利用共聚焦显微镜测量肾上腺嗜铬细胞中融合孔动力学的三种模式

膜融合介导多种生物学功能。本方案描述了一种检测融合孔开放与递质释放动态并区分三种融合模式的方法：闭合融合、持续融合和收缩融合。共聚焦显微镜与膜片钳记录技术的结合，有助于可视化观察融合孔的开放与关闭过程，并确定其动力学特征。

尽管本方法以嗜铬细胞为描述对象，但其原理可广泛应用于多种分泌细胞，远不止嗜铬细胞。该方法的成功实施依赖于若干关键步骤，例如获得健康的原代嗜铬细胞培养、实现足够的质粒转染效率以及较高的电生理记录成功率。选择三个表面无切割或出血的完整腺体，并用剪刀去除脂肪组织。

用Locke氏溶液灌注腺体，直至无血液流出。消化时，使用带有0.22微米滤器的30毫升注射器经肾上腺静脉注入酶溶液，直至腺体开始肿胀。然后将腺体置于37°C下孵育10分钟。

再次注射，并将腺体在37摄氏度下孵育10分钟。消化完成后，用剪刀从肾上腺静脉端向另一端纵向剪开腺体以展开组织。用镊子将白色的髓质部分逐块剥离，放入含有Locke's溶液的10厘米培养皿中。

用剪刀剪切并切碎髓质。使用80至100微米的尼龙筛网将髓质悬液过滤至烧杯中。将滤液转移至50毫升锥形管中，在室温下以48 × g离心3分钟，减速设为3。

离心后，弃去上清液，用移液管将细胞沉淀重悬于Locke's溶液中。使用80至100微米的细胞筛过滤细胞悬液，在室温下以48 × g离心3分钟，减速度设为3。弃去上清液，将细胞沉淀用30毫升培养基重悬。

使用血细胞计数板确定细胞数量。将 2,800,000 个细胞转移至 15 毫升离心管中。在减速为 3 的条件下，以 48 × g 离心 2 分钟，使细胞沉淀。

加入100微升制造商提供的转染缓冲液至细胞沉淀中，然后加入2微克PH-mNG质粒。通过反复吹打轻轻混匀悬浮液，并立即转移混合物至电穿孔比色皿中。

立即将比色皿转移至电穿孔仪，从屏幕列表中选择005程序，按Enter键开始电穿孔。电穿孔后，立即向比色皿中加入1.8毫升培养基，并用装有无菌吸头的移液器轻轻混匀。将电穿孔细胞悬液中的300微升接种到每个培养皿的盖玻片上，每次电穿孔反应共铺5至6个培养皿。

将培养皿小心转移至37摄氏度、含9%二氧化碳的湿润培养箱中孵育30分钟，30分钟后向每皿中轻柔加入2毫升预热的培养基。使用拉制仪将硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成膜片钳电极，用电极尖端涂覆液体石蜡，并用显微抛光仪进行抛光处理。打开膜片钳记录放大器并启动软件。

设置软件中相应的钙电流和电容记录参数。设定总时长为60秒的记录程序，刺激从第10秒开始。将电压钳制记录的保持电位设为80毫伏。

将刺激设置为从负80毫伏去极化至10毫伏，持续1秒，以诱导钙离子内流和电容跳跃。打开共聚焦显微镜系统，并在软件中设置适当的参数。开启激光器，包括458纳米、514纳米和633纳米激光器，并根据每种荧光探针的特性设置各激光器的发射光收集范围。

选择细胞状态良好且表达正确的培养皿，向其中加入两微升荧光假性神经递质 FFN511。将培养皿放回培养箱中孵育 20 分钟。加载 FFN511 后，准备记录室，并将两微升荧光染料 A655 加入 50 微升灌流液中。

用镊子将盖玻片从培养皿转移至记录室，并立即加入含有灌流液的A655。在100倍油镜物镜上滴加一滴镜油。将记录室安装到显微镜上，调节调焦旋钮，使镜油刚好接触到盖玻片底部。

将细胞调至清晰对焦，使用明场和共聚焦成像寻找表达mNG的合适细胞。放大选定的细胞并将其置于视野中央，尽量减少空白区域。针对FFN511、PH-mNG和A665，在固定的Z平面设置XY平面共聚焦成像参数，并尽量缩短时间间隔。

使用微调旋钮将焦距调整至细胞底部。在软件中调节激发激光功率，找到最佳信噪比的设置，并避免明显的荧光漂白。向玻璃微电极中加入九微升内液，并将电极连接到膜片钳放大器阶段的电极夹持器上。

使用注射器施加少量正压，并通过显微操作器移动移液管尖端接触浴液。通过电压脉冲测试，确保放大器显示的移液管电阻约为2至4兆欧。按下LJ/Auto以消除液接电位。

使用显微操作器将移液管移向选定的细胞。为形成细胞附着模式，将移液管尖端移动至接触细胞表面。同时用注射器施加轻微的负压，将保持电位从零调整至负80毫伏。

当电阻超过1吉欧姆时，等待约30秒，使配置稳定。按下C-fast/Auto以补偿快速电容。为形成全细胞记录模式，用注射器施加短暂但强力的负压脉冲，直至膜破裂。

按下 C-slow/Auto 以补偿缓慢的电容。轻微调整成像焦距，使细胞底部处于焦点。通过两个不同的软件应用程序分别点击“开始”按钮，同时启动共聚焦延时成像和膜片钳记录。

记录完成后，确保保存数据。将钳制电位恢复至零毫伏。将移液管移出浴液并弃置。

使用任何制造商提供的软件打开原始成像文件。进入“处理”菜单，点击“ProcessTools”，并利用工具为每个时间序列图像生成滚动平均文件。保存这些文件。

在“量化”选项中，进入“工具”并点击“剖面图”按钮，以查看刺激前后的时间点，并识别各通道中的荧光变化。点击“绘制椭圆”按钮，圈选出用于融合事件的感兴趣区域。在图像上单击右键，然后点击“保存感兴趣区域”以保存结果。

单击“打开项目”以定位原始文件。右键单击图像，然后单击“加载 ROI”以在原始成像文件中加载 ROI 文件，从而测量荧光强度。转到“工具”并单击软件中的“排序 ROI”，绘制每个 ROI 三个通道的轨迹图。

单击“报告”以保存感兴趣区域（ROI）的数据，包括每个 ROI 的数字数据和成像轨迹，保存至文件夹中。通过全细胞膜片钳记录，并施加从 -80 到 -10 毫伏、持续 1 秒的去极化刺激，以诱发胞吐和胞吞作用。所施加的去极化刺激引发内向钙电流、电容跳跃（表明发生胞吐作用）以及跳跃后的电容衰减（表明发生胞吞作用）。

通过在细胞底部进行延时成像，由持续一秒的去极化方案诱导的融合事件表现为FFN信号下降（反映FFN511的释放），同时伴随FPH和A655斑点荧光增强，反映PH-mNG和A655从质膜及浴液中扩散进入正在融合的囊泡。该图展示了紧密融合，其特征为F655荧光减弱，而FPH信号保持稳定或延迟衰减。该图还展示了滞留融合，其判断依据是PH-mNG和A655斑点均持续存在。

该图显示了收缩融合现象，表现为平行的FPH和F655信号衰减，同时伴随PH-mNG斑点和A655斑点的平行尺寸减小。成功记录需要通过膜片钳技术形成全细胞构型，并在细胞底部对每个荧光通道以适当的荧光强度进行成像。此处描述的电生理学与超分辨率显微镜相结合的方法，是测量融合孔动态变化和神经环路的有力工具。