Name: 质量敏感颗粒跟踪，用于表征膜相关的高分子动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 30 s
Description: 了解基于iSCAT的质量敏感颗粒跟踪技术，用于研究脂质膜上生物大分子的质量与扩散动力学。该方法无需标记即可实时定量分析膜结合寡聚态，适用于多种膜相关系统的研究。

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我们衷心感谢Philipp Kukura、Gavin Young以及Refeyn软件团队的支持，并感谢他们共享部分图像分析代码。感谢马克斯·普朗克生物化学研究所（MPIB）冷冻电镜核心设施提供商用Refeyn质量光度计的使用权限。F.S. 感谢Jürgen Plitzko和Wolfgang Baumeister提供的支持与资助。T.H. 和 P.S. 获得德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG）的资助——项目编号201269156——SFB 1032（A09）。N.H. 获得DFG返国研究资助 HU 2462/3-1 的支持。P.S. 感谢MaxSynBio研究网络提供的支持。 通过 德国联邦教育与研究部（BMBF）与马普学会的联合资助计划

1. 样品制备
<ol>
	<li>多层囊泡（MLVs）的制备
	<ol>
		<li>根据所需的脂质混合物和所需悬浮体积，计算氯仿溶解的脂质含量。 
		注意：建议在重悬（反应）缓冲液中脂质的最终囊泡浓度为 4 mg/mL。</li>
		<li>使用配备玻璃吸头的正向置换移液器，将计算好体积的脂质移入1.5 mL玻璃小瓶中。</li>
		<li>在氮气微弱气流下蒸发脂质溶剂，同时持续旋转离心管，以确保脂质均匀分布在玻璃管壁上。</li>
		<li>将小瓶置于持续的氮气气流下15分钟，以确保溶剂完全蒸发。</li>
		<li>在真空干燥器中通过真空干燥再持续一小时，以去除残留的氯仿。</li>
		<li>用所需的重悬（反应）缓冲液重新水合脂质混合物，并充分涡旋振荡悬浮液，直至瓶壁上的脂质膜完全溶解。 
		注意：反应缓冲液应确保蛋白质的活性与稳定性。本研究中使用的反应缓冲液包含 50 mM Tris-HCl（pH = 7.5）、150 mM KCl 和 5 mM MgCl₂。2注意，用于稀释脂质或蛋白质的任何缓冲液均需过滤，以去除干扰性的颗粒杂质（见步骤5）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小单层囊泡（SUVs）的制备
	<ol>
		<li>对于脂质重悬液的连续冻融循环（步骤1.1.6），在电热板上将500 mL水煮沸（置于烧杯中，温度控制在70 °C至99 °C之间），并准备一个盛有液氮的容器。</li>
		<li>将脂质重悬液在液氮中速冻。将冻存管转移至盛有热水的烧杯中，直至溶液完全解冻。重复此冻融循环8-10次，或直至原先浑浊的混合物变得澄清。 
		注意：使用适当的防护服和设备，例如护目镜、手套和镊子，以避免与液氮、冷冻的脂质小瓶或沸水发生直接接触。</li>
		<li>为获得单一分散的囊泡分布，组装脂质挤出器，并使用反应缓冲液检测其完整性，确保无泄漏。 
		注意：如果观察到泄漏，请仔细重新组装脂质挤出器，直至无缓冲液渗出。</li>
		<li>通过孔径为50 nm的核孔膜将脂质悬浮液挤出37次26穿膜次数应为奇数，以确保最终的SUV混合物穿过核孔膜，从而去除脂质聚集体或多层囊泡。所得挤出囊泡将用于后续支撑脂双层的制备（见步骤6和7）。 
		&#8203;注意：SUV 也可以通过超声处理再水化的脂质混合物来制备。然而，制备 通过 挤出法可提供更均一的单分散小单层囊泡（SUVs）分布，有利于在支撑脂双层形成过程中囊泡的破裂。挤出后的囊泡可在冰箱中最多保存3天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 显微镜载玻片的清洗
<ol>
	<li>将相同数量的显微镜载玻片（No. #1.5；厚度为 0.17 mm，尺寸分别为 24 mm × 60 mm 和 24 mm × 24 mm）均匀分布于聚四氟乙烯（PTFE）显微镜载片架中。</li>
	<li>将 PTFE 载片架转移至盛有超纯水的烧杯中，在室温下超声处理 15 分钟。 
	注意：根据烧杯的大小，需调整水量以完全浸没 PTFE 载片架。</li>
	<li>使用镊子将载片架从烧杯中取出，倒掉水后加入超纯异丙醇。将载片架放入盛有异丙醇的烧杯中，再次超声处理 15 分钟。 
	注意：根据烧杯的大小，需调整异丙醇的体积以完全浸没 PTFE 载片架。</li>
	<li>将异丙醇更换为超纯水，对盛有载片架的烧杯再次进行 15 分钟的超声处理。</li>
	<li>将 PTFE 载片架从烧杯中取出，并在持续的氮气或压缩空气气流下吹干载片架中的显微镜载玻片。 
	&#8203;注意：为确保盖玻片的充分清洁，操作时应佩戴手套，使用洁净的烧杯，并用石蜡膜覆盖每个烧杯。否则，残留的灰尘可能在 MSPT 测量过程中引起显著的背景波动。</li>
</ol>
3. 显微镜载玻片的亲水化处理
注意：为了获得均匀且流动的支撑脂双层，载玻片的亲水化处理至关重要，必须在流动池组装之前立即进行。
<ol>
	<li>将仅含有 24 mm × 60 mm 显微镜载玻片的聚四氟乙烯（PTFE）支架放入等离子清洗仪中，以氧气为工艺气体进行等离子清洗（本研究采用的参数：30% 功率，0.3 mbar 氧气压力，清洗 30 秒；等离子清洗仪的具体信息见材料表）。 
	&#8203;注意：为了获得具有流动性的脂膜，需针对不同仪器优化等离子清洗参数，如功率、氧气压力和清洗时间。建议使用荧光标记的脂质来验证膜的流动性，该流动性可通过光漂白后荧光恢复（FRAP）实验进行定量评估27。若参数未针对特定实验装置进行优化，膜的扩散能力可能因膜流动性降低而受损。</li>
</ol>
4. 流动室的组装
<ol>
	<li>在组装流动池之前，准备好以下组件：清洁的显微镜载玻片（24 mm × 24 mm）、亲水化处理的显微镜载玻片（24 mm × 60 mm）、铝箔、扁平纸板、手术刀和双面胶带。</li>
	<li>用铝箔包裹扁平纸板。</li>
	<li>将清洁的 24 mm × 24 mm 显微镜载玻片均匀地铺在铝箔上，各载玻片之间保持足够间距。</li>
	<li>在载玻片的上下边缘粘贴双面胶带条。</li>
	<li>使用手术刀将每张显微镜载玻片裁下，使其能够从铝箔上取下。最终每张载玻片的上下边缘应附有双面胶带条（见图1）。</li>
	<li>将带有两条双面胶带的 24 mm × 24 mm 载玻片粘附到亲水化处理的 24 mm × 60 mm 载玻片上，从而在较小和较大的载玻片之间形成流动通道。 
	&#8203;注意：为确保流动池清洁，操作过程中应始终佩戴手套，并确保工作台无尘。</li>
</ol>
5. 反应缓冲液的过滤
<ol>
	<li>使用0.45 µm醋酸纤维素膜对所有反应缓冲液进行无菌过滤，以确保在MSPT测量期间背景信号最小。 
	&#8203;注意：如果实验需要存在核苷酸（如ATP），需注意可能导致背景信号增加。建议仅使用能维持蛋白活性的最低必要用量。</li>
</ol>
6. 支持性脂质双层（SLB）的形成
注意：建议在质量光度计上进行支撑性脂质双层的形成，以直观确认囊泡成功铺展以及未融合囊泡的完全去除。
<ol>
	<li>将新制备的小型单层囊泡（SUVs）（详见步骤1）用所需的反应缓冲液稀释至终浓度为0.4 mg/mL。可选地，为促进囊泡破裂，可在囊泡悬液中加入2 mM CaCl2。 
	注意：二价阳离子可能导致某些脂质（如PiP2）发生聚集。对于含有此类脂质的混合物，应避免在重悬缓冲液中使用CaCl2或其他二价阳离子以促进囊泡破裂。若实验需要，可在支撑脂双层成功形成后添加二价阳离子。</li>
	<li>将50 µL囊泡悬液注入流动池（步骤4），并在室温下孵育2分钟。 
	注意：可通过一小块吸水纸将缓冲液、囊泡或蛋白溶液引入流动池。此外，也可使用机械泵系统进行操作。</li>
	<li>每次用200 µL反应缓冲液重复冲洗流动池至少三次，以去除未融合的囊泡。 
	&#8203;注意：必须彻底清除流动池中的未融合囊泡，以确保在进行MSPT测量时获得稳定的背景信号。</li>
</ol>
7. 标准曲线的生成
注意：为了将检测到的颗粒的对比度转换为分子质量，需要使用已知大小的蛋白质对其信号进行校准。建议调整标准蛋白质的大小范围，以覆盖目标体系预期的分子质量范围。
<ol>
	<li>含有半胱氨酸残基的标准蛋白的生物素化
	<ol>
		<li>根据制造商说明书计算与标准蛋白反应所需的马来酰亚胺-生物素（maleimide-biotin）的适当用量。</li>
		<li>将标准蛋白与确定体积的马来酰亚胺-生物素在室温下孵育1小时。</li>
		<li>为去除结合产物中未反应的马来酰亚胺-生物素，使用适合目标蛋白的凝胶过滤层析柱进行尺寸排阻层析。</li>
		<li>使用Bradford法测定蛋白浓度。 
		注意：如需保存标准蛋白以用于后续实验，应将蛋白分装成单次使用量，用液氮速冻后于-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>标准蛋白的测量以绘制校准曲线
	<ol>
		<li>在流动池中，使用含有0.01 mol% (v/v) 生物素化帽PE（Biotinyl Cap PE，1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-帽生物素）的0.4 mg/mL挤出小单层囊泡（SUVs）制备支撑脂双层（具体步骤详见步骤1和步骤6）。</li>
		<li>向流动池中的脂双层加入50 µL浓度为2.5 nM的二价链霉亲和素（divalent streptavidin），孵育10分钟。 
		注意：二价链霉亲和素的表达与纯化方法详见Howarth等人的研究28。也可使用四价链霉亲和素（tetravalent streptavidin），但使用二价链霉亲和素可减少生物素化脂质与连接有生物素基团的标准蛋白之间的可能反应化学计量比，从而有助于明确物种归属。</li>
		<li>用100 µL反应缓冲液洗去未结合的二价链霉亲和素。</li>
		<li>向流动池中的脂双层加入50 µL浓度为100 nM的生物素偶联标准蛋白，孵育2分钟。 
		注意：根据生物素化效率以及所使用的链霉亲和素为二价或四价，生物素偶联标准蛋白和链霉亲和素的最佳浓度可能有所不同。</li>
		<li>按照步骤8所述条件进行单分子跟踪测量（MSPT）。 
		警告：样品与校准标准品的成像条件必须完全一致。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 成像
<ol>
	<li>SLB 的形成与样品制备
	<ol>
		<li>如步骤 6 中更详细所述，将所需脂质混合物的小单层囊泡（SUVs）（25 µL）引入样品流动池，并形成支撑性脂双层。用 100 µL 反应缓冲液彻底清洗流动池（三次），以去除所有未融合的囊泡。</li>
		<li>向样品池中加入 50 µL 目标蛋白。 
		注意：由于 MSPT 是一种单颗粒方法，蛋白浓度必须保持在皮摩尔（pM）至纳摩尔（nM）范围内，以确保颗粒的无干扰检测与追踪。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>视频采集
	<ol>
		<li>在采集软件中设置所需的成像条件，例如视场大小（FOV）、帧率、曝光时间以及采集时间。 
		注意：以下设置已被证实适用于商用质量光度计上的 MSPT 实验（参见材料表）：视场大小为 128 像素 × 35 像素，帧率为 1 kHz，经后续 5 倍帧平均后实际约为每秒 200 帧，曝光时间为 0.95 ms。</li>
		<li>自动或手动调节焦距。如有必要，使用侧向控制将视场移动至膜分布均匀的位置。</li>
		<li>创建项目文件夹并开始录制视频。录制完成后，在采集软件弹出的对话框中指定文件名。视频将自动保存为 MP 文件至项目文件夹，供后续分析使用。 
		注意：应在不同的流动池中至少记录三个重复样本，以确保各膜的完整性及结果的可重复性。视频持续时间可预先设定，并根据实验类型而定。大多数情况下，建议采集时间为 5 至 7 分钟。 
		&#8203;警告：默认情况下，商用质量光度计的采集软件会在保存前对视频记录进行压缩，以减少存储空间。然而，为实现本方案中所述的自定义数据分析，必须关闭文件压缩功能。关闭文件压缩的具体操作详见仪器制造商的用户手册。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 数据分析
注意：数据分析流程附带两个交互式 Jupyter 笔记本（MSPT analysis.ipynb，Movie visualization.ipynb）。用于执行下述 MSPT 分析的 Jupyter 笔记本及相关自定义 Python 模块可在公开代码仓库中获取：https://github.com/MSPT-toolkit/MSPT-toolkit。有关下述分析的详细说明，请参阅通过上述链接访问的&#160;MSPT analysis.ipynb。
<ol>
	<li>视频处理
	<ol>
		<li>使用逐像素背景估计算法去除光的主导静态散射 图像处理.mp_reader 功能
		<ol>
			<li>应用背景去除时，选择该选项&#160;连续中位数&#160;参数 模式 并为滑动中位数窗口设置合适的长度（窗口长度) 记录在笔记本的 B.1 部分。可选择在去除背景后保存视频，用于后续的粒子检测与轨迹连接（通过设置参数&#160;保存已处理的视频文件 到 是). 
			注意：调整窗口大小（窗口长度根据膜上颗粒密度、预期扩散系数、采集帧率以及所需的处理速度，将值设置在101到2001之间。 
			警告：背景去除策略仅在膜蛋白分布不过于密集且粒子扩散速度足够快（即大多数时间每个像素未被粒子占据）时效果良好。否则，由于粒子无法与背景信号有效区分，其对比度会被系统性低估。可通过增大中值滤波窗口尺寸来补偿此问题，但会降低计算速度。需注意，若窗口尺寸设置过大，可能因样品漂移而对结果产生负面影响。因此，对处理后的视频进行视觉检查至关重要。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用该功能检测整段视频中颗粒及其各自的位置 particle_fitting.particle_fitter&#160;（参见笔记本部分 B.2）。
		<ol>
			<li>使用阈值参数调节粒子检测的灵敏度（阈值；参见笔记本部分 B.1），该部分通过图像二值化用于高亮候选斑点。可在另一个笔记本中检查不同阈值参数对斑点检测灵敏度的影响视频可视化.ipynb). 粒子检测结果将自动保存为电影文件子目录中的 CSV 文件。 
			注意：将阈值参数任意设得过低（例如，对于使用该质量光度计拍摄的视频，&#160;阈值参数低于0.0005时不建议使用，因为候选斑点将主要由虚假噪声构成，从而延长处理时间。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 Python 软件包将连续帧中的颗粒进行轨迹链接 trackpy&#160;(v.0.5.0)29. 
	注意：轨迹连接是在检测到斑点后实时进行的。因此，包含轨迹信息的额外 CSV 文件将存储在粒子检测 CSV 文件的子目录中。
	<ol>
		<li>使用参数去除点数过少的轨迹 最小轨迹长度 （参见笔记本部分 B.1），以实现对扩散系数的可靠测定。有关其他参数的详细说明，请参见 trackpy 功能，请参见 trackpy的 文档记录。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轨迹分析
	<ol>
		<li>在笔记本部分 C.1 中，注明帧率（帧率）以及像素大小（单位：nm）（像素大小），用于视频采集。创建一个包含由系统返回的轨迹信息的CSV文件列表 trackpy （参见步骤 9.2）与 trajectory_analysis.get_csv_files 功能（笔记本部分 C.2）。</li>
		<li>此外，指定一个用于存储拟合结果的HDF5容器的输出文件名（笔记本部分C.3）。分析所有轨迹的 trajectory_analysis.fit_trajectories 笔记本部分 C.4 中的函数，用于遍历 CSV 文件列表。该函数使用跳跃距离分布（JDD）30 均方位移（MSD）31 通过分析来估算每条轨迹的扩散系数。</li>
		<li>利用MSPT校准获得的对比度-质量关系（见第7节），将每条轨迹的中值对比度转换为其对应的质量。指定斜率（斜率）和 y 轴截距（偏移量校准曲线的斜率，该曲线描述了iSCAT对比度与分子质量之间的关系（函数 trajectory_analysis.apply_calibration；参见笔记本部分 C.5）。此函数会向每个数据框添加一列，包含轨迹的中位质量。</li>
		<li>使用该函数评估膜上表观颗粒密度 轨迹分析.膜密度，该操作会在数据框中作为附加列返回每帧中检测到的粒子数和现有轨迹的中位数密度值（参见笔记本部分 C.6）。 
		&#8203;注意：由于在检测和轨迹连接过程中会损失部分颗粒，实际颗粒密度可能更高。为获得可靠的颗粒密度及质量直方图结果，应目视检查具有代表性的视频截图，以确认单颗粒追踪的测量条件合理（参见步骤 9.1.1）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. 数据可视化
<ol>
	<li>利用二维核密度估计（KDE）展示质量与扩散系数之间的相关性，该方法基于 Python 软件包 fastkde&#160;(v.1.0.19;&#160;https://pypi.org/project/fastkde/) 实现。</li>
	<li>为生成该图，需指定包含 MSPT 结果的 HDF5 文件（参见步骤 9.3.2 及笔记本 D.1 节），并选择单个数据框（笔记本 D.2 节）或拼接后的数据框（笔记本 D.3 节）作为 plotting.generate_2D_KDE 函数（笔记本 D.4 节）的输入数据。 
	注意：每个绘图数据集应理想包含超过 1,000 条轨迹，以确保二维 KDE 结果的可靠性。</li>
</ol>

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</ol>

作者无利益冲突。

本方案扩展了质量光度法21——一种用于分析单个生物分子在玻璃表面吸附质量的技术，使其成为一种更为通用的工具，能够同时测量未标记膜相互作用生物分子的质量和扩散特性。该分析扩展通过采用一种针对分子侧向运动优化的改进型背景去除策略得以实现24,25。通常情况下，背景去除对于基于干涉散射（iSCAT）的方法至关重要，因为玻璃表面粗糙度产生的强散射是主要的分析障碍，而准确确定每个像素的局部背景对于颗粒质量与位置的定量分析必不可少。除了适配颗粒运动的图像分析外，后续的颗粒检测、轨迹连接以及数据分析共同完成了将质量光度法（MP）拓展为质量敏感型颗粒追踪（MSPT）的新方法。
通常，彻底清洁的玻璃盖玻片和洁净的实验环境是成功进行 MSPT 实验的关键要求。由于无需大分子标记，所获得的信号本质上是非选择性的。因此，样品的洁净程度以及正确的样品操作至关重要，以确保观测结果不会被误读。特别是当检测低分子量分子时，建议对不含蛋白质的膜进行对照测量，以评估背景信号的贡献（补充图 1）。除了进行对照测量外，还建议针对每个流动池遵循 图 2 所示的制备步骤。综合采取这些安全措施，可确保检测到的信号来源于目标生物分子，而非被污染的流动池、缓冲液或膜。
除了实验设计方面的注意事项外，在MSPT图像处理过程中也需格外谨慎。视频处理时，应仔细选择三个参数的取值，以确保结果准确：i) 用于背景去除的中值滤波窗口长度，ii) 粒子检测的阈值，以及 iii) 轨迹连接过程中的最大搜索半径。较大的中值窗口（i）通常有助于将扩散粒子与叠加的近似恒定背景分离开来。然而，若窗口过大，样品漂移最终会变得明显，从而降低背景估计的准确性。最佳参数设置在很大程度上取决于样品特性和测量条件。尽管如此，1,001 可作为一个稳健的起始值。阈值参数（ii）需根据样品中预期的最低分子质量进行调整。对于本研究中所用质量光度计采集的测量数据，不建议将阈值设为低于0.0005。若预期样品中含有高分子量组分，可选择较高的阈值以加快分析速度。轨迹连接中的搜索半径（iii）定义了在连续帧中搜索粒子位移位置的最大径向距离（以像素为单位）。该参数应根据样品中移动最快的粒子进行调整；如有需要，也可采用自适应搜索范围（参见trackpy的文档），以减少计算时间。特别是在项目初期，建议使用不同参数对视频进行重复分析，以验证所得结果的可靠性。
鉴于MSPT具有单分子特性，应避免在高膜颗粒密度下进行测量，因为这可能干扰对比度和质量的准确测定。已有研究表明，每平方微米少于一个颗粒的密度有利于MSPT测量24。另一个需要考虑的因素是样品中预期的扩散系数。尽管MSPT适用于较宽范围的扩散系数，但其可检测的扩散系数存在下限。当颗粒在中值滤波窗口的大部分时间内被局部限制在少数几个像素的区域内时，该颗粒会与静态背景合并。在本实验方案所用的成像条件下，不建议测量低于0.01 µm2/s的扩散系数。例如，在此扩散速度下，颗粒在中值窗口半长期间的均方位移约为4个像素，与点扩散函数（PSF）的范围相近。因此，静态背景估计值很可能包含来自颗粒本身的信号贡献，导致颗粒的表观对比度降低，直至最终接近噪声水平。然而，扩散系数在0.05至10 µm2/s范围内的大分子扩散过程可以被清晰分辨。
为了进一步拓展MSPT的应用范围，可以通过剔除暂时被颗粒占据的像素，或通过校正样品漂移以实现更大的中值滤波窗口，从而改进基于中值的背景算法。这两种方法都将缓解高颗粒密度和慢速扩散条件下的测量难题。随着新一代质量光度计的发展，质量检测灵敏度将进一步提高，有望检测到小于50 kDa的生物分子。因此，未来的MSPT实验将能够研究更广泛膜模拟体系（如缓冲双层膜和大分子系统）中的单分子动力学及与膜相关的相互作用。

过去，生物膜仅被视为抵御各种外界物理条件的屏障，而如今则被认为是具有功能的实体和催化平台1,2。由于脂质界面能够对膜相关大分子反应作出响应，实现信号的定位、放大和定向传导，因此在膜运输和信号级联等多种细胞过程中发挥着关键作用3,4,5。作为稳定复合物组装的成核位点，膜结合通常依赖于膜结合形式与胞质形式的大分子之间的动态平衡，因而具有瞬时性6,7。
尽管膜相关大分子反应在生物学中具有重要意义，但迄今为止，开发能够实时获取其组成、空间和时间异质性的方法仍具挑战性7,8。为了揭示其潜在的分子过程，两个实验方面至关重要：足够的时间分辨率和单粒子灵敏度。因此，诸如光漂白后荧光恢复（FRAP）这类集合平均技术，以及更为灵敏的荧光相关光谱（FCS），均存在局限性，因为它们在很大程度上将空间信息与时间信息分离开来9。因此，表征单个分子动力学的一个重要进展是结合高灵敏度显微镜的单粒子追踪（SPT）技术的出现。特别是，已有两种SPT方法在此方面被证明是有效的。首先，使用荧光染料作为标记物及相应的荧光检测系统，实现了纳米级定位精度和毫秒级时间分辨率10,11,12。其次，基于散射的检测方法利用金纳米颗粒，将定位精度和时间分辨率分别提升至亚纳米和微秒量级13,14,15,16。尽管这两种方法具有诸多优势，并对理解膜相关系统的机制做出了重要贡献17,18，但迄今为止，这两种技术仍存在局限：&#160;它们需要对标记目标分子进行标记，这可能会干扰其天然行为，并且&#160;无法检测膜相关粒子的分子组成19,20。
最近，一种基于新型干涉散射（iSCAT）的技术——质量光度法（mass photometry, MP）的出现，已成功克服了上述两项局限21,22,23。该技术可通过生物分子在玻璃界面上产生的iSCAT对比信号，测定其在溶液中的质量分布。然而，为了实现对在脂质膜上扩散的可移动分子的检测与表征，还需开发更为复杂精细的图像分析方法。目前这一挑战已得到成功解决，实现了对单个未标记生物分子在脂质界面上扩散过程的检测、追踪及其分子质量的测定24,25。该技术被称为动态质量光度法或质量敏感性粒子追踪（dynamic mass photometry 或 mass-sensitive particle tracking, MSPT），现可通过对被追踪实体分子质量的实时变化进行直接记录，评估复杂大分子间的相互作用，从而为膜相关分子动力学的机制性研究开辟了新的途径。
本文介绍了进行单分子跟踪（MSPT）所需的样本制备、成像及数据分析流程的详细方案。特别讨论了样本要求以及在测量和分析过程中可能出现的潜在问题。此外，通过多个代表性结果展示了该方法在分析膜相互作用大分子体系方面的独特潜力。

<table><tbody><tr><td>annexin V</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#SRP8026</td><td>示例性膜相互作用蛋白</td></tr><tr><td>Bio-Rad 蛋白检测试剂盒</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td>#5000006</td><td>用于测定蛋白储备液浓度的 Bradford 检测试剂盒</td></tr><tr><td>生物素标记牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#A8549</td><td>可作为 MSPT 实验中标准蛋白的示例性蛋白</td></tr><tr><td>霍乱毒素 B 亚基</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#SAE0069</td><td>示例性膜相互作用蛋白</td></tr><tr><td>盖玻片，#1.5，24 × 24 mm</td><td>Paul Marienfeld GmbH &amp; Co. KG</td><td>#0102062</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片，#1.5，24 × 60 mm</td><td>Paul Marienfeld GmbH &amp; Co. KG</td><td>#0102242</td><td></td></tr><tr><td>二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>#850375</td><td>脂质——需以挤出法制备的小型单层囊泡形式，用于支撑性脂双层的形成</td></tr><tr><td>二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-帽生物素（18:1 Biotinyl Cap PE）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>#870273</td><td>脂质——需以挤出法制备的小型单层囊泡形式，用于支撑性脂双层的形成</td></tr><tr><td>二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰甘油（DOPG）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>#840475</td><td>脂质——需以挤出法制备的小型单层囊泡形式，用于支撑性脂双层的形成</td></tr><tr><td>二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰-L-丝氨酸（DOPS）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>#840035</td><td>脂质——需以挤出法制备的小型单层囊泡形式，用于支撑性脂双层的形成</td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>tesa</td><td>#57912-00000-02</td><td>用于组装玻璃样品腔室</td></tr><tr><td>挤出器（Extruder）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>#610023</td><td>脂质挤出装置，用于获得单分散囊泡分布</td></tr><tr><td>EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A39261</td><td>可与巯基反应的生物素衍生物，可用于对标准蛋白进行生物素标记以用于 MSPT</td></tr><tr><td>纤维连接蛋白（生物素化）</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>#FNR03-A</td><td>可作为 MSPT 实验中标准蛋白的示例性蛋白</td></tr><tr><td>凝胶过滤高分子量校准试剂盒</td><td>Cytiva</td><td>#28403842</td><td>标准蛋白，例如醛缩酶，可经生物素化后作为 MSPT 的分子量标准</td></tr><tr><td>GM1 神经节苷脂（脑源，羊源钠盐）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>#860065</td><td>脂质——需以挤出法制备的小型单层囊泡形式，用于支撑性脂双层的形成</td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG（H+L）二抗，生物素标记</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>#31820</td><td>示例性蛋白，用于展示不同蛋白状态的存在</td></tr><tr><td>异丙醇，99.5%，光谱级</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#10003643</td><td></td></tr><tr><td>低自发荧光浸油</td><td>Olympus K.K.</td><td>#IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>pET21a-Streptavidin-Alive</td><td>Addgene</td><td>#20860</td><td>用于共表达并纯化二价链霉亲和素</td></tr><tr><td>pET21a-Streptavidin-Dead</td><td>Addgene</td><td>#20859</td><td>用于共表达并纯化二价链霉亲和素</td></tr><tr><td>Pierce 碱性磷酸酶，生物素化</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#29339</td><td>可作为 MSPT 实验中标准蛋白的示例性蛋白</td></tr><tr><td>Pierce 蛋白 A，生物素化</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#29989</td><td>可作为 MSPT 实验中标准蛋白的示例性蛋白</td></tr><tr><td>Refeyn Acquire</td><td>Refeyn Ltd.</td><td></td><td>Refeyn OneMP 的控制软件</td></tr><tr><td>Refeyn One</td><td>Refeyn Ltd.</td><td>-</td><td>质量光度计</td></tr><tr><td>无菌注射器滤器，0.45 &amp;micro;m 醋酸纤维素膜</td><td>VWR International</td><td>#514-0063</td><td>用于过滤目标缓冲液中的颗粒</td></tr><tr><td>四价链霉亲和素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#SNN1001</td><td>四价链霉亲和素，可提供多个生物素结合位点</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore 亲水性膜，0.05 &amp;micro;m 孔径，25 mm 圆形</td><td>Cytiva</td><td>#110603</td><td>在 MSPT 背景下，建议使用 50 nm 孔径的膜以形成支撑性脂双层</td></tr><tr><td>Zepto model 2 等离子清洗仪</td><td>Diener electronic GmbH</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

利用质量敏感型粒子追踪技术表征膜相关大分子动力学

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

大分子在脂质膜上及其与脂质膜之间的短寿命或瞬时相互作用——这一界面是众多重要生物反应发生的场所——本质上难以通过标准的生物物理方法进行检测。质量敏感型粒子追踪技术（MSPT）的引入，为对这类过程进行深入的定量表征迈出了重要一步。从技术上讲，这一进展得益于基于干涉散射显微技术（iSCAT）的质量光度法（MP）的发展。当背景去除策略被优化以揭示膜相关粒子的二维运动时，该技术能够实时分析生物膜上无标记大分子的扩散行为和分子质量。本文介绍了一种执行和分析膜相关体系质量敏感型粒子追踪的详细实验方案。在商用质量光度仪上进行的测量可达到毫秒级的时间分辨率，并且根据不同的MP系统，质量检测下限可低至50 kDa。为了展示MSPT在深入分析膜催化大分子动力学方面的普遍潜力，本文展示了典型蛋白质体系（如天然膜相互作用蛋白annexin V）的研究结果。

本方案描述了一种基于iSCAT的图像处理与单粒子追踪方法，可同时研究大分子与脂质膜相互作用时的分子质量及其扩散行为。文中提供了样品制备、质量-对比度转换、视频采集和后期处理的逐步操作指南，并给出了避免潜在问题的建议。

大分子在脂质膜上及其与脂质膜之间的短寿命或瞬时相互作用，是众多重要生物反应发生的界面……

利用质量敏感型粒子追踪技术，我们能够实时观察单个生物分子在脂质膜上的扩散行为，并对其动力学进行定量分析，且完全无需标记。由于无需标记，因此不会干扰生物分子的动态行为。该方法的另一优势在于其质量敏感性，使我们能够确定膜结合的寡聚状态。由于其多功能性，该方法可应用于任何膜相关系统。特别是可用于研究配体诱导的受体复合物的形成。首先，将等量的显微镜载玻片均匀分布在聚四氟乙烯（PTFE）支架中。将PTFE支架转移至烧杯中。加入超纯水，在室温下超声处理15分钟。使用镊子将支架转移至洁净的烧杯中，并加入超纯异丙醇。再次超声15分钟，然后将异丙醇替换为超纯水，对装有载片架的烧杯再次超声15分钟。从烧杯中取出载片架，用稳定的氮气或压缩空气流吹干架中的显微镜载玻片。将装有大型显微镜载玻片的干燥载片架放入等离子清洗仪中，并开启仪器。用铝箔纸包裹平整的纸板。将清洗过的 24 毫米 × 24 毫米显微镜载玻片均匀铺在铝箔表面，各载玻片之间保持适当间距。然后在载玻片的上下边缘贴上双面胶带条。用手术刀将每张显微镜载玻片从铝箔上切割下来，以便将其取下。每张载玻片的上下边缘应贴有双面胶条。然后将带有两条双面胶条的载玻片粘附到经亲水化处理的载玻片上。这将在较小和较大的显微镜载玻片之间形成流动通道。将新挤出的小型单层囊泡（SUVs）用所需的反应缓冲液稀释至终浓度为0.4毫克/毫升。可选地，为了促进囊泡破裂，可在囊泡悬浮液中加入2毫摩尔的氯化钙。将流动池安装到质量光度计的载物台上。向流动池中注入25微升囊泡悬浮液，孵育2分钟，然后每次用200微升反应缓冲液重复洗涤流动池，以去除未融合的囊泡。当脂质膜上无未融合的囊泡后，向样品池中加入50微升目标蛋白。接下来在采集软件中设置成像条件，例如视野大小、曝光时间、帧率和采集时间。自动调节焦距。如有必要，使用横向控制将视野移动至膜分布均匀的位置。创建一个项目文件夹并开始录制视频。录制完成后，根据采集软件弹出的对话框提示指定文件名。视频将自动保存至项目文件夹中，格式为MP文件，供后续分析使用。为了分析录制的视频，请启动 Jupyter notebook 应用程序。在出现的文件夹列表中，导航至存储 MSPT 分析. ipy notebook 文件的位置，然后点击该文件。在 Jupyter 笔记本中，代码以单元格形式组织，可逐行执行。单击单元格旁边的播放按钮，或选中单元格后按 Shift+Enter 键来执行该单元格。首先导入分析所需的所有软件包。执行下一个单元格以启动文件提示。选择一个包含一个或多个待分析 MP 视频文件的文件夹，然后点击“选择文件夹”。所选文件的列表将显示在该单元格下方。为了利用逐像素背景估计算法消除光的主导静态散射，请为参数 mode 选择连续中值（continuous median）选项，并为滑动中值窗口设置合适的长度。可选地，通过将 save_processed_movies 设为 True 来保存背景去除后的视频，以便用于后续的粒子检测和轨迹连接。确保根据处理设备设置 parallel 为 True 且 GPU 为 False（在 CPU 上处理），或相反设置（在 GPU 上处理）。在整个视频中识别并定位颗粒及其相应位置。通过阈值参数调整颗粒检测的灵敏度，该参数用于通过图像二值化突出候选斑点。在名为“视频可视化”的独立笔记本中，检查不同阈值参数对斑点检测灵敏度的影响。ipy notebook。将视频加载到帧查看器后，使用阈值滑块调整粒子检测的阈值，找到合适的设定值。返回另一个 notebook，使用 Python 软件包 trackpy，选择三个参数，以在连续帧中将粒子连接成轨迹。根据预期的最大扩散速度，设置粒子在连续帧之间的最大位移。选择粒子可消失并重新出现但仍被视为同一粒子的最大帧数。为更可靠地确定扩散系数，可使用参数 minimum_trajectory_length 去除轨迹点数过少的轨迹。通过执行该单元格来固定其中的所有参数。执行下一个单元格，以使用选定的参数分析所有选中的视频。每个处理步骤的进度条将显示在单元格下方。这可能需要一段时间，具体取决于视频长度、参数设置和硬件条件。在下一步中，软件将根据跳跃距离分布和均方位移分析，确定上一节中找到的轨迹的扩散系数。首先设置视频的 frame_rate（帧率）和 pixel_size（像素尺寸）。通过执行该单元格来修复它们，然后运行下一个单元格，并选择包含 trackpy 生成的所有 CSV 文件的父目录。找到的 CSV 文件列表将显示在该单元格下方。在下一个单元格中，为用于存储结果的 HDF5 容器选择一个名称并执行该操作。最后执行单元格 C.4 以进行扩散分析。在单元格 C.5 中输入对比度与质量校准曲线参数（即使用已知质量样品确定的斜率和截距），并执行该单元格，将所有粒子的对比度转换为分子质量。通过执行单元格 C.6 评估膜上粒子的表观密度，该步骤会返回每个帧中检测到的粒子数及存在轨迹的粒子数的中位数密度值，并作为附加列添加至数据框中。为了生成质量与扩散系数相关性的最终图表，请执行单元格 D.1 以加载文件提示，并指定包含 MSPT 结果的 HDF5 文件；然后通过执行单元格 D.2 选择单个视频的数据集进行绘图，或通过执行单元格 D.3 将多个视频的数据合并为一个单一的数据框。在本示例中，由于所有视频均为相同样本的重复实验，因此将数据集进行了合并。最后，执行单元格 D.4 以绘制二维核密度图。如果结果满意，请在单元格 D.5 中指定保存绘图的 PDF 文件位置并执行操作。此处展示了在支撑性脂双层形成过程中玻璃盖玻片表面粗糙度、完整的支撑性脂双层，以及在 SLB 上重建的典型蛋白质的代表性图像。所有四个示例均以原生模式显示，该模式可在测量过程中直接获取，同时也展示经过基于中值背景扣除处理后的比率图像。通过生物素-链霉亲和素-生物素复合物将已知质量的生物分子连接到支持性脂双层（SLB）上，可实现将对比度转化为分子质量的校准。作为一种示例性策略，可以使用生物素化的牛血清白蛋白、蛋白A、碱性磷酸酶和纤连蛋白变体，这些分子可结合到膜中含生物素的脂质所结合的链霉亲和素上。这些示例性大分子逐渐增强的对比度反映了相应生物素化标准品分子量的递增。通过将对比度直方图中的每个峰分配给标准蛋白质寡聚状态对应的分子量，可揭示对比度与分子量之间的线性关系，并可进一步用于未知大分子体系的分析。此处展示了四价链霉亲和素与生物素化的醛缩酶或与生物素修饰的山羊抗兔IgG抗体形成复合物后，其分子量和扩散系数的二维核密度估计结果。代表性图像显示了四价链霉亲和素与生物素修饰的醛缩酶或IgG形成的复合物的测定寡聚体质量与预期分子量之间的比较。利用MSPT技术，我们能够直接在脂质膜上追踪生物分子，确定其质量、运动方式以及相互作用。我确信该技术将彻底改变我们对膜上及与膜相关的生物过程的理解。

mass-sensitive-particle-tracking-to-characterize-membrane-associated

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

质量敏感颗粒跟踪，用于表征膜相关的高分子动力学

多目标追踪是一种自制算法，用于追踪活细胞质膜中单个标记的分子。该算法能够高效地在高密度条件下随时间检测、估算和追踪分子，为研究纳米尺度的膜动力学提供了一种用户友好且全面的工具。...

通过多靶点追踪技术（MTT）绘制质膜分子扩散图谱

本方案描述了如何利用全内反射荧光显微镜观察和追踪活细胞表面的单个受体，从而分析受体的侧向流动性、受体复合物的大小，以及可视化瞬时的受体-受体相互作用。该方案可拓展应用于其他膜蛋白。...

高分辨率时空分析受体动力学的单分子荧光显微技术

质膜蛋白和脂质的空间分布与时间动态是生物学中的热点问题。本文通过时空图像涨落分析来探讨这一问题，该方法在概念上可提供与单粒子追踪相同的物理量，但使用小分子标记物和常规显微镜装置即可实现。...

从快速荧光成像到商用显微镜下活细胞膜上的分子扩散规律研究

我们介绍一种制备云母支撑脂双层用于高分辨率显微镜观察的方法。云母在原子尺度上透明且平整，但由于操作困难而很少用于成像；我们的制备方法实现了云母片的均匀沉积，并减少了脂双层制备所需的材料用量。...

用于高分辨率光学显微成像的云母支撑脂双层的制备

本方案介绍了利用跨孔无溶剂脂双层在单个转运蛋白水平上分析膜蛋白介导的转运过程。该方法通过制备大量生产的纳米孔阵列芯片，结合高通量数据采集与分析，有望实现膜蛋白效应物筛选的未来应用。...

基于高通量纳米孔芯片系统在单蛋白分辨率下分析膜转运过程

本文介绍了一种用于单粒子追踪图像分析的实验方案，可对荧光显微镜检测到的单个粒子的扩散系数、运动类型和簇大小进行定量评估。...

用于荧光显微镜分析膜受体扩散与簇大小的图像处理方案

三维单分子定位显微技术被用于研究活体细菌细胞中荧光标记蛋白的空间位置和运动轨迹。本文所述的实验与数据分析方案基于整合的单分子轨迹，确定胞质蛋白的主要扩散行为。...

单分子追踪显微技术——用于确定细胞质分子扩散状态的工具

本文展示了利用传统暗场显微镜监测金纳米棒（AuNRs）在细胞膜上动态行为的方法。通过ImageJ和MATLAB检测单个AuNRs的位置和取向，并利用单颗粒追踪分析对其扩散状态进行表征。...

利用单纳米颗粒暗场显微技术可视化金纳米棒在细胞膜上的扩散动力学

利用成像衍生的均方位移（iMSD）分析来研究巨胞饮泡，以突出其在结构和动态特性方面随时间演变的内在特性。随后将巨胞饮泡与胰岛素分泌颗粒（ISGs）进行比较，后者作为具有时间不变平均结构/动态特性的亚细胞结构的参照。...

通过时空涨落光谱探测转运亚细胞纳米结构的结构与动态特性

本文介绍了一种利用单分子全内反射荧光（smTIRF）显微镜技术，在人工拥挤的脂质膜上对单个分子的结合、运动性和组装行为进行观测与分析的实验方案。...

单分子在聚合物拥挤的脂质膜上的扩散与组装

本文详细介绍了如何制备用于固相支撑脂双层中单蛋白追踪的样品。同时阐述了一种具有单分子灵敏度和高帧率的简易荧光显微镜。最后，我们概述了提取单蛋白轨迹的实验步骤。...

使用荧光显微镜追踪脂双层中的单个蛋白质

了解基于iSCAT的质量敏感颗粒跟踪技术，用于研究脂质膜上生物大分子的质量与扩散动力学。该方法无需标记即可实时定量分析膜结合寡聚态，适用于多种膜相关系统的研究。

利用质量敏感型粒子追踪技术表征膜相关大分子动力学

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