Name: 对小鼠皮肤中的中性粒细胞迁移进行成像，以研究生理条件下的亚细胞膜重塑 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学习活体亚细胞显微成像技术，用于研究小鼠中性粒细胞在生理条件下迁移时的质膜动态重塑过程。该方法可实时观察细胞膜突起与收缩，揭示免疫细胞与组织微环境的相互作用机制。

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本研究由美国国立卫生研究院、国家癌症研究所癌症研究中心的院内研究项目资助。

所有动物实验和操作均经美国马里兰州贝塞斯达市国家卫生研究院国家癌症研究所动物护理和使用委员会批准（方案编号 LCMB-031 和 LCMB-035），并符合所有相关伦理规定。实验使用了年龄在2至6个月之间的雄性和雌性小鼠。mT/mG 和野生型（WT）宿主小鼠背景为 FVB/NJ，而 LyzM-Cre x mTmG 小鼠背景为 C57BL/6。
1. 试剂与工具的材料及准备
<ol>
	<li>使用含1% BSA（不含钙和镁）的PBS在振荡条件下过夜包被试管、培养皿以及针头/注射器。</li>
	<li>使用70%乙醇或高压灭菌法仔细清洁将用于动物实验的表面和工具/仪器。
	<ol>
		<li>为分离中性粒细胞，准备以下物品：3个15 mL离心管、1个60 mm培养皿、1个1.5 mL离心管；含10 mM HEPES（pH 7.3）的HBSS；红细胞裂解液（ACK）；Histopaque 1077；以及Histopaque 1119。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为进行中性粒细胞注射，准备以下物品：1个低容量注射器（10 μL）、1根33 G斜面针头、异氟烷，以及麻醉溶液（生理盐水中分别含80 mg·kg-1的氯胺酮、2 mg·kg-1的赛拉嗪和4 mg·kg-1的乙酰丙嗪）。</li>
</ol>
2. 从供体小鼠中纯化中性粒细胞
<ol>
	<li>根据当地机构规定对供体小鼠实施安乐死。</li>
	<li>从动物体内采集长骨（股骨、胫骨和肱骨），注意保持骨骼的完整性，避免在采集过程中切割骨骺端24.</li>
	<li>在经BSA包被的60 mm培养皿中，去除肌肉和脂肪组织。剪除骨端以暴露骨髓腔，随后用装有HBSS的注射器（27 G针头）冲洗并匀浆骨髓。</li>
	<li>使用40 µm滤网将溶液过滤至15 mL BSA包被的离心管中，然后以400 x g离心 g 室温（RT）下孵育5分钟。</li>
	<li>吸弃上清液，将沉淀物重悬于1 mL ACK溶液中30秒以裂解红细胞，随后加入9 mL HBSS终止裂解反应。将溶液在400 x g 室温下孵育5分钟。</li>
	<li>在一支15 mL BSA包被的离心管中制备密度梯度：先将4 mL 1119 Histopaque轻柔地加入管底，再小心地将4 mL 1077 Histopaque叠加在上层。操作时需格外注意，避免两层液体混合。</li>
	<li>吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于 2 mL HBSS 中。将该溶液轻柔地铺加在上述制备的阶梯梯度液顶部。在 1,000 x g 在室温下以尽可能低的加速度和减速度离心30分钟（&#34;无刹车&#34; 是首选方法）。</li>
	<li>从离心管顶部轻轻吸出一半的1077 Histopaque 层。将剩余的一半1077 Histopaque 层以及上半部分的1119 Histopaque 层收集至一支新的BSA包被的离心管中。位于两层密度介质之间的浑浊细胞悬液主要含有中性粒细胞。</li>
	<li>加入HBSS至终体积为15 mL，轻轻倒置离心管混匀。在400 x g 室温下孵育5分钟。</li>
	<li>离心后，用10 mL HBSS重悬并洗涤细胞沉淀，于400 x g离心 g 室温下孵育5分钟。重复该步骤，然后将沉淀重悬于15 mL HBSS中，使用细胞计数仪测定细胞数量。最后，离心并将其重悬于1 mL HBSS中，转移至1.5 mL BSA包被的离心管中。</li>
	<li>纯化后，将中性粒细胞悬液置于BSA包被的试管中，在室温下于试管旋转仪上轻轻振荡30分钟，直至标记和/或注射。 
	注意：成功的纯化可获得 10–20 × 106 每只小鼠获得纯度为95%的中性粒细胞。纯度通过评估确定 通过 流式细胞术，使用先前描述的中性粒细胞标记物（Ly6G+，Ly6C-，Gr1+，以及 CD11b+)25,26. 
	&#8203;注意：此前已有从人外周血和小鼠骨髓中纯化中性粒细胞的实验方案24,27.</li>
</ol>
3. 中性粒细胞标记
注意：为了观察中性粒细胞，需将其从 LyzM-Cre mT/mG 小鼠的髓系细胞表达一种与GFP融合的膜靶向肽。此外，来自野生型（WT）小鼠的纯化中性粒细胞被标记 体外以下步骤描述了使用商业化的细胞膜通透性绿色荧光染料标记纯化中性粒细胞的操作流程，该方法可适用于任何其他与多光子显微镜兼容的荧光探针。
<ol>
	<li>将绿色荧光染料（按生产商推荐浓度；此处为 1 µM）加入中性粒细胞悬液（从小鼠 WT 纯化）中，置于 1.5 mL BSA 包被的离心管内。在管式旋转仪中，室温下轻柔振荡孵育 30 分钟。</li>
	<li>用HBSS洗涤三次，400 x g离心 g 在室温下孵育5分钟，将沉淀重悬于1 mL HBSS中。</li>
	<li>将中性粒细胞悬液置于BSA包被的试管中，在室温下用试管旋转仪轻轻振荡，直至注射操作前。 
	注意：标记中性粒细胞后应尽可能立即进行注射。但如有必要，标记后的中性粒细胞可在持续振荡条件下保存额外10–15分钟，且不会影响中性粒细胞反应的完整性。 体内长时间震荡（标记后超过60分钟）将导致细胞成团、中性粒细胞死亡及误导性观察结果 体内.</li>
	<li>注射前，将细胞沉淀重悬于生理盐水中，调整细胞密度至2-5 × 106 每 20 µL 细胞数。</li>
</ol>
4. 中性粒细胞注射
注意：麻醉操作必须遵循当地机构动物护理和使用委员会的指导方针。
<ol>
	<li>将动物放入密闭舱内，使用连接至氧气浓缩器的校准挥发器，给予 3%–5% 异氟烷（流速为 2 L/min）。</li>
	<li>通过夹捏后肢足垫检测其足部回缩反射，以评估动物是否已失去意识。随后将动物转移至加热垫（37°C）上以维持其体温，并通过鼻罩持续给予异氟烷（1%–2%；流速为 0.5 L/min）。 
	安全提示：为减少人员接触有毒异氟烷的风险，建议使用配备过滤装置的回收系统，以捕获循环中的异氟烷。</li>
	<li>为优化成像质量，使用精细修剪器去除耳部毛发。该操作也可在实验前一至两天进行。 
	注意：不建议使用脱毛膏，因其已知会加剧小鼠皮肤的炎症反应，并引入成像伪影。</li>
	<li>将动物侧放。使用手术胶带固定耳缘，并将其平铺于加热垫上。轻柔粘贴胶带，避免对耳部造成损伤。</li>
	<li>用 33 G 针头连接的注射器吸取中性粒细胞悬液（每 20 µL 含 2–5 × 106 个细胞），并将其安装至显微操作仪上。 
	注意：针头与加热垫上耳部之间的注射角度应保持在 10° 至 30° 之间，以最大限度减少组织损伤并提高细胞注射成功率。</li>
	<li>将针头（斜面朝上）轻柔地移向耳部，缓慢刺入皮肤。当针头进入皮肤后，缓慢推动活塞，注入 2–3 µL 细胞悬液。 
	注意：应避开可见血管区域，因损伤血管会导致注射后产生非预期且复杂的免疫反应，并影响成像质量。</li>
	<li>在耳部 2–3 个不同区域重复注射，各注射点之间建议相距 2–3 mm。切勿&#34;过度填充&#34;耳部细胞悬液。 
	注意：注射应位于耳部中央区域。耳周组织较薄，操作时需格外小心以免损伤；而中央区域较厚，含有较大的血管且毛囊较少，可耐受较大的注射体积。</li>
	<li>小心移除手术胶带，让动物在监护下恢复意识。注射后让动物休息 1 小时，以便组织和细胞从注射操作中恢复，之后再进行成像。</li>
</ol>
5. 体外成熟过程中的麻醉
注意：更深的麻醉可通过减少由心跳和呼吸引起 的运动伪影，显著提高成像质量。注射中性粒细胞的小鼠接受化学麻醉，其镇静深度优于气体诱导麻醉。麻醉操作必须遵循当地机构动物护理与使用委员会的指导原则。
<ol>
	<li>中性粒细胞注射后1小时，通过皮下注射盐水溶液中的Xylazine/Ketamine/Acepromazine混合物（分别为80 mg·kg-1、2 mg·kg-1和4 mg·kg-1）对动物进行麻醉。 
	注意：为确保实验结果的可重复性和可靠性，从麻醉开始至实验结束，必须使用加热垫或连接温控泵的循环水垫保持动物体温。</li>
	<li>若需维持麻醉超过1小时，应每隔40分钟皮下注射一次Ketamine/Acepromazine混合物（分别为40 mg·kg-1和2 mg·kg-1）。通过检测后肢回缩反射，定期监测麻醉小鼠是否出现意识恢复的迹象。</li>
	<li>此外，对于持续时间超过1小时的成像操作，应向眼睛涂抹无菌非药物性眼膏，以防止麻醉期间角膜干燥，并通过皮下注射生理盐水（每小时200 µL）维持动物体液平衡。 
	&#8203;注意：也可采用数字控制的灌注系统，以实现麻醉药液和/或补液的定时、平稳输注。可设置自动注射泵，按需输送麻醉剂并维持长时间的体液补充。为此，可将带翼输液针插入动物背部皮下，并用外科胶带固定。</li>
</ol>
6. 成像
注意：此处描述的动物准备和成像参数是针对配备单激光线的倒置多光子显微镜进行优化的，该显微镜可用于激发并同时收集不同荧光染料的发射信号。
<ol>
	<li>在将麻醉后的动物放置于显微镜载物台上之前，确保显微镜已开启，并且载物台和物镜均已预热至 37 °C。用一片玻璃盖玻片（厚度 #1 或 1.5）覆盖载物台上的孔洞，并使其与加热的物镜对齐。</li>
	<li>小心地将动物移至载物台上。如果计划进行长时间成像（&#62;1 小时），请涂抹眼用软膏，并按照上述方法固定带翅输液灌注系统。</li>
	<li>在盖玻片中央滴加一滴生理盐水，然后将注射了中性粒细胞的耳朵置于其上。使用无菌棉签轻轻从盖玻片中心横向压平耳朵，以去除气泡。 
	注意：在耳朵与盖玻片之间加入生理盐水（或 PBS）可减少因气泡引起的光折射，从而确保折射率均匀，提高成像质量。</li>
	<li>用棉签取出的木棒轻轻压住靠近动物头部一侧的耳朵边缘，并用胶带固定，以固定耳朵（图 1A）。 
	注意：固定木棒可最大限度减少由心跳和呼吸引起的位置移动伪影，显著提升成像质量。重要的是，木棒的固定力度应足以稳定耳朵，但不得影响血液流动。</li>
	<li>通过显微镜目镜找到感兴趣的区域，然后切换至多光子采集模式。</li>
	<li>将激光激发波长设置为 900–930 nm，以便同时采集 GFP/绿色荧光染料、mTomato 以及胶原蛋白-I（via SHG）的信号。</li>
	<li>在探测器上设置合适的反射镜和滤光片组合，以收集发射光（带通滤光片：蓝色 = 410–460 nm，绿色 = 495–540 nm，红色 = 580–640 nm）。 
	注意：当标记了绿色荧光染料的中性粒细胞被注射入耳部较深层时，仍可在显微镜目镜下观察到强烈的绿色荧光信号。</li>
	<li>根据硬件配置确定最合适的设置。即使细胞迁移可用 30 秒&#160;至 1 分钟的时间间隔进行追踪，也应以更高速度（至少 &#60;10 秒间隔）对亚细胞事件进行成像。以下示例展示了两种不同的成像设置，以比较经典 IVM 与 ISMic 的差异。
	<ol>
		<li>在经典 IVM 方法中用于追踪细胞迁移并研究宿主小鼠组织（图 1），使用 30 倍物镜和检流计扫描器，图像尺寸为 512 × 512 像素（像素大小为 0.83 µm），并通过电动载物台设置 z 轴位移，步长为 2 µm，实现每 30 秒对深度为 30 µm 的体积进行成像。</li>
		<li>在 ISMic 方法中用于以更高放大倍数和分辨率成像高度动态的膜重塑过程（图 2），使用 40 倍物镜和共振扫描器，设置 3 次平均扫描，图像尺寸为 512 × 512 像素（像素大小为 0.25 µm），并通过压电陶瓷驱动器设置 z 轴位移，步长为 1 µm，实现每 4–5 秒对深度为 20 µm 的体积进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过诱导无菌性激光损伤来触发中性粒细胞迁移。将激发激光聚焦于组织的一个狭小区域（20 µm × 20 µm），以足够高的功率（至少达到 80 mW22）照射 10 秒。</li>
	<li>通过所有通道中出现的强烈自发荧光信号以及胶原排列结构的改变来识别激光诱导的损伤（图 1D）。 
	注意：为获得可靠结果，损伤应始终尽可能远离血管；若血管破裂，释放到组织中的血细胞将影响成像质量，并引发强烈的整体免疫反应。</li>
	<li>实验结束后保存数据，用于后续分析。</li>
	<li>根据当地机构的指导原则对动物实施安乐死。如有需要，可采集组织用于固定及进一步处理。</li>
</ol>
7. 代表性数据分析
注意：数据可通过显微镜配套软件、第三方软件或自定义程序进行可视化与分析。具体操作流程和所用工具取决于研究人员的具体需求。此处展示了一种用于量化迁移中中性粒细胞前缘和后缘膜曲率及局部面积变化的工作流程示例。
<ol>
	<li>使用 Imaris 或 Fiji 打开成像文件，以在四维（4D）中观察中性粒细胞的迁移情况，并评估实验质量。 
	注意：Imaris 和 Fiji 可读取多个显微镜品牌的成像格式。</li>
	<li>使用定制的 MATLAB 代码脚本，通过以下步骤处理数据。读取所选的成像文件。 Bio-Formats28 适用于 MATLAB 的软件包。使用 Otsu 算法对三维体数据的每一帧进行分割29 以鉴定单个细胞。</li>
	<li>基于最小位移准则追踪已识别的目标30.</li>
	<li>确定物体的主动轮廓和边界。
	<ol>
		<li>为每个时间帧中识别出的物体生成最大强度投影。</li>
		<li>应用 bwboundaries 使用 MATLAB 中的函数对步骤 7.2 中识别出的每个对象的最大投影生成 100 个边界点。</li>
		<li>使用动态轮廓算法优化已识别的边界点，以实现亚像素精度31 (图3A) 使用下载的 MATLAB 软件包中的函数 通过&#160;http://www.iacl.ece.jhu.edu/static/gvf/</li>
		<li>将第7.3步追踪确定的目标边界与目标轨迹索引叠加到原始图像的最大投影上，生成用于可视化和人工核查的二维叠加视频输出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在叠加的视频中，手动选择所有被识别为迁移细胞的物体，排除非细胞物体、相互接触的物体以及边界不完整的物体。将每个细胞轨迹的追踪索引、起始帧和结束帧记录在电子表格中，作为后续由 MATLAB 代码脚本执行步骤的输入数据。</li>
	<li>根据最小位移准则，逐帧追踪细胞边界点。使用 多区域 使用 MATLAB 中的函数计算两个连续时间帧中相邻边界点所围成区域的面积（图3C）。如果局部细胞边界向外移动，面积变化记为正值；如果局部细胞边界向内移动，面积变化记为负值。</li>
	<li>通过将每个边界点邻近的边界点（每侧5个，共11个）拟合为一个圆，测量每帧中每个边界点的局部膜曲率32 (图3B).</li>
	<li>使用以下方法生成明场图像 imagesc MATLAB 中的函数图3D，E以显示亚细胞特征随时间的变化，并关联到细胞的位置。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

尽管在细胞迁移和膜重塑领域已有数十年的研究进展，但极少有研究采用活体显微成像（IVM）来观察活体动物中的亚细胞结构。本方案中描述的操作步骤提供了一种强大的工具，可用于深入理解活体动物中中性粒细胞的迁移过程，特别是该过程中细胞质膜的重塑。该方法使得在生理条件下研究中性粒细胞迁移成为可能，同时充分考虑了组织微环境的内在复杂性。事实上，通过结合表达特定荧光标记的转基因小鼠品系、外源性组织标记、内源性荧光激发，以及通过二次谐波生成（SHG）或三次谐波生成（THG）产生的信号，多光子显微镜（MPM）能够实现对宿主组织内多种特征的可视化12,13。
在本实验过程中需要考虑的一个潜在问题是光损伤。尽管与共聚焦显微镜相比，多光子显微镜（MPM）在光漂白和光毒性方面通常更为安全，但在对活体组织成像时仍需格外谨慎34。光毒性可能严重影响实验结果，导致从微小的亮斑到较大范围组织损伤等成像伪影，或抑制/激活多种细胞内信号通路。为防止光毒性，应尽量降低激光功率，并设计适当的对照实验以确认生理状态得以维持（例如，测量血流、使用氧化应激探针）35,36。此外，在本特定实验（涉及皮肤）中，强烈推荐使用白化品系，因为深色毛发动物体内的黑色素对光毒性更为敏感36,37,38。
该实验方法的主要局限性包括所使用的显微镜系统以及中性粒细胞本身的特性。尽管与其它光学显微技术（如共聚焦显微镜、转盘显微镜）相比，多光子显微镜（MPM）显著提高了组织成像的深度，但在耳部组织中对亚细胞动态过程的观察仍仅限于组织最表层（80–100 µm）。这是由于致密的细胞外基质（ECM）层产生强烈的光散射，使得对更深层组织中的细胞迁移进行研究变得困难。另一个局限性在于中性粒细胞寿命极短，无法在体外长期培养以进行基因编辑操作。这一问题可通过构建基因敲除或携带特定突变的中性粒细胞小鼠模型来克服，但显然会增加研究的成本和周期。
本文所述方法虽然旨在研究膜动力学，但也可根据需要进行调整，用于探究中性粒细胞以及其他免疫细胞类型和迁移性细胞中的任何细胞生物学问题。通过低倍率活体显微成像（IVM）获取的细胞行为信息（例如迁移表型、细胞速度和方向性22），可与通过高内涵显微成像（ISMic）获得的关于细胞器重定位、蛋白质分泌、内吞作用、细胞核动态、钙信号动态、细胞骨架组织以及NETosis等机制信息相互补充和关联。结合药理学和/或遗传学干预手段，可凸显特定分子通路在目标过程中的作用，使该方法成为一种独特且极为强大的研究策略。

定向细胞迁移是在多种生理和病理过程中发生的关键事件，包括发育、免疫应答、组织修复以及肿瘤的发生、进展和扩散1,2。该过程依赖于细胞质膜上相应受体感知特定的胞外趋化信号，并将这些信号转导为复杂的胞内信号通路。这些通路继而通过一系列反应激活细胞迁移，包括细胞骨架的局部活化、膜运输与重塑以及细胞极化3。目前已有两种被充分表征的细胞迁移模式：间充质样迁移和变形虫样迁移4。间充质样迁移相对较慢（&#60;1 µm/min），依赖于细胞与细胞外基质（ECM）之间的强黏附，并需要金属蛋白酶介导的基质降解。相比之下，变形虫样迁移是免疫细胞快速响应炎症信号的特征，迁移速度更快（&#62;10 µm/min），利用弱黏附在细胞外基质中穿行。无论何种迁移模式，细胞迁移均需要细胞质膜持续发生重塑，从而在细胞前缘形成突起结构，并与细胞后端的膜回缩过程紧密协调1。
为了揭示这些亚细胞过程背后的分子机制，必须在适当的时间和空间分辨率下观察迁移细胞中膜的动力学变化。此外，由于膜的重塑过程受到迁移细胞周围组织微环境特性的重要影响，因此在活体动物的原生组织中直接成像这一过程至关重要。这一目标可通过活体显微成像技术（intravital microscopy, IVM）实现5。最早的IVM成像约在200年前完成，当时使用简单的透射照明显微镜观察了白细胞的外渗过程6，此后IVM主要应用于半透明的模式生物，例如斑马鱼（Zebrafish）和果蝇（Drosophila）7,8。在过去的二十年中，IVM已成功用于研究小鼠、大鼠以及猪等较大哺乳动物的细胞过程5,9。这一进展得益于两个关键因素：1）共聚焦显微镜和多光子（MP）显微镜技术的显著进步；2）基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）的发展，使得快速构建表达荧光标记蛋白和报告分子的多种动物模型成为可能。此外，通过其他外源性标记方法（如系统性引入染料标记血管系统10,11）以及激发内源性分子（例如通过二次谐波生成（Second Harmonic Generation, SHG）成像胶原纤维10,12，或通过三次谐波生成（Third Harmonic Generation, THG）成像神经纤维11,13），使得在肿瘤起始、细胞迁移和免疫应答等过程中对单个细胞及其微环境的可视化成为可能。最后，为减少心跳和呼吸引起运动伪影的技术不断改进，推动了活体亚细胞显微成像技术（intravital subcellular microscopy, ISMic）的发展，使研究人员能够在活体动物中以接近体外（in vitro）实验的分辨率直接观察和研究多种亚细胞事件14,15,16,17。ISMic的应用实例包括研究胞吐过程中的细胞骨架动力学14,15,16,17和胞吞过程中的细胞骨架动态重塑15，细胞迁移过程中细胞骨架的动态重构17,18，线粒体的定位与代谢活动19,20，以及大脑中的钙信号传导21。
本方案详细描述了利用ISMic技术在活体小鼠耳部皮肤中以亚细胞分辨率研究中性粒细胞迁移过程中细胞膜重塑的各个步骤和实验流程。该方法基于先前报道的方案22,23，并进行了优化，以实现更高的空间和时间分辨率。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>USA Scientific</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>Covidien</td><td>8881501400</td><td></td></tr><tr><td>27 G 针头</td><td>Kendall</td><td>827112</td><td></td></tr><tr><td>27 G 带翼输液套件</td><td>Terumo</td><td>SV*27EL</td><td></td></tr><tr><td>30x 物镜</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO30XS</td><td>1.05 NA，硅油浸没</td></tr><tr><td>40x 物镜</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO40XS</td><td>1.23 NA，硅油浸没</td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6 mL 注射器</td><td>Kendall</td><td>8881516937</td><td></td></tr><tr><td>乙酰丙嗪（10 mg/mL）</td><td>Vet one</td><td>13985-587-50</td><td></td></tr><tr><td>ACK 裂解缓冲液</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>天平</td><td>AND</td><td>EK-1200A</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td>图像可视化/分析软件</td></tr><tr><td>Fluoview 软件</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>采集软件</td></tr><tr><td>FVB 小鼠品系</td><td>Jackson</td><td>N/A</td><td>FVB 背景</td></tr><tr><td>气体麻醉系统</td><td>Patterson veterinary</td><td>07-8915712</td><td>Link 7 型号</td></tr><tr><td>绿色细胞示踪剂</td><td>Thermo</td><td>C2925</td><td>溶于细胞培养级 DMSO 中，配制成 1 mM 浓度（1000 倍）</td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>Nair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS（不含 Ca²⁺、Mg²⁺）</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M pH 7.3</td><td>Quality Biological</td><td>118-089-721</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1991</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11191-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>图像可视化/分析软件</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Vet one</td><td>13985-528-40</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮（100 mg/mL）</td><td>Vet one</td><td>13985-584-10</td><td></td></tr><tr><td>LyzM-cre x mT/mG</td><td>实验室自制</td><td>N/A</td><td>C57BL/6J 背景</td></tr><tr><td>手动显微操作器</td><td>WPI</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MatWorks</td><td>N/A</td><td>分析软件</td></tr><tr><td>mtomato 小鼠品系</td><td>实验室自制</td><td>N/A</td><td>mT/mG，FVB 背景</td></tr><tr><td>多光子激光器</td><td>Spectra Physics</td><td>Insight DS+</td><td></td></tr><tr><td>多光子显微镜</td><td>Olympus</td><td>MPE-RS</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 10 &amp;micro;L 注射器</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 33 G 针头</td><td>WPI</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>物镜加热器</td><td>Bioptechs</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>物镜加热控制器</td><td>Bioptechs</td><td>150803</td><td></td></tr><tr><td>眼科软膏</td><td>Major</td><td>NDC 0904-6488-38</td><td></td></tr><tr><td>氧气浓缩器</td><td>Caire</td><td>VisionAire 5</td><td></td></tr><tr><td>PBS（不含 Ca²⁺、Mg²⁺）</td><td>Quality Biological</td><td>114-058-131</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Quality Biological</td><td>114-055-101</td><td></td></tr><tr><td>载物台加热器</td><td>Okolab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>载物台加热控制器</td><td>Okolab</td><td>H401-T</td><td></td></tr><tr><td>手术胶带</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td>低致敏性</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD Ultra</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Parkland Scientific</td><td>A2789B</td><td></td></tr><tr><td>加热泵</td><td>Parkland Scientific</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪（100 mg/mL）</td><td>Vet one</td><td>13985-704-10</td><td></td></tr></tbody></table>

在生理条件下通过小鼠皮肤成像研究中性粒细胞迁移及亚细胞膜重塑

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

过去二十年中，免疫细胞在组织中的募集及其功能研究一直是一个非常活跃的领域。中性粒细胞是炎症发生时最早到达炎症部位并参与感染或组织损伤过程中先天免疫反应的免疫细胞之一。迄今为止，中性粒细胞迁移已通过多种方法成功实现可视化 体外 基于均匀刺激、琼脂糖下受限迁移或微流控通道的实验系统。然而，这些模型无法重现中性粒细胞所遇到的复杂微环境 体内基于多光子显微技术（MPM）的方法，如活体亚细胞显微成像（ISMic），为在生理条件下以亚细胞分辨率可视化并研究中性粒细胞动态提供了独特工具。特别是，活体麻醉小鼠的耳部因其易于接近且无需手术暴露，成为实时观察中性粒细胞间质迁移的理想实验部位。ISMic具备必要的光学分辨率、成像速度和深度，可实现对细胞乃至更为重要的亚细胞过程进行随时间变化的三维动态追踪（4D成像）。此外，结合表达特定荧光标记的转基因小鼠与外源性标记方法，可便捷地实现对间质微环境（如血管、常驻细胞、细胞外基质）的多模态成像。 通过 荧光探针、组织固有荧光以及二次/三次谐波生成信号。本方案描述了：1）中性粒细胞的制备以用于过继转移至小鼠耳部，2）实现最佳亚细胞成像的不同设置，3）在维持生理反应的同时最小化运动伪影的策略，4）利用ISMic观察中性粒细胞膜重塑的实例，以及5）迁移中性粒细胞膜重塑的定量分析工作流程 在体内

此处展示了两组不同的实验结果，以分别说明经典的活体显微成像（IVM）和提供细胞及亚细胞分辨率的活体显微成像技术（ISMic）。在第一个示例中，从中性粒细胞从野生型（WT）小鼠中分离纯化，用Cell Tracker Green标记细胞质，并注射到一种转基因小鼠体内，该小鼠表达靶向细胞膜的荧光蛋白（mTomato小鼠，也称为mT/mG）。33, 图1 和 视频 1 和视频 2）。该受体小鼠能够实现耳组织中血管、常驻细胞和毛囊等结构特征的可视化图1C 和 视频 1) 通过 基于IVM的方法（步骤6.8.1）。胶原纤维，显现 通过 SHG（在激发波长一半处检测到）在真皮层中形成复杂的网络结构，该区域注射了中性粒细胞。在毛囊（HF）边缘，可见一层上皮细胞（即角质形成细胞）。偶尔可观察到残留毛发造成的伪影，导致皮肤局部凹陷（H）。激光诱导的损伤因其在所有通道中均表现出强烈的自发荧光以及胶原排列结构的改变而易于识别。图1D）。在 视频 1，展示了从皮肤外层到内层的Z轴层扫图像及三维体积重建。延时成像显示中性粒细胞在耳部皮肤中进行取样，并与细胞外基质及宿主组织相互作用（视频 2）。以该分辨率成像并每30秒获取一次Z轴层扫图像，可实现细胞追踪及运动参数（如速度和方向性）的测量，但在该分辨率下对膜结构重塑进行精确而详细的分析仍具有挑战性。
在第二个示例中，对膜重塑进行了评估 通过 采用表达mGFP的中性粒细胞进行ISMic方法（步骤6.8.2），该细胞从L中纯化获得yzM-cre mT/mG 小鼠并注射到野生型动物中（图2A，实验流程图）。采用ISMic方案（视频 3 和静态图像在 图2B）以及在激光损伤后，迁移过程中可观察到细胞质膜的动态重塑，细胞前缘膜突起的形成以及细胞后端的回缩均清晰可见（图2 和 视频 3）。延时序列突出显示了 视频 3 揭示了细胞与细胞外基质（ECM）相互作用的复杂性。实际上，中性粒细胞在间质空间中迁移时，会沿着纤维或在纤维之间的空隙中移动。最后，针对每个时间点，定量分析了细胞前端和后端的曲率变化以及面积变化。基于所描述的细胞进行 图 2B 例如，通过基于细胞表面下方100个边界点识别的算法流程（见步骤7），分析了质膜的局部动态特性图 3A）。局部曲率的变化（图3B）以及质膜突起下方标出的区域（图3C) 针对每个边界点进行计算，并以随时间变化的显微图像（kymographs）形式报告图3D，E细胞的前端和后端均比侧面具有更高的曲率（图3D）；负面积变化（回缩，蓝色区域）在细胞后部比在前缘更为明显，而正面积变化（突出，红色区域）在前缘更为显著（图3E).
<img alt="小鼠活体显微镜、中性粒细胞标记、体内胶原纤维、实验示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：小鼠耳部皮肤中性粒细胞的活体显微成像（IVM）。（A）耳部组织在显微镜载物台上的设置示意图。（B）实验流程图。（C）注射了荧光标记中性粒细胞的mTomato小鼠耳部皮肤代表性图像，显示不同投影层面。毛囊（HF）、血管（BV）、表皮（E）、真皮（D）、基底细胞层（BCL）以及毛发伪影（皮肤表面残留毛发所致，H）。（D）无菌激光损伤后小鼠皮肤的代表性图像：蓝色通道（右）、绿色与红色通道（中）、合并图像（左）。图像左侧可见损伤区域，在绿色和红色通道中表现为强烈的自发荧光信号，同时通过胶原蛋白-I纤维出现空洞，表明细胞外基质（ECM）结构被破坏。在C和D中，绿色：中性粒细胞；红色：小鼠宿主组织；青色：胶原蛋白-I的二次谐波信号（SHG）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="中性粒细胞迁移过程；受体小鼠中GFP标记细胞的示意图和显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
图2：野生型小鼠耳部中表达mGFP的中性粒细胞迁移的时间推移图像。（A）实验流程图。（B）来自视频3的代表性静态图像。（C）同一细胞的体积渲染图，用于可视化细胞膜的三维结构。高膜动态区域以箭头标示（红色表示回缩，蓝色表示突出）。（D）渲染后细胞体积的放大及倾斜视角视图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞边界运动分析；曲率与面积变化图；显微成像与数据分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3ISMic 采集的膜动力学数据定量分析流程 (A细胞轮廓确定及两个连续帧之间 mGFP 中性粒细胞的边界点重分布（100 个边界点） 图2B. (B彩色边界表示针对每个边界点确定的局部膜曲率。C) 两个连续帧之间局部区域的变化（当前帧：蓝色，下一帧：红色）。绿色区域表示局部膜运动的追踪结果。黄色箭头指示膜位移的总体方向。D) 随时间变化的细胞边界曲率显微图像。纵轴表示边界点的索引，其中 1 和 100 代表根据细胞迁移方向确定的细胞后端。E局部区域变化的显微图像，反映细胞随时间推移的膜突出（红色）和膜回缩（蓝色）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
视频 1：使用体内显微镜（IVM）在 mTomato 小鼠耳朵中观察到绿色标记的中性粒细胞。 红色：mTomato 宿主小鼠组织；青色：胶原蛋白-I 二次谐波信号（SHG）；绿色：中性粒细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie1_Jove_final.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 2：中性粒细胞在 mTomato 小鼠耳部皮肤中迁移的活体显微成像（IVM）。 视频为图像序列的最大强度投影，成像持续约 27 分钟，帧速率为每秒 5 帧。红色：mTomato 标记的宿主小鼠组织；青色：I 型胶原二次谐波信号（SHG）；绿色：中性粒细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie2_Jove_final.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频3：野生型小鼠耳部中性粒细胞迁移过程中膜重塑的ISMic成像。 视频为约8分钟内以每秒10帧的速率采集的图像序列的最大强度投影。红色：mTomato标记的宿主小鼠组织；青色：I型胶原二次谐波信号（SHG）；绿色：mGFP标记的中性粒细胞；浅绿色：三维重建的中性粒细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie3_Jove_final.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

中性粒细胞的迁移依赖于质膜在趋化因子作用及其与细胞外微环境相互作用下发生的快速而持续的重塑。本文介绍了一种基于活体亚细胞显微镜的技术，用于研究注射至麻醉小鼠耳部的中性粒细胞中质膜重塑的动态过程。

过去二十年中，免疫细胞在组织中的募集与功能研究一直是一个非常活跃的领域。中性粒细胞是最早……

本方法描述了一种利用活体亚细胞显微镜技术在活体动物中研究中性粒细胞迁移过程中膜重塑的技术。该方案提供了一种独特的方法，可在物理条件下研究动物体内细胞迁移期间的膜动态，并揭示组织微环境的作用。该技术可针对不同细胞类型及迁移性细胞中的膜重塑、细胞骨架动态、器官重定位以及膜运输过程进行定制化研究。首先，将绿色荧光染料加入从中性粒细胞悬液中，该悬液由野生型小鼠分离并置于1.5毫升BSA包被的离心管中。在室温下，于旋转仪上轻柔振荡孵育30分钟。使用HBSS洗涤三次，每次在室温下以400 × g离心5分钟，然后将沉淀重悬于1毫升Hanks' Balanced Salt Solution中。将此悬浮液置于经BSA包被的试管中，在试管旋转仪中轻轻振荡，直至注射操作前。注射前，用生理盐水重悬细胞沉淀，使细胞密度达到每20微升含200万至500万个细胞。将麻醉后的动物转移至设定为37摄氏度的加热垫上，以维持其体温。测试完足爪回缩反射后，使用精细修剪器去除耳部毛发，以优化成像质量。将动物侧放，捏住耳缘，并用手术胶带将其展平固定在加热垫上。然后，用中性粒细胞悬液填充一支装有33号针头的注射器，并将其安装到显微操作仪上。轻柔地移动针头靠近耳部，缓慢刺入皮肤。将针头插入皮肤后，缓慢推动活塞，注入两到三微升细胞悬液。随后，仔细地在耳部另外两到三个不同区域重复注射操作，之后小心移除手术胶带，在监护下让动物恢复意识。注射完成后，让动物休息一小时再进行成像，以使组织和细胞从注射过程中恢复。确保显微镜已开启，并在将麻醉后的动物放置于显微镜载物台前，将载物台和物镜预热至37摄氏度。用玻璃盖玻片覆盖载物台上的孔洞。小心地将麻醉后的动物移至载物台上。若计划进行超过一小时的成像，需涂抹眼用软膏，并固定基于翼状输液器的灌注系统。在盖玻片中心滴加一滴生理盐水，将注射了中性粒细胞的耳朵置于其上。使用无菌棉签轻轻从盖玻片中心跨过耳片，轻柔压平耳朵以去除气泡。用木棒轻轻按住靠近动物头部一侧的耳朵，并用胶带固定。然后通过显微镜目镜找到感兴趣的区域，切换至多光子采集模式。将激光激发波长设置为 900 至 930 纳米，以同时采集绿色荧光染料、mTomato 和胶原蛋白-I 的信号。然后在探测器上设置适当的镜组和滤光片组合，以收集发射光。根据硬件配置确定最合适的设置。即使迁移的细胞可以以30秒到1分钟的时间间隔进行追踪，也应以更高的速度（至少小于10秒的时间间隔）对亚细胞事件进行成像。在经典的活体显微成像方法中，使用30倍物镜和Galvo扫描镜，以512×512像素的图像尺寸追踪细胞迁移并观察宿主小鼠组织，并通过电动载物台设置Z轴位移，步长为2 µm，从而每30秒对深度达30 µm的体积进行成像。在活体亚细胞显微成像方法中，使用40倍物镜和共振扫描镜，结合三次平均扫描，以更高放大倍数和分辨率对高度动态的膜重塑过程进行成像。同时，使用压电陶瓷驱动器设置Z轴位移，步长为1 µm，从而每4至5秒对深度达20 µm的体积进行成像。通过将高功率激发激光聚焦在20×20微米的狭小区域持续10秒，诱导无菌性激光损伤，以触发中性粒细胞迁移。根据所有通道中出现的强烈自发荧光信号以及胶原排列的相应改变，识别激光诱导的损伤。实验结束时保存数据，以供后续分析。通过活体显微成像技术，可在受体小鼠中可视化耳组织内的结构特征，例如血管、常驻细胞和毛囊。激光诱导的损伤因在所有通道中均能检测到强烈的自发荧光以及胶原排列的改变而易于观察。对皮肤三维结构的完整观察以及注射的中性粒细胞定位情况，可通过从外层到内层的皮肤Z轴层扫图像在三维体积渲染中呈现。延时成像显示中性粒细胞在耳部皮肤中进行取样，并与细胞外基质及宿主组织相互作用。利用活体亚细胞显微镜技术，可清晰观察到细胞迁移过程中血浆膜的动态重塑、前缘膜突起的形成以及细胞后端的回缩。延时序列揭示了细胞与细胞外基质相互作用的复杂性。通过基于细胞表面下方100个边界点识别的算法流程，分析了细胞质膜的局部动态变化。针对每个边界点，计算了质膜突起下方局部曲率和面积的变化，并以随时间变化的显微轨迹图（kymograph）形式呈现。细胞前端和后端的曲率均高于细胞侧面。细胞后部的负面积变化比前缘更为明显，而前缘的正面积变化则更为显著。成像完成后，可收集组织并进行固定和染色处理，以进一步评估目标分子并阐明相关机制。该用于成像膜动态变化的方案可根据不同细胞类型及各自微环境中的迁移细胞，调整应用于更广泛的细胞生物学问题研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

对小鼠皮肤中的中性粒细胞迁移进行成像，以研究生理条件下的亚细胞膜重塑

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白细胞归巢与迁移的非侵入性成像 体内

我们描述了一种用于在中性粒细胞趋化因子刺激下，中性粒细胞募集过程中动态测量中性粒细胞与内皮细胞相互作用的明场活体显微镜技术方案。...

通过活体视频显微镜追踪中性粒细胞在组织内的管腔内爬行、跨内皮迁移及趋化运动

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调控效应CD4+ T细胞在炎症部位间质迁移的机制尚不明确。我们提出一种非侵入性方法，用于可视化观察并操控 体外-引发的CD4 T细胞在炎症耳部真皮中的动态行为研究 原位.

成像炎症真皮中CD4 T细胞的间质迁移

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利用IL-1β启动子驱动的DsRed报告小鼠进行中性粒细胞活化的活体成像

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学习活体亚细胞显微成像技术，用于研究小鼠中性粒细胞在生理条件下迁移时的质膜动态重塑过程。该方法可实时观察细胞膜突起与收缩，揭示免疫细胞与组织微环境的相互作用机制。

在生理条件下通过小鼠皮肤成像研究中性粒细胞迁移及亚细胞膜重塑

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