Name: 共聚焦显微镜测量肾上腺嗜铬细胞融合孔隙动力学的三种模式 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: 学习共聚焦显微镜结合膜片钳技术，用于检测牛肾上腺嗜铬细胞的三种融合模式：紧密融合、停留融合和收缩融合。该方法可实时观察融合孔动态，揭示神经递质释放机制。

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感谢美国国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）院内研究项目（ZIA NS003009-13 和 ZIA NS003105-08）对本工作的支持。

注意：动物使用程序遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南，并已获得 NIH 动物护理和使用委员会的批准。
1. 牛嗜铬细胞培养
<ol>
	<li>制备洛克氏溶液（Locke's solution）表1）并在嗜铬细胞培养前1天对工具进行高压灭菌。</li>
	<li>在培养当天从当地屠宰场获取牛肾上腺，并在解剖前将其浸没于冰冻的Locke's溶液中。 
	注意：肾上腺来自21至27月龄、健康、黑白花安格斯牛（黑白花安格斯公牛为主），无论性别，体重约为1,400磅（约635 kg）。</li>
	<li>准备30 mL（用于3个肾上腺）含有胶原酶P、胰蛋白酶抑制剂和牛血清白蛋白（BSA）的新鲜酶溶液表1在解剖前将其置于室温下保存。</li>
	<li>选取3个表面无切割或出血的完整腺体，用剪刀去除脂肪组织（图1A).&#160;用Locke's溶液灌注腺体直至无血液流出。为此，通过肾上腺静脉充盈腺体图1B使用带有0.22 µm滤器的30 mL注射器，根据需要反复操作25. 
	注意：通常清洗 3 个腺体需要约 150 mL 的 Locke 氏溶液。</li>
	<li>消化时，使用连接有0.22 µm滤器的30 mL注射器，通过肾上腺静脉注入酶溶液，直至腺体开始肿胀。随后将腺体置于37 °C环境中10分钟。再次注入酶溶液，并将腺体继续在37 °C下孵育10分钟。 
	注意：消化3个腺体大约需要30 mL酶溶液。</li>
	<li>消化后，用剪刀从静脉端向另一端纵向剪开腺体，以展开腺体（图1C用镊子将白色髓质分离出来，置于含有Locke氏溶液的10 cm培养皿中。&#160; 
	注意：腺体在消化前后的内部结构对比见于 图1C消化和骨髓分离的详细步骤此前已有报道23,25.</li>
	<li>用剪刀将延髓剪切并剁成小块（图1D用80–100 µm尼龙滤网将延髓悬液过滤至烧杯中，随后将滤液转移至50 mL锥形管中，在48 × g室温下，3 分钟，减速速率为 3。 
	注意：通常情况下，脊髓组织的切碎过程需要约10分钟。为了获得较高的细胞得率，切碎的组织块必须非常细小，直至无法用镊子夹起为止。</li>
	<li>离心后，弃去上清液，用移液管将细胞沉淀重悬于 Locke 溶液中。用 80–100 µm 滤网过滤细胞悬液，并在 48 x g，室温，3 分钟，减速系数为 3。</li>
	<li>吸除上清液，并用 30 ml 培养基重悬细胞沉淀表1使用血细胞计数板确定细胞数量25.</li>
</ol>
2. 采用电穿孔法进行转染
<ol>
	<li>将 2.8 × 106 个细胞转移至一个 15 mL 离心管中。在 48 × g 条件下离心 2 分钟（减速设为 3）使细胞沉淀。向细胞沉淀中加入 100 µL 制造商提供的转染缓冲液（见材料表），然后加入 2 µg PH-mNG 质粒。 
	注意：PH-mNG 质粒是通过将 PH-EGFP15 中的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）替换为 mNG 构建而成（见材料表）。</li>
	<li>用移液器轻轻吹打混匀悬浮液，并立即转移至电穿孔比色皿中（图 1E）。立即将比色皿放入电穿孔仪（见材料表），在屏幕列表中选择 O-005 程序，然后按Enter键开始电穿孔。 
	注意：转染用细胞悬浮液应在细胞培养罩内制备。混合过程中避免引入气泡。完成后应立即进行下一步操作。</li>
	<li>电穿孔后，立即向比色皿中加入 1.8 mL 培养基，并用配有无菌吸头的微量移液器轻轻混匀。然后将电穿孔后的细胞悬浮液取 300 µL 加至每个培养皿中的盖玻片表面（见材料表），每次电穿孔反应共接种 5–6 个培养皿。</li>
	<li>小心将培养皿转移至 37 °C、含 9% CO2 的湿润培养箱中孵育 30 分钟，30 分钟后向每个培养皿中轻柔加入 2 mL 预热的培养基。</li>
	<li>将转染后的细胞置于 37 °C、含 9% CO2 的湿润培养箱中继续培养 2–3 天后再进行实验。 
	&#8203;注意：培养的细胞可维持一周。最佳使用时间为培养后的第 2–3 天。</li>
</ol>
3. 膜片钳记录与共聚焦成像的准备工作
注意：本实验方案使用激光扫描共聚焦显微镜与膜片钳放大器结合电压钳记录，并联合锁相放大器进行电容记录。采用在固定Z平面的XY平面共聚焦成像（XY/Zfixed扫描），同时获取三种荧光信号。Z平面聚焦于细胞底部，即质膜贴附于盖玻片的位置。
<ol>
	<li>在进行膜片钳和成像实验的当天，使用荧光显微镜观察细胞。使用明场观察以确保细胞培养物未被污染（图1F），并使用落射荧光观察荧光标记蛋白是否正确表达。 
	注意：例如，PH-mNG 在约20–30%的细胞质膜上表达。</li>
	<li>使用硼硅酸盐玻璃毛细管制备膜片钳电极。具体操作为：使用电极拉制仪拉制电极，用电极尖端涂抹液态石蜡，并使用微电极抛光仪进行抛光（参见材料表）。</li>
	<li>开启膜片钳记录放大器，并启动膜片钳记录软件（参见材料表）。在软件中设置合适的钙电流和电容记录参数（参见材料表）。
	<ol>
		<li>设置总时长为60秒的记录程序，刺激从第10秒开始。</li>
		<li>将电压钳记录的保持电位设为-80 mV。设置一个从-80 mV去极化至10 mV、持续1秒的刺激，以诱导钙离子内流和电容跃变。</li>
		<li>对于电容测量，将正弦刺激的频率设置在1,000–1,500 Hz范围内，峰峰值电压不超过50 mV。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保存记录程序，并创建新的记录文件。</li>
	<li>开启共聚焦显微镜系统，并在软件中设置相应参数（参见材料表）。
	<ol>
		<li>开启激光器，包括458 nm、514 nm和633 nm激光器，并根据各荧光探针设置相应的发射光收集范围，如下所示：FFN511：激发波长（EX），458 nm；发射波长（EM），468–500 nm；mNG：EX，514 nm；EM，524–560 nm；A655：EX，633 nm；EM，650–700 nm。</li>
		<li>对FFN511和mNG采用顺序成像，以避免两种探针之间的串扰。设置时程为1分钟的延时成像以进行图像记录（图1G）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 膜片钳记录与共聚焦成像
<ol>
	<li>选择细胞状态良好且表达适当的培养皿，向培养基中加入 2 µL 荧光假神经递质 FFN511（10 mM 原液，1:1,000 工作浓度）。将培养皿放回培养箱孵育 20 分钟。或者，可在步骤 3.2 之后加载 FFN511，并在等待期间执行步骤 3.3–3.5&#160;以节省时间。</li>
	<li>完成 FFN511 加载后，准备记录室，并将 2 µL 荧光染料 A655 加入 500 µL 灌流液中（图 2A 和 表 1）。用镊子将盖玻片从培养皿转移至记录室（参见 材料表），并立即加入含 A655 的灌流液（图 2B）。 
	注意：A655 保存于 -20 °C，浓度为 10 mM，工作浓度为 40 µM。 
	警告：佩戴手套，避免皮肤直接接触 FFN511 或 A655。</li>
	<li>在 100 倍油镜（数值孔径 = 1.4）上滴加一滴浸油（折射率：1.518；参见 材料表）。将记录室安装至显微镜，调节调焦旋钮使油刚好接触盖玻片底部，然后将接地线尖端浸入灌流液中&#160;（图 2C，D）。 
	注意：选择适用于室温工作的浸油。无需在低倍与高倍物镜之间切换。记录过程中室温维持在约 20–22 °C。</li>
	<li>将细胞调至清晰焦点，使用明场与共聚焦成像寻找具有 mNG 表达的良好细胞。放大选定细胞并将其调整至视野中心，以最小化空白区域。 
	注意：荧光标记的示意图见 图 3A。良好细胞通常具有平滑的膜和清晰的边缘（图 3B）。通过落射荧光或共聚焦成像，良好细胞表现为底部大而平坦且 mNG 表达明亮（图 3C）。 
	像素大小约为 50 nm，根据细胞大小和缩放倍数不同，范围约为 40–80 nm。</li>
	<li>设置 FFN511、PH-mNG 和 A655 在固定 Z 平面（XY/Zfixed 扫描）的 XY 平面共聚焦成像参数，时间间隔尽可能小。使用微调旋钮将焦点调整至细胞底部。 
	注意：PH-mNG 标记细胞质膜在共聚焦 XY 平面横截面上的轮廓（细胞底部除外）。在细胞膜底部附近可观察到 A655 斑点，反映 Ω 形或 Λ 形膜内陷结构。若 Z 焦平面低于细胞底部，所有荧光强度将减弱。</li>
	<li>在软件中调节激发激光功率，以获得最佳信噪比并避免显著的荧光漂白。具体操作：初始测试时，FFN511 在 458 nm 激发的激光功率设为 2.5 mW，mNG 在 514 nm 激发的激光功率设为 1 mW。对于使用 HeNe 激光在 633 nm 激发的 A655，使用较高激光功率（约 12–15 mW，即最大功率的 70%–80%），在连续激发下可使封闭孔道的 Ω 形结构内所有 A655 荧光完全漂白。 
	注意：若激光功率过高，PH-mNG 和 FFN511 荧光会迅速漂白；若激光功率过低，信号将过于微弱或噪声过大，难以分析。</li>
	<li>向膜片钳玻璃微电极中加入 9 µL 内液（表 1），并将电极连接至膜片钳放大器阶段的电极夹持器上（参见 材料表）。</li>
	<li>使用注射器施加少量正压，通过显微操作器移动电极尖端接触灌流液。确保放大器通过电压脉冲测试显示电极电阻约为 2–4 MΩ。按下 LJ/Auto 以消除液接电位。</li>
	<li>通过显微操作器将电极移向选定细胞。为形成细胞贴附模式，将电极尖端接触细胞（电阻上升）；用注射器轻轻施加负压（电阻升至 1 GΩ 以上），将钳制电位从 0 mV 改为 -80 mV。</li>
	<li>当电阻超过 1 GΩ 后，等待约 30 秒使构型稳定。按下 C-fast/Auto 以补偿快速电容。</li>
	<li>为形成全细胞模式，用注射器施加短暂但强力的脉冲负压以破裂细胞膜（电流脉冲形状随充放电的膜电容而改变）。按下 C-slow/Auto 以补偿慢速电容。</li>
	<li>轻微调节成像焦点，使其聚焦于细胞底部。同时点击两个不同软件中的 开始 按钮，启动共聚焦时间序列成像与膜片钳记录。 
	注意：共聚焦成像软件以约 20–90 ms/帧的速率生成图像序列。膜片钳记录包括 10 秒静息状态、1 秒去极化刺激以及刺激后额外 49 秒。膜片钳构型可记录由 1 秒去极化（从 -80 mV 至 +10 mV）诱导的钙电流、电容跳跃及衰减（图 3D）。</li>
	<li>记录完成后，确保数据已保存。将钳制电位恢复至 0 mV。将电极移出灌流液并弃置。</li>
	<li>重复步骤 4.7–4.13，以记录培养皿中另一个细胞。每记录 1 小时后，更换另一个培养皿继续记录。 
	&#8203;注意：记录 1 小时后，膜片钳记录的成功率显著下降。为提高数据采集效率，建议每个培养皿仅记录 1 小时。</li>
</ol>
5. 膜片钳数据的分析
<ol>
	<li>打开合适的数据分析软件（参见材料表），点击PPT | Load PULSE file | File按钮以加载.dat文件。点击Do it，系统将自动在同一张图中绘制出四条曲线，包括钙电流和膜电容曲线。</li>
	<li>点击Windows | New Graph按钮，在Y Wave(s)中选择Pulse_1_1_1（即第一波），然后点击Do it以绘制钙电流图。接着点击Windows | New Table按钮，选择Pulse_1_1_1，点击Do it以显示钙电流的原始数据，这些数据可用于绘制多个细胞的平均曲线。</li>
	<li>在钙电流图中相应位置绘制一个方框，右键单击并展开电流信号，使其包含钙电流的基线和峰值。点击Graph | Show Info以显示游标A和B，并将它们分别移动至基线和峰值位置。图中信息将显示在底部，可据此估算相关参数。</li>
	<li>重复步骤5.2，但在Y Wave(s)中选择Pulse_1_1_1_Cm（即第二波），以绘制膜电容曲线。重复步骤5.3，将游标A和B放置在适当位置，以测量膜电容参数，如基线值、幅度和衰减速率。</li>
	<li>将步骤5.2中的原始数据复制到电子表格中，计算一组记录细胞的均值及标准误，并使用合适的软件绘制钙电流和膜电容的平均曲线（图3E）。</li>
</ol>
6. 共聚焦成像数据分析
<ol>
	<li>使用制造商提供的任意软件打开原始成像文件（参见材料表）。 
	注意：也可使用其他一些免费程序（如 ImageJ 或 Fiji）对第 4 节中获得的图像进行数据处理和定量分析。</li>
	<li>点击处理 | 处理工具，使用工具为每个延时图像生成滚动平均文件（例如，每 4 幅图像进行一次滚动平均），并保存这些文件。 
	注意：进行滚动平均后，可适当调整亮度和背景，以更清晰地显示三个通道的荧光变化，这有助于识别融合事件。检查某些无融合事件区域的荧光强度，有助于将融合事件的荧光信号与背景信号区分开来。</li>
	<li>点击按钮定量 | 工具 | 图像栈轮廓，检查刺激前后的时间点，以识别每个通道的荧光变化。点击绘制椭圆按钮，圈定融合事件的兴趣区域（ROIs）。在图像上右键单击，然后点击保存 ROIs以保存这些区域。 
	注意：ROI 的大小与嗜铬细胞中囊泡的尺寸相似，足以覆盖全部三个荧光信号24。分析使用原始数据，而提供滚动平均数据是为了更清晰地展示三个信号，提高信噪比。</li>
	<li>点击打开项目定位原始文件，在图像上右键单击，然后点击加载 ROIs，将 ROI 文件加载到原始成像文件中，以测量荧光强度。 
	注意：使用原始荧光信号绘制各通道的轨迹图。对于每个 ROI，基线定义为刺激前的强度，强度轨迹可相对于基线进行归一化处理。</li>
	<li>在软件中点击工具 | 排序 ROIs，绘制每个 ROI 三个通道的轨迹图。点击报告，将 ROI 数据（包括每个 ROI 的数字数据和图像轨迹）保存到一个文件夹中。
	<ol>
		<li>通过 PH-mNG（FPH）和 A655（F655）斑点荧光强度的同时增加（在单帧内），伴随 FFN511 斑点荧光（FFFN）的下降，来识别融合事件。</li>
		<li>观察 FPH 和 F655 的出现，这表明由于融合产生的 Ω-形态结构导致 PH-mNG/A655 斑点形成，使得 PH-mNG 从质膜扩散，同时 A655 持续从浴液中扩散进入。</li>
		<li>观察 FFFN 的下降，这表明其因融合孔开放而从囊泡中释放，从而排除 FPH 和 F655 的出现可能源于内吞引起的膜内陷的可能性。</li>
		<li>检查显示细胞底部发生融合事件的延时 XY/Zfixed 图像。分析三种融合模式：1）闭合融合（close-fusion）、2）持续融合（stay-fusion）和 3）收缩融合（shrink-fusion）。 
		注意：去极化前极少观察到融合事件，而去极化后可观察到数十个融合事件。融合后，Ω-形态结构可能关闭其孔道、保持孔道开放，或收缩并融入质膜。
		<ol>
			<li>识别闭合融合时，观察 F655 的减弱，因为融合孔关闭阻止了浴液中 A655 的交换，而 FPH 持续存在，反映 PtdIns(4,5)P2 持续转化为 PtdIns(4)P；或 FPH 延迟衰减，反映囊泡掐断（闭合融合，图 4A、B）。</li>
			<li>观察 FPH 和 F655 的持续存在，以识别持续融合（图 4C）。</li>
			<li>观察 FPH 和 F655 的平行下降，表明 Ω-形态结构收缩，从而识别收缩融合（图 4D）。 
			注意：若对事件类型不确定，应检查原始成像文件以核实图像轨迹。检查某些无融合事件区域的荧光强度，有助于将融合事件的荧光信号与背景信号区分开来。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>绘制这三个通道（FFN511、PH-mNG 和 A655）强度变化的代表性轨迹图。量化每种融合模式在每个细胞中的百分比，并绘制图表。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文描述了一种共聚焦显微成像方法，用于检测牛肾上腺嗜铬细胞中融合孔的动力学变化、递质释放过程，以及三种融合模式：闭合融合、持续融合和收缩融合4,24。同时介绍了一种电生理学方法，用于去极化细胞以诱发胞吐和胞吞作用。系统的共聚焦图像处理可提供有关融合与裂变事件中不同孔道行为模式的信息。
采用全细胞记录模式在同一细胞上同时监测钙电流和电容变化，可提供关于胞吐和胞吞过程的额外信息，反映出在任意给定时间点全细胞水平上孔道开放与关闭的比例。原则上，这些方法可应用于原代培养或细胞系中的其他可兴奋细胞以及非电兴奋细胞，只要其含有直径约为200-1,600 nm的囊泡15。除嗜铬细胞外，本文所述方法也已应用于大鼠胰腺β细胞系INS-1细胞4。
原则上，该方法也可应用于含有小于200 nm囊泡的分泌细胞。然而，随着囊泡尺寸减小，信噪比...

膜融合介导多种生物学功能，包括突触传递、血糖稳态、免疫应答以及病毒入侵1,2,3。胞吐作用涉及囊泡与质膜的融合，释放神经递质和激素，从而实现许多重要功能，例如神经网络活动。融合过程会打开一个孔道以释放囊泡内容物，随后该孔道可能关闭，使融合的囊泡得以回收，这一过程称为“亲吻即走”（kiss-and-run）1,4。不可逆和可逆的融合孔开放均可通过细胞贴附式电容记录结合单个囊泡融合的融合孔电导记录进行测量。
这一现象通常被解释为完全塌陷融合（即融合孔扩张直至融合囊泡完全扁平化）和“亲吻即走”式融合（即融合孔短暂开放后重新关闭）两种机制5,6,7,8,9,10,11,12,13。近期在嗜铬细胞中开展的共聚焦显微镜和受激辐射损耗（STED）成像研究直接观察到了融合孔的开放与关闭（即“亲吻即走”式融合，也称为闭合融合）、融合孔开放后长时间维持Ω形且孔持续开放的状态（称为停留融合），以及融合囊泡逐渐缩小直至完全并入质膜的过程——后者取代了传统的完全塌陷融合，成为囊泡与质膜融合的新模型4,8,14,15,16,17。
在神经元中，通过成像技术可检测到融合孔的开放与关闭，该成像显示了预先加载在囊泡中的量子点释放过程，这些量子点的尺寸大于融合孔，同时可通过在神经末梢释放面进行融合孔电导测量来检测5,18,19。肾上腺嗜铬细胞被广泛用作研究胞吐和胞吞作用的模型20,21。尽管嗜铬细胞含有致密大颗粒囊泡，而突触含有小的突触囊泡，但嗜铬细胞与突触中的胞吐和胞吞相关蛋白具有高度相似性10,11,12,20,21,22,23。
本文描述了一种结合共聚焦成像与电生理技术，在牛肾上腺嗜铬细胞中测量这三种融合模式的方法（图1）。该方法包括将荧光假性神经递质（FFN511）装载入囊泡以检测胞吐作用；在灌流液中加入Atto 655（A655）以填充融合过程中形成的Ω形结构；以及利用磷脂酶C δ的PH结构域（PH）标记质膜，该结构域可结合质膜上的PtdIns(4,5)P28,15,24。通过检测不同荧光信号强度的变化，可观察融合孔的动力学过程。尽管本方法以嗜铬细胞为例进行描述，但其原理可广泛应用于多种分泌细胞，远不止嗜铬细胞。

<table><tbody><tr><td>腺苷-5'-三磷酸镁盐</td><td>Sigma</td><td>A9187-500MG</td><td>用于配制内液的ATP</td></tr><tr><td>Atto 655</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 655-21</td><td>用于标记灌流液的Atto染料</td></tr><tr><td>原代神经元基本核转染试剂盒</td><td>Lonza</td><td>VSPI-1003</td><td>电穿孔转染缓冲液及配套试剂盒</td></tr><tr><td>硼硅酸盐毛细玻璃移液管</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0795</td><td>标准壁带丝，外径=2.0 mm，内径=1.16 mm，长度=7.5 cm</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A2153-50G</td><td>腺体消化用试剂</td></tr><tr><td>氯化钙 2 M</td><td>Quality Biological</td><td>351-130-721</td><td>用于配制灌流液的试剂</td></tr><tr><td>细胞筛，100 &amp;micro;m</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td>用于过滤嗜铬细胞悬液的材料</td></tr><tr><td>氢氧化铯溶液</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td>用于配制内液及Cs-谷氨酸/Cs-EGTA储备缓冲液的试剂</td></tr><tr><td>胶原酶P</td><td>Sigma</td><td>11213873001</td><td>用于腺体消化的酶</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Neuvitro</td><td>GG-14-Laminin</td><td>GG-14-Laminin，直径14 mm，#1厚度，60片装，经层粘连蛋白包被的德国盖玻片</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td>用于配制Locke&amp;rsquo;s溶液和灌流液的试剂</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885092</td><td>用于配制培养基的试剂</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>324626-25GM</td><td>用于配制灌流液用Cs-EGTA储备缓冲液的试剂</td></tr><tr><td>电穿孔仪与核转染仪</td><td>Amaxa Biosystems</td><td>Nucleofector II</td><td>将质粒转染入细胞</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10082147</td><td>用于配制培养基的试剂</td></tr><tr><td>FFN511</td><td>Abcam</td><td>ab120331</td><td>荧光假性神经递质，用于标记囊泡</td></tr><tr><td>鸟苷-5'-三磷酸钠盐水合物</td><td>Sigma</td><td>G8877-250MG</td><td>用于配制内液的GTP</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td>用于配制Locke&amp;rsquo;s溶液的试剂</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Igor pro</td><td>用于膜片钳数据分析和成像数据展示的软件</td></tr><tr><td>Leica Application Suite X软件</td><td>Leica</td><td>LAS X软件</td><td>共聚焦成像数据采集与分析软件</td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Leica</td><td>Leica TCS SP5</td><td>用于成像数据采集的共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>L-谷氨酸</td><td>Sigma</td><td>49449-100G</td><td>用于配制灌流液用Cs-谷氨酸储备缓冲液的试剂</td></tr><tr><td>锁相放大器</td><td>Heka</td><td>Lock-in</td><td>用于电容记录的软件</td></tr><tr><td>氯化镁 1 M</td><td>Quality Biological</td><td>351-033-721EA</td><td>用于配制内液和灌流液的试剂</td></tr><tr><td>金属化血球计数板 Hausser Bright-Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>3120</td><td>计数室</td></tr><tr><td>微电极抛光仪</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>抛光移液管以增强吉欧姆密封的形成与稳定性</td></tr><tr><td>Millex-GP 注射器滤器，0.22 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>SLGPR33RB</td><td>用于腺体清洗与消化的材料</td></tr><tr><td>mNG(mNeonGreen)</td><td>Allele Biotechnology</td><td>ABP-FP-MNEONSB</td><td>PH-mNeonGreen构建的模板</td></tr><tr><td>尼龙网过滤筛，100 微米</td><td>EIKO filtering co</td><td>03-100/32</td><td>用于过滤髓质悬液的材料</td></tr><tr><td>膜片钳EPC-10</td><td>Heka</td><td>EPC-10</td><td>用于膜片钳数据采集的放大器</td></tr><tr><td>PH-EGFP</td><td>Addgene</td><td>质粒 #51407</td><td>PH-mNeonGreen构建的骨架质粒</td></tr><tr><td>移液管拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>制备用于膜片钳记录的移液管</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P5404-500G</td><td>用于配制Locke&amp;rsquo;s溶液、灌流液和内液的试剂</td></tr><tr><td>Pulse软件</td><td>Heka</td><td>Pulse</td><td>用于膜片钳数据采集的软件</td></tr><tr><td>记录室</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1943/QR-40LP</td><td>盖玻片用记录室，用于在活细胞上施加膜片钳移液管</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S7653-1KG</td><td>用于配制Locke&amp;rsquo;s溶液、灌流液和内液的试剂</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma</td><td>S5881-500G</td><td>用于配制Locke&amp;rsquo;s溶液的试剂</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma</td><td>S0876-500G</td><td>用于配制Locke&amp;rsquo;s溶液的试剂</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma</td><td>S8282-500G</td><td>用于配制Locke&amp;rsquo;s溶液的试剂</td></tr><tr><td>搅拌加热板</td><td>Barnsted/Thermolyne</td><td>type 10100</td><td>用于蜡涂层移液管加热的装置</td></tr><tr><td>注射器，30 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>302832</td><td>用于腺体清洗与消化的材料</td></tr><tr><td>四乙基氯化铵</td><td>Sigma</td><td>T2265-100G</td><td>用于配制灌流液的TEA</td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma</td><td>T9253-5G</td><td>用于腺体消化的试剂</td></tr><tr><td>浸油F型</td><td>Leica</td><td>195371-10-9</td><td>Leica共聚焦显微镜用封片油</td></tr></tbody></table>

利用共聚焦显微镜测量肾上腺嗜铬细胞中融合孔动力学的三种模式

Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

动态融合孔的开放与关闭介导了胞吐作用和胞吞作用，并决定了它们的动力学特征。本文详细展示了如何将共聚焦显微镜与膜片钳记录技术相结合，用于检测原代培养的牛肾上腺嗜铬细胞中的三种融合模式。这三种融合模式包括：1）闭合融合（也称为“亲吻即走”模式），涉及融合孔的开放与随后关闭；2）持续融合，涉及融合孔的开放并维持孔道的持续开放状态；3）收缩融合，涉及融合后形成的Ω形膜结构逐渐收缩，直至完全与质膜合并。
为了检测这些融合模式，通过过表达与磷脂酶C δ的PH结构域（PH-mNG）相连的mNeonGreen标记细胞质膜，该结构域能够结合细胞质侧质膜上的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PtdIns(4,5)P2）；同时将荧光假神经递质FFN511加载至囊泡中以检测囊泡内容物的释放；并在灌流液中加入Atto 655以检测融合孔的关闭。这三种荧光探针在活体嗜铬细胞中以每帧约20–90毫秒的速度同时成像，用于检测融合孔开放、内容物释放、融合孔关闭以及融合囊泡的尺寸变化。本文描述了通过这些荧光信号区分三种融合模式的分析方法。该方法原则上可应用于除嗜铬细胞外的多种分泌细胞。

根据图1和图2所示的实验步骤，用PH-mNG转染牛肾上腺的嗜铬细胞以标记质膜；在灌流液中加入A655以检测融合孔的关闭；并用荧光假神经递质FFN511装载囊泡以检测释放事件。随后，在细胞底部（Z焦平面位于细胞膜上方约100-200 nm处）每20-90 ms进行一次FFN511、PH-mNG和A655的XY平面共聚焦时间序列成像。通过全细胞膜片钳记录，并施加从-80 mV到+10 mV、持续1 s的去极化刺激，以诱发胞吐和胞吞作用（图3A-C）。该去极化刺激引发内向钙电流、指示胞吐的膜电容跳跃，以及跳跃后指示胞吞的膜电容衰减（图3D，E）。
通过在细胞底部进行延时XY/Zfixed成像，去极化后观察到大量单个融合事件<sup...

本方案描述了一种共聚焦成像技术，用于检测牛肾上腺嗜铬细胞中的三种融合模式。这些融合模式包括：1）闭合融合（也称为“亲吻即走”模式），涉及融合孔的开放与关闭；2）持续融合，涉及融合孔的开放并维持孔道的开放状态；3）收缩融合，涉及融合囊泡的收缩。

动态融合孔的开放与关闭介导了胞吐作用和胞吞作用，并决定其动力学过程。本文详细展示了如何利用共聚焦显微镜……

膜融合介导多种生物学功能。本方案描述了一种检测融合孔开放与递质释放动态并区分三种融合模式的方法：闭合融合、持续融合和收缩融合。共聚焦显微镜与膜片钳记录技术的结合，有助于可视化观察融合孔的开放与关闭过程，并确定其动力学特征。尽管本方法以嗜铬细胞为描述对象，但其原理可广泛应用于多种分泌细胞，远不止嗜铬细胞。该方法的成功实施依赖于若干关键步骤，例如获得健康的原代嗜铬细胞培养、实现足够的质粒转染效率以及较高的电生理记录成功率。选择三个表面无切割或出血的完整腺体，并用剪刀去除脂肪组织。用Locke氏溶液灌注腺体，直至无血液流出。消化时，使用带有0.22微米滤器的30毫升注射器经肾上腺静脉注入酶溶液，直至腺体开始肿胀。然后将腺体置于37°C下孵育10分钟。再次注射，并将腺体在37摄氏度下孵育10分钟。消化完成后，用剪刀从肾上腺静脉端向另一端纵向剪开腺体以展开组织。用镊子将白色的髓质部分逐块剥离，放入含有Locke's溶液的10厘米培养皿中。用剪刀剪切并切碎髓质。使用80至100微米的尼龙筛网将髓质悬液过滤至烧杯中。将滤液转移至50毫升锥形管中，在室温下以48 × g离心3分钟，减速设为3。离心后，弃去上清液，用移液管将细胞沉淀重悬于Locke's溶液中。使用80至100微米的细胞筛过滤细胞悬液，在室温下以48 × g离心3分钟，减速度设为3。弃去上清液，将细胞沉淀用30毫升培养基重悬。使用血细胞计数板确定细胞数量。将 2,800,000 个细胞转移至 15 毫升离心管中。在减速为 3 的条件下，以 48 × g 离心 2 分钟，使细胞沉淀。加入100微升制造商提供的转染缓冲液至细胞沉淀中，然后加入2微克PH-mNG质粒。通过反复吹打轻轻混匀悬浮液，并立即转移混合物至电穿孔比色皿中。立即将比色皿转移至电穿孔仪，从屏幕列表中选择005程序，按Enter键开始电穿孔。电穿孔后，立即向比色皿中加入1.8毫升培养基，并用装有无菌吸头的移液器轻轻混匀。将电穿孔细胞悬液中的300微升接种到每个培养皿的盖玻片上，每次电穿孔反应共铺5至6个培养皿。将培养皿小心转移至37摄氏度、含9%二氧化碳的湿润培养箱中孵育30分钟，30分钟后向每皿中轻柔加入2毫升预热的培养基。使用拉制仪将硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成膜片钳电极，用电极尖端涂覆液体石蜡，并用显微抛光仪进行抛光处理。打开膜片钳记录放大器并启动软件。设置软件中相应的钙电流和电容记录参数。设定总时长为60秒的记录程序，刺激从第10秒开始。将电压钳制记录的保持电位设为80毫伏。将刺激设置为从负80毫伏去极化至10毫伏，持续1秒，以诱导钙离子内流和电容跳跃。打开共聚焦显微镜系统，并在软件中设置适当的参数。开启激光器，包括458纳米、514纳米和633纳米激光器，并根据每种荧光探针的特性设置各激光器的发射光收集范围。选择细胞状态良好且表达正确的培养皿，向其中加入两微升荧光假性神经递质 FFN511。将培养皿放回培养箱中孵育 20 分钟。加载 FFN511 后，准备记录室，并将两微升荧光染料 A655 加入 50 微升灌流液中。用镊子将盖玻片从培养皿转移至记录室，并立即加入含有灌流液的A655。在100倍油镜物镜上滴加一滴镜油。将记录室安装到显微镜上，调节调焦旋钮，使镜油刚好接触到盖玻片底部。将细胞调至清晰对焦，使用明场和共聚焦成像寻找表达mNG的合适细胞。放大选定的细胞并将其置于视野中央，尽量减少空白区域。针对FFN511、PH-mNG和A665，在固定的Z平面设置XY平面共聚焦成像参数，并尽量缩短时间间隔。使用微调旋钮将焦距调整至细胞底部。在软件中调节激发激光功率，找到最佳信噪比的设置，并避免明显的荧光漂白。向玻璃微电极中加入九微升内液，并将电极连接到膜片钳放大器阶段的电极夹持器上。使用注射器施加少量正压，并通过显微操作器移动移液管尖端接触浴液。通过电压脉冲测试，确保放大器显示的移液管电阻约为2至4兆欧。按下LJ/Auto以消除液接电位。使用显微操作器将移液管移向选定的细胞。为形成细胞附着模式，将移液管尖端移动至接触细胞表面。同时用注射器施加轻微的负压，将保持电位从零调整至负80毫伏。当电阻超过1吉欧姆时，等待约30秒，使配置稳定。按下C-fast/Auto以补偿快速电容。为形成全细胞记录模式，用注射器施加短暂但强力的负压脉冲，直至膜破裂。按下 C-slow/Auto 以补偿缓慢的电容。轻微调整成像焦距，使细胞底部处于焦点。通过两个不同的软件应用程序分别点击“开始”按钮，同时启动共聚焦延时成像和膜片钳记录。记录完成后，确保保存数据。将钳制电位恢复至零毫伏。将移液管移出浴液并弃置。使用任何制造商提供的软件打开原始成像文件。进入“处理”菜单，点击“ProcessTools”，并利用工具为每个时间序列图像生成滚动平均文件。保存这些文件。在“量化”选项中，进入“工具”并点击“剖面图”按钮，以查看刺激前后的时间点，并识别各通道中的荧光变化。点击“绘制椭圆”按钮，圈选出用于融合事件的感兴趣区域。在图像上单击右键，然后点击“保存感兴趣区域”以保存结果。单击“打开项目”以定位原始文件。右键单击图像，然后单击“加载 ROI”以在原始成像文件中加载 ROI 文件，从而测量荧光强度。转到“工具”并单击软件中的“排序 ROI”，绘制每个 ROI 三个通道的轨迹图。单击“报告”以保存感兴趣区域（ROI）的数据，包括每个 ROI 的数字数据和成像轨迹，保存至文件夹中。通过全细胞膜片钳记录，并施加从 -80 到 -10 毫伏、持续 1 秒的去极化刺激，以诱发胞吐和胞吞作用。所施加的去极化刺激引发内向钙电流、电容跳跃（表明发生胞吐作用）以及跳跃后的电容衰减（表明发生胞吞作用）。通过在细胞底部进行延时成像，由持续一秒的去极化方案诱导的融合事件表现为FFN信号下降（反映FFN511的释放），同时伴随FPH和A655斑点荧光增强，反映PH-mNG和A655从质膜及浴液中扩散进入正在融合的囊泡。该图展示了紧密融合，其特征为F655荧光减弱，而FPH信号保持稳定或延迟衰减。该图还展示了滞留融合，其判断依据是PH-mNG和A655斑点均持续存在。该图显示了收缩融合现象，表现为平行的FPH和F655信号衰减，同时伴随PH-mNG斑点和A655斑点的平行尺寸减小。成功记录需要通过膜片钳技术形成全细胞构型，并在细胞底部对每个荧光通道以适当的荧光强度进行成像。此处描述的电生理学与超分辨率显微镜相结合的方法，是测量融合孔动态变化和神经环路的有力工具。

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测量心肌细胞中的快速钙离子流

通过追踪光转化的基质靶向GFP在随时间变化的线粒体网络中的平衡情况，来测量线粒体融合。迄今为止，每次仅能对一个细胞进行长达一小时的动力学分析。我们提出了一种可同时测量多个细胞的方法，从而加快了数据采集过程。...

一种基于mtPA-GFP的快速、高分辨率线粒体融合检测方法：利用共聚焦显微镜并行获取多个细胞的动力学数据

我们开发了一个软件平台，利用 Imaris Neuroscience、ImarisXT 和 MATLAB...

一种可量化三维荧光图像中细胞形态变化的分析工具

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胞吐作用后，融合的质膜通过一种称为内吞作用的过程被回收。该机制可重新形成新的突触小泡，以供下一轮释放使用。通过在小鼠肾上腺嗜铬细胞中采用细胞贴附式电容记录技术，可捕获并分析单个内吞事件。...

小鼠肾上腺嗜铬细胞膜电容细胞贴附式测量方法

本文介绍了一种利用突触小泡蛋白2-pHluorin构建体和全内反射荧光显微镜技术研究神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动态的方法。同时报道了图像处理与数据分析的策略。...

使用TIRFM和pH敏感型GFP探针评估SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动态：细胞成像与数据分析

MRP4 调控多种环核苷酸依赖性信号事件，其中包括最近阐明的在细胞迁移中的作用。我们描述了一种直接但多方面的研究方法，用于揭示 MRP4 的下游分子靶点，从而鉴定出一个独特的 MRP4...

研究含 Mrp4 大分子复合物在成纤维细胞迁移调控中的方法

本文介绍了一种在小鼠神经肌肉接头处对单个细胞类型的细胞群体进行钙信号成像的实验方案。...

离体成像小鼠膈肌三联突触中细胞特异性钙信号

本方案用于成像免疫突触的形成过程以及随后向免疫突触定向的分泌性物质运输。细胞 conjugates 由经超抗原刺激的 Raji 细胞（作为抗原呈递细胞）与 Jurkat 克隆细胞（作为效应辅助性 T...

成像人类免疫突触

由于基于 Förster 共振能量转移（FRET）的传感器本身信噪比（SNR）较低，cAMP 信号的测量一直具有挑战性，尤其是在三维空间中。本文介绍了一种高光谱 FRET 成像与分析方法，可实现三维空间内 cAMP...

使用四维（x, y, z 和 &lambda;）高光谱FRET成像与分析技术测量活细胞中三维cAMP分布

学习共聚焦显微镜结合膜片钳技术，用于检测牛肾上腺嗜铬细胞的三种融合模式：紧密融合、停留融合和收缩融合。该方法可实时观察融合孔动态，揭示神经递质释放机制。

利用共聚焦显微镜测量肾上腺嗜铬细胞中融合孔动力学的三种模式

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