Name: 在大鼠中建立深低温循环停滞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 学习在大鼠中建立深低温循环停滞的方法，用于研究神经炎症和氧化应激等生理反应。该方案为心血管生理学和神经科学研究提供了可靠的实验模型。

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作者感谢张亮在实验期间协助收集视频数据。本研究由国家自然科学基金（资助号：82070479）和中央高校基本科研业务费专项资金（资助号：3332022128）支持。

本研究方案经过机构审查，并获得中国医学科学院阜外医院机构动物护理和使用委员会的批准（FW-2021-0005）。所有实验操作均遵循美国国立卫生研究院发布的《实验动物护理和使用指南》进行。
注意：雄性Sprague-Dawley大鼠（体重：500-600 g，年龄：12-14周）在标准实验室条件下饲养，可自由获取食物和水。将大鼠随机分为两组（每组n = 6）：深低温停循环组（DHCA组）和正常体温体外循环组（NtCPB组）。
1. 准备工作
<ol>
	<li>在实验前对手术器械（镊子、剪刀、显微镊、电凝器、剃刀等）进行灭菌处理（图1）。</li>
	<li>确保以下耗材齐备：2-0 丝线、16 G 套管（气管导管）、22 G 套管、自制 16 G 套管（多孔静脉导管）、注射器、纱布和胶带。 
	注意：制作自制 16 G 套管时，使用手术刀在套管尖端切出两到三个直径为 2 mm 的孔，有助于使静脉引流更顺畅。</li>
	<li>确保备有七氟烷、2% 利多卡因、生理盐水、肝素（5 IU/mL，250 IU/mL）、肾上腺素（40 µg/mL）、去甲肾上腺素（20 µg/mL）、羟乙基淀粉和碳酸氢盐。</li>
	<li>确保深低温停循环（DHCA）回路包含储液器（改良自墨菲滴管）、滚压泵、热交换器、膜式氧合器、连接管路和水箱（图2）。连接回路，并将 12 mL 羟乙基淀粉与 1 mL 肝素钠（250 IU）和 1 mL 生理盐水混合。使用滚压泵缓慢转动（10–40 mL/min），以 14 mL 预充液对回路进行预充。 
	注意：储液器由带墨菲滴管的输血装置改造而成。滴管的静脉入口部分保持在 10–15 cm，静脉出口部分保持在 10 cm。</li>
</ol>
2. 麻醉与插管
<ol>
	<li>使用2%-3%七氟烷对大鼠进行麻醉，待大鼠意识丧失后，检测其是否无角膜反射及肌肉松弛。 
	注意：结膜反射是指角膜受到触碰时眼睑立即闭合的现象。使用棉签轻轻触碰角膜。当麻醉深度足够时，眼睑不会闭合。</li>
	<li>在角膜反射消失且无肌肉阻力时，使用16 G套管进行气管插管。将导管连接至呼吸机，并通过点击呼吸机上的按钮设置参数（潮气量：1.0–1.2 mL/100g，呼吸频率：80次/分钟 [bpm]，吸呼比 [I:E] = 1:1，吸入氧浓度：60%）。</li>
	<li>将电热毯置于大鼠身下，并用胶带固定大鼠。在眼睛上涂抹眼用软膏以防止干燥。使用剃毛器剃除左侧腹股沟区、右侧颈部区域及尾部的毛发。随后用碘伏和酒精对皮肤消毒三次。</li>
	<li>在进入下一步之前检查麻醉深度。如果呼吸频率高于呼吸机设定值（80 次/分钟），或出现肌肉僵直，则应增加七氟烷的输出浓度。 
	注意：当麻醉深度适当时，呼吸节律应与呼吸机同步，肌肉应完全松弛，无任何紧张。每30分钟检查一次麻醉深度，以确保大鼠在整个实验过程中未出现意识恢复。</li>
	<li>使用手术刀在左侧腹股沟区域（约1 cm）切开皮肤，轻柔分离肌肉和组织以暴露左侧股静脉和股动脉。仔细分离动脉。</li>
	<li>将22 G静脉导管插入左侧股动脉。在插管部位用2-0丝线结扎动脉和导管。使用含肝素（5 UI/mL）的生理盐水冲洗导管，以防凝血。将导管连接至压力传感器以监测血压。</li>
	<li>剪开尾部皮肤（约1.5 cm），然后用手术刀切开尾动脉表面的浅筋膜，暴露位于手术视野中央的尾动脉。</li>
	<li>用22 G静脉导管插入股动脉，在插管部位用2-0丝线结扎动脉和导管。使用含肝素（5 UI/mL）的生理盐水冲洗导管，以防凝血。 
	注意：插管静脉导管时，左手用镊子夹住动脉/静脉，右手持导管内的针头刺入动脉/静脉，随后将导管置入动脉。</li>
	<li>在右侧颈静脉处切开皮肤（约2 cm），分离肌肉和组织以暴露静脉。将自制的16 G多孔静脉导管插入右侧颈外静脉，并小心送入右侧下腔静脉或右心房。 
	注意：左侧股静脉和股动脉位于左腹股沟区域皮下。静脉比动脉粗，动脉血液呈鲜红色。右侧颈静脉位于右侧颈部区域中央；切开皮肤并分离肌肉后，可见该静脉（宽约0.3–0.4 cm）。当导管尖端触及右心房时，血压波形将出现波动。随后稍许回撤导管，其尖端即位于上腔静脉内。</li>
	<li>给予肝素钠（500 IU/kg） 通过 右侧外静脉。用湿润纱布覆盖每个插管区域，以避免污染。 
	&#8203;注意：在手术台下方放置一个箱子，将其抬高约40 cm。</li>
</ol>
3. 深低温停循环的启动
<ol>
	<li>首先将深低温停循环（DHCA）管路与尾动脉导管连接，并保持泵流速为 1-2 mL/min。然后将储血器与右侧颈外静脉导管连接。确保储血器内始终维持约 1 cm 的血液液面。</li>
	<li>打开水箱，先将水温设定为 37 °C。</li>
	<li>待血压稳定后，缓慢增加泵流速至 80-100 mL/kg/min，以驱动血液循环。</li>
</ol>
4. 冷却
<ol>
	<li>将室温调节至约 20 °C。将冰块放入一次性手套中，然后放置于大鼠头部及两侧。根据大鼠的直肠温度实时调节水浴箱的温度。</li>
	<li>从左侧股动脉采集 0.1 mL 血液，置于血气分析仪中进行血气分析。根据血气分析结果（如 PaCO2）适当调整呼吸机的相关参数。 
	&#8203;注意：心率和血压可能发生改变，应相应调整泵流速。水浴箱与大鼠之间的温度梯度应小于 10 °C。确保在 30 分钟内将温度降至 15–20 °C。PaCO2 的正常范围为 35–45 mmHg。若血气分析结果显示 PaCO2 偏低，可降低潮气量，反之亦然。</li>
</ol>
5. 深低温停循环
<ol>
	<li>当直肠温度降至 15–20 °C 时，更换一次性手套（内含冰块），以确保在循环停止期间维持深度低温状态。</li>
	<li>停止滚压泵，使储血器与环境接触，并从颈外静脉缓慢将血液引流至储血器中。</li>
	<li>注意观察血压波形。当血压和心率均为 0 时，停止引流，并保持储血器封闭。关闭呼吸机。 
	&#8203;注意：循环停止的持续时间根据实验目的而有所不同。</li>
</ol>
6. 预热与再灌注
<ol>
	<li>脱去所有一次性手套，并将室温升至 25 °C。在保持静脉引流管夹闭的同时，恢复膜式氧合器的通气。启动蠕动泵，确保储血器中的血液缓慢回输至大鼠体内。</li>
	<li>开启呼吸机。当储血器中的血平面稳定在 1 cm 时，松开引流管，缓慢将右心房的血液引流至储血器中。</li>
	<li>打开加热灯、加热垫和水箱。首先将水箱温度设为 25 °C，随后根据大鼠直肠温度及时调节其出水口温度。 
	注意：加热灯应指向大鼠胸腔内的大血管，并保持一定距离，避免组织灼伤。注意监测出水口温度与大鼠直肠温度之间的温差（&#60;10 °C）。必要时检测血气，并据此调整呼吸机参数，给予碳酸氢盐、电解质等处理。</li>
	<li>当直肠温度恢复至 34 °C 后，移除加热灯。 
	&#8203;注意：此步骤作为快速复温过程的延续，应缓慢进行。在此阶段，可将七氟烷蒸发器、机械呼吸机和蠕动泵等设备的参数恢复至体外循环开始前的水平。</li>
</ol>
7. 停止体外循环
<ol>
	<li>缓慢逐渐降低滚柱泵的流速，并调节静脉引流速度，直至流速降至 1 mL/min。 
	注意：每次调整流速后应观察 3–5 分钟。</li>
	<li>使储血器与环境保持接触（取下储血器盖），以 1 mL/min 的流速将管路中剩余的血液灌注完毕。</li>
	<li>停止膜式氧合和滚柱泵运转。</li>
	<li>在深度麻醉下进行一段时间的机械通气后，处死大鼠。 
	注意：此为终末性操作。脱离体外循环（CPB）与处死之间的时间间隔根据不同的研究方案而有所不同。处死前请记得用碘伏和酒精对伤口进行消毒，并用湿纱布覆盖各插管部位，以防止污染。可增加七氟烷的输出浓度以加深麻醉程度。</li>
</ol>

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<li>Jenke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AdipoRon+attenuates+inflammation+and+impairment+of+cardiac+function+associated+with+cardiopulmonary+bypass-induced+systemic+inflammatory+response+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">AdipoRon attenuates inflammation and impairment of cardiac function associated with cardiopulmonary bypass-induced systemic inflammatory response syndrome.</a> Journal of the American Heart Association. 10 (6), 018097(2021).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

插管是建立大鼠深低温停循环（DHCA）最基本的步骤。插管前，用0.5 mL的2%利多卡因浸泡动脉，有助于更顺利地进行插管。插管后，以500 IU/kg剂量的肝素进行肝素化处理 通过 避免微血栓形成需要结扎颈外静脉17我们反复发现，该剂量的肝素能够达到活化凝血时间（ACT）的目标值 &gt;480 秒。复温阶段是最困难的部分。在我们的实验中，温度从 18 °C 上升到 34 °C 花费了超过 60 分钟，而在其他一些实验中，复温过程可在 30 分钟或 40 分钟内完成。18,19Linardi 等人报道，较快的复温速率（45 分钟）会增强炎症反应，并可能影响深低温停循环（DHCA）后的脑水肿20与此同时，美国胸外科医师学会、心血管麻醉学会以及体外循环技术学会的指南指出，降温或复温过程中的温度梯度均不应超过10 °C，以分别避免产生气体栓塞和脱气现象。21. </p...

深低温停循环（DHCA）自1953年起已应用于心脏外科手术1。 DHCA是指在全身性中断血流之前，将患者的中心体温降低至深度低温水平（15–22 °C）2。停循环可提供相对无血的手术视野。深度低温可降低机体代谢，尤其是脑和心肌的代谢，是预防缺血性损伤的有效保护手段3。DHCA常用于复杂先天性心脏病、主动脉弓病变，甚至伴有下腔静脉血栓的肾或肾上腺肿瘤手术中4,5。因此，建立DHCA动物模型对于优化临床操作流程及预防并发症具有重要的参考价值。
尽管可以使用犬6、兔7及其他动物建立模型，但使用大鼠更为理想，因其操作性强且成本较低。深低温停循环（DHCA）大鼠模型最早由Jungwirth等人于2006年描述8。研究发现，循环停止的持续时间会影响神经功能预后。自此以后，DHCA大鼠模型被广泛研究。已有研究明确，DHCA可引发全身性炎症反应综合征（SIRS）9。在后续研究中，药理学家发现，由SIRS引起的DHCA相关性神经炎症可通过白藜芦醇10和雷公藤内酯11减轻。我们团队也发现，通过抑制冷诱导RNA结合蛋白可减轻DHCA相关的神经炎症12。在心血管系统中，超氧化物歧化酶对DHCA期间的缺血/再灌注（I/R）损伤具有心肌保护作用13。这些结果加深了对DHCA相关病理生理过程的理解，并为改善DHCA预后提供了新的方向。然而，关于DHCA后内毒素血症、氧化应激及自噬的研究结果尚不一致。DHCA采用与体外循环（CPB）相同的操作技术14，但其管理策略不同，且不同研究团队建立DHCA的具体步骤也存在差异8,9,10,11。本研究旨在提供一种在大鼠中建立DHCA操作的方法。

<table><tbody><tr><td>热交换器</td><td>Xi&amp;rsquo;an Xijing Medical Appliance Co., Ltd</td><td>Animal-M</td><td></td></tr><tr><td>膜式氧合器</td><td>Dongguan Kewei Medical Instrument Co., Ltd.</td><td>Micro-M</td><td></td></tr><tr><td>监护仪</td><td>Chengdu Techman Co., Ltd</td><td>BL-420s</td><td></td></tr><tr><td>滚压泵</td><td>Changzhou Prefluid Technology Co.,Ltd</td><td>BL100</td><td></td></tr><tr><td>SD大鼠</td><td>HFK Bioscience Co.,Ltd.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>七氟烷</td><td>Maruishi Pharmaceutical Co. Ltd</td><td>H20150020</td><td></td></tr><tr><td>剃毛器</td><td>Hangzhou Huayuan Pet Products Co.,Ltd.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>蒸发器</td><td>SPACECABS</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>呼吸机</td><td>Shanghai Alcott Biotech Co., Ltd</td><td>ALC-V8S</td><td></td></tr><tr><td>水箱</td><td>Maquet Critical Care AB</td><td>Jostra HCU20-600</td><td></td></tr></tbody></table>

大鼠深低温停循环模型的建立

Establishment of Deep Hypothermic Circulatory Arrest in Rats

深低温停循环（DHCA）常规应用于复杂先天性心脏病和主动脉弓疾病手术中。本研究旨在提供一种在大鼠中建立DHCA的方法。为评估DHCA过程对生命体征的影响，采用正常体温下无停循环的心肺转流（CPB）大鼠模型作为对照。结果表明，DHCA显著降低了体温和平均动脉压。血气分析显示，DHCA导致乳酸水平升高，但对血液pH值以及血红蛋白、红细胞压积、Na+、Cl−、K+和葡萄糖浓度无影响。此外，与正常体温CPB大鼠相比，透射电子显微镜结果显示DHCA大鼠海马区自噬体轻度增加。

作为对照组，未进行循环停顿的常温体外循环（NtCPB）大鼠在整个过程中显示出稳定的平均动脉血压（MAP）和体温，而深低温停循环（DHCA）大鼠在心脏停搏期间MAP显著下降（p &lt; 0.01，图3A）。DHCA大鼠在降温阶段体温迅速下降，在复温阶段逐渐回升。当大鼠脱离DHCA回路时，其体温恢复至正常水平（图3B）。
通过血气分析研究了深低温停循环（DHCA）过程对大鼠的影响。全血与预充液接触后，两组大鼠的血红蛋白（Hb）浓度均高于6 g/dL（图4A）。当大鼠脱离DHCA回路时，由于体外循环（CPB）回路中残余血液被输注回大鼠体内，Hb浓度上升至9 g/dL。红细胞压积（HCT）的变化趋势与Hb相似（图4B）。在CPB程序开始时，Hb和HCT的差异可能是由于大鼠体重不同所致。DHCA组大鼠的平均体重为571.1 g ± 7....

本方案介绍了在大鼠中建立深低温停循环的方法，可用于研究全身性炎症反应综合征、缺血/再灌注损伤、氧化应激、神经炎症等。

深低温停循环（DHCA）在复杂先天性心脏病和主动脉弓疾病手术中常规应用。目前……

建立大鼠深低温循环停搏模型。深低温循环停搏（DHCA）在复杂先天性心脏病和主动脉弓疾病手术中常规应用。本研究旨在提供一种在大鼠中建立DHCA的方法。本方案已通过机构审查，并获得中国医学科学院阜外医院机构动物护理和使用委员会的批准。准备工作：确保体外循环（CPB）管路包含由莫菲氏滴管改装的储液器、滚压泵、热交换器、膜式氧合器、连接管，以及一个与管路相连的水箱；使用12毫升羟乙基淀粉、1毫升肝素钠和1毫升生理盐水配制成40毫升预充液，通过缓慢旋转滚压泵将预充液注入管路。第二步，麻醉与插管。将导管连接至呼吸机并设置侧边参数。铺好电热毯，将小鼠右侧朝上，并用胶带固定其右侧和面部。涂抹眼药膏以防止眼睛干燥。使用剃毛器剃除右侧腹股沟区域、右侧颈部区域以及尾部的毛发，然后用醛类和酒精对皮肤进行消毒。切开左侧腹股沟区的皮肤，解剖肌肉和软组织，暴露左侧股静脉和股动脉。仔细分离动脉。将22号静脉导管插入左侧股动脉。用丝线结扎动脉并插入导管。使用含肝素的生理盐水冲洗套管，以防凝血。将导管与压力传感器连接，以监测血压。切开尾部皮肤，然后使用解剖刀切开尾动脉表面的浅层组织，暴露位于手术视野中央的尾动脉。使用22号静脉导管插入尾动脉进行插管。用丝线结扎动脉和导管。使用含肝素的生理盐水冲洗导管，以防止凝血。切开右侧颈静脉的皮肤，分离肌肉和组织以暴露静脉。将一根自制的16号多用途静脉导管插入右侧颈外静脉，并小心地送入右下腔静脉或右心房。 在右侧颈外静脉给予肝素钠，并用湿润的棉球覆盖每个插管区域，以避免污染。第三步，将管路与尾动脉中的导管连接，并将泵速保持在每分钟1至2毫升的低速。然后，将储液器与右侧颈外静脉中的导管连接。确保储液器中的血平面始终保持在约一厘米的水平。首先打开水浴箱，并将水温设定为37摄氏度。待血压稳定后，缓慢增加泵的流量至每分钟80至100毫升。第四步，降温。将室温调节至约20摄氏度。将冰块放入一次性手套中，然后将其放置于头部右侧及两侧。应根据水稻的直肠温度实时调整水箱温度。根据血气分析结果，适当调整呼吸机的相关参数。五、深低温循环停搏。然后使直肠温度降至15至20摄氏度。更换冰袋并丢弃手套，以确保在循环停止期间维持深度低温状态。停止滚压泵。保持储液器与环境接触，并缓慢将血液从颈外静脉引流至储液器中。注意观察血压变化。当血压消失且无心跳时，停止引流并保持储液器关闭。关闭呼吸机。第六步，复温与再灌注。脱掉所有一次性手套，并将室温升高至25摄氏度。在保持静脉引流管夹闭的同时，恢复记忆氧供气。开启蠕动泵，确保储血器中的血液缓慢回流至右侧体循环。当储血器内液面稳定在1厘米时，启动呼吸机。利用引流管将右心房的血液缓慢引流至储液器中。打开加热灯、加热垫和水箱，将水箱温度设置为25°C。然后及时将其调整至左侧温度。当直肠温度恢复至34摄氏度时，移除加热灯。七、脱离体外循环。缓慢逐渐降低泵的滚轮流速，并调节静脉属流速，使流速降至每分钟一毫升。保持储液器与环境接触。以每分钟一毫升的流速将回路中剩余的血液灌注完毕。停止供氧和滚压泵。在机械通气和深度麻醉一段时间后实施安乐死。代表性结果。作为对照组，常温体外循环（NtCPB）大鼠在整个过程中未出现循环停搏，平均动脉血压（MAP）和体温均保持稳定。而深低温停循环（DHCA）大鼠在心脏停搏期间MAP下降。DHCA大鼠在降温阶段体温迅速下降，在复温阶段逐渐恢复。脱离DHCA循环后，DHCA大鼠的体温恢复正常。上述数据表明，我们的DHCA操作模拟了临床患者实际的体温和平均动脉压变化。通过血气分析研究了深低温停循环（DHCA）处理器及升温过程的影响。全血与初灌液接触后，两组的血红蛋白浓度均高于每分升6克。在脱离DHCA体外循环表面时，由于将体外循环管路中残余的血液回输至右侧，血红蛋白浓度升高至每分升9克。红细胞压积（HCT）的变化趋势与血红蛋白（HB）相似。在深低温停循环（DHCA）再灌注后，乳酸迅速升高，且在DHCA组中更为显著。DHCA术后pH值下降，很可能是由于乳酸积聚所致。在整个实验过程中，钠离子、氯离子、钾离子浓度以及葡萄糖水平在各个时间点均未表现出显著差异。该结果表明，深低温停循环（DHCA）仅导致乳酸水平升高，但并未影响血液pH值以及血红蛋白、红细胞压积、钠离子、氯离子、钾离子和葡萄糖的浓度。为了评估DHCA对神经元自噬的影响，我们使用了透射电子显微镜，出乎意料地发现DHCA大鼠海马区自噬体数量增加。上述数据表明，我们的DHCA模型成功模拟了临床患者实际的温度和平均动脉压（MAP）变化。该模型可用于研究全身性炎症反应综合征、神经炎症等。

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科研

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