4°C下将微离心管以3,000 × g离心1分钟。接着，用移液器小心吸出并弃去上清液，重复此过程三次。之后，将磁珠置于冰上平衡，直至使用。离心细胞裂解液后，收集上清液，并使用Bradford法测定总裂解液中的蛋白质含量，以确保用于免疫沉淀的每个样品含有等量的蛋白质。将所需体积的细胞裂解液与平衡后的琼脂糖抗HA磁珠在4°C下轻轻旋转孵育4小时，使UXT-V2-HA与琼脂糖抗HA磁珠结合。在4°C下，将微量离心管以3,000 × g离心1分钟，收集琼脂糖抗HA磁珠。小心吸除并弃去上清液。用预冷的 MP40 细胞裂解缓冲液洗涤磁珠三次，再用预冷的 FLAG HA 缓冲液洗涤两次。最后一次洗涤后，用移液器小心吸除全部上清液，并加入含有 300 微克/毫升 HA 肽（溶于 FLAG HA 缓冲液）的溶液，洗脱多聚泛素化蛋白。将琼脂糖抗HA磁珠与HA肽在4摄氏度的摇床中孵育一小时。随后，在4摄氏度下以3,000 × g离心两分钟沉淀磁珠，并小心移除含有多聚泛素化蛋白的上清液。如有需要，将洗脱液转移至新的洁净微量离心管中，并于-20摄氏度保存。采用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离洗脱液和细胞裂解液，随后进行免疫印迹。进行湿转法Western印迹时，将凝胶置于由滤纸、凝胶、膜和滤纸组成的转移夹心中，用垫片缓冲，并用支撑网压紧。然后将该系统垂直放入装有转移缓冲液的槽中，置于不锈钢或铂丝电极之间。在湿转缓冲液中，于150伏电压下转移90分钟。最后，使用抗myc抗体检测免疫印迹膜。在用抗myc抗体探测抗HA免疫沉淀洗脱液后，观察到细胞中F-box蛋白7介导的UXT-V2-HA特异性多聚泛素化，该抗体可检测到底物上连接的myc-泛素偶联物。在第一道和第二道中，通过观察到当细胞共转染F-box蛋白7和myc-ub但未共转染UXT-V2-HA质粒时，未检测到多聚泛素化蛋白的弥散条带，表明抗myc抗体对多聚泛素化底物具有特异性。此外，在F-box蛋白7与UXT-V2-HA组合但缺乏myc-ub质粒的情况下，也未观察到对应于蛋白多聚泛素化的弥散条带。当将空载体、野生型F-box蛋白7或无法组装活性SCF的F-box蛋白7突变体分别与UXT-V2-HA和myc-ub共转染时，仅在野生型F-box蛋白7条件下观察到强烈的多聚泛素化UXT-V2弥散信号，提示UXT-V2是由SCF F-box蛋白7复合物介导发生多聚泛素化，且该现象在细胞中相较于对照组更为显著。单次沉淀步骤，包括将细胞裂解液与平衡后的磁珠孵育，以及免疫沉淀蛋白的洗脱，对于实现本实验方案的目标至关重要。在此步骤之后，应进行体外泛素化实验，以确认E3泛素连接酶对底物蛋白泛素化的特异性。

evaluation-substrate-ubiquitylation-e3-ubiquitin-ligase-mammalian

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

E3泛素连接酶在哺乳动物细胞裂解物中底物泛素化的评价

泛素化是一种由三种酶共同完成的关键翻译后修饰过程。参与该修饰过程的基因突变与多种人类疾病相关。本文中，我们描述了在培养细胞中进行体内（in vivo）以及在试管中进行体外（in...

蛋白质泛素化检测

SUMO化检测实验：一种通过免疫印迹法体外检测底物蛋白SUMO化状态的技术

与泛素连接酶不同，目前已鉴定的E3 SUMO连接酶数量较少。这种修饰 体外 SUMO化实验方案能够通过以下方法鉴定新的SUMO E3连接酶 体外...

体外 SUMO化检测法用于研究SUMO E3连接酶活性

我们介绍一种从复杂的生物样品中纯化、检测和鉴定来源于泛素化蛋白质的diGly肽的方法。该方法具有良好的重复性和稳健性，在泛素化修饰组分析的深度方面优于已发表的方法。...

通过肽段富集与质谱法检测蛋白质泛素化位点

泛素化是一种翻译后修饰，在细胞过程中发挥重要作用，并受到去泛素化的严密调控。这两种反应的异常与人类疾病密切相关。我们提供了使用纯化组分在体外进行泛素化和去泛素化反应的实验方案。...

体外核小体组蛋白泛素化与去泛素化实验

本方案旨在建立泛素（Ub）和泛素样蛋白（Ubls）的特异性蛋白质组，以鉴定与特定条件（如处理方式或表型）相关的这类翻译后修饰（PTMs）的变化。...

泛素及泛素样蛋白依赖性翻译后修饰的分析及显著变化的鉴定

本文旨在为RING型E3泛素连接酶的全面生化与功能研究提供一个框架。这一多步骤流程包含详细的实验方案，可用于验证待测蛋白的酶活性，并阐明如何将酶活性与生物学功能相联系。...

体外及植物体内RING型E3泛素连接酶的功能表征

该方法描述了泛素链拓扑结构全局变化的评估。该评估通过基于质谱的靶向蛋白质组学方法来实现。...

泛素链的平行反应监测分析

本研究提供了详细的 体外 泛素化检测方案用于分析E3泛素连接酶催化活性。重组蛋白使用原核表达系统（如）进行表达 大肠杆菌...

体外分析E3泛素连接酶功能

泛素化是细胞内蛋白质功能的关键调控机制。本文介绍了两种用于检测哺乳动物细胞中底物蛋白泛素化水平的细胞裂解方法，并比较了它们在分析泛素化水平方面的有效性。通过瞬时转染在HEK293T细胞中诱导蛋白过表达，并通过蛋白质印迹分析检测泛素化蛋白。...

以SMAD2/SMURF2为模型在哺乳动物细胞裂解液中检测泛素化的比较策略

本方案描述了一种利用哺乳动物细胞裂解液或纯化的泛素酶复合物对Streptococcus...

体外 重建细菌泛素化及VCP/p97介导的清除过程

了解如何在哺乳动物细胞裂解物中评价E3泛素连接酶介导的底物泛素化。本方案利用HEK293T细胞系进行免疫沉淀和免疫印迹分析，无需昂贵试剂即可研究蛋白质翻译后修饰，为癌症和神经系统疾病的诊断治疗提供新思路。

哺乳动物细胞裂解物中E3泛素连接酶介导底物泛素化修饰的评估

探索更多视频