利用质量敏感型粒子追踪技术表征膜相关大分子动力学

利用质量敏感型粒子追踪技术，我们能够实时观察单个生物分子在脂质膜上的扩散行为，并对其动力学进行定量分析，且完全无需标记。由于无需标记，因此不会干扰生物分子的动态行为。该方法的另一优势在于其质量敏感性，使我们能够确定膜结合的寡聚状态。

由于其多功能性，该方法可应用于任何膜相关系统。特别是可用于研究配体诱导的受体复合物的形成。首先，将等量的显微镜载玻片均匀分布在聚四氟乙烯（PTFE）支架中。

将PTFE支架转移至烧杯中。加入超纯水，在室温下超声处理15分钟。使用镊子将支架转移至洁净的烧杯中，并加入超纯异丙醇。

再次超声15分钟，然后将异丙醇替换为超纯水，对装有载片架的烧杯再次超声15分钟。从烧杯中取出载片架，用稳定的氮气或压缩空气流吹干架中的显微镜载玻片。将装有大型显微镜载玻片的干燥载片架放入等离子清洗仪中，并开启仪器。

用铝箔纸包裹平整的纸板。将清洗过的 24 毫米 × 24 毫米显微镜载玻片均匀铺在铝箔表面，各载玻片之间保持适当间距。然后在载玻片的上下边缘贴上双面胶带条。

用手术刀将每张显微镜载玻片从铝箔上切割下来，以便将其取下。每张载玻片的上下边缘应贴有双面胶条。然后将带有两条双面胶条的载玻片粘附到经亲水化处理的载玻片上。

这将在较小和较大的显微镜载玻片之间形成流动通道。将新挤出的小型单层囊泡（SUVs）用所需的反应缓冲液稀释至终浓度为0.4毫克/毫升。可选地，为了促进囊泡破裂，可在囊泡悬浮液中加入2毫摩尔的氯化钙。

将流动池安装到质量光度计的载物台上。向流动池中注入25微升囊泡悬浮液，孵育2分钟，然后每次用200微升反应缓冲液重复洗涤流动池，以去除未融合的囊泡。当脂质膜上无未融合的囊泡后，向样品池中加入50微升目标蛋白。

接下来在采集软件中设置成像条件，例如视野大小、曝光时间、帧率和采集时间。自动调节焦距。如有必要，使用横向控制将视野移动至膜分布均匀的位置。

创建一个项目文件夹并开始录制视频。录制完成后，根据采集软件弹出的对话框提示指定文件名。视频将自动保存至项目文件夹中，格式为MP文件，供后续分析使用。

为了分析录制的视频，请启动 Jupyter notebook 应用程序。在出现的文件夹列表中，导航至存储 MSPT 分析. ipy notebook 文件的位置，然后点击该文件。

在 Jupyter 笔记本中，代码以单元格形式组织，可逐行执行。单击单元格旁边的播放按钮，或选中单元格后按 Shift+Enter 键来执行该单元格。首先导入分析所需的所有软件包。

执行下一个单元格以启动文件提示。选择一个包含一个或多个待分析 MP 视频文件的文件夹，然后点击“选择文件夹”。所选文件的列表将显示在该单元格下方。

为了利用逐像素背景估计算法消除光的主导静态散射，请为参数 mode 选择连续中值（continuous median）选项，并为滑动中值窗口设置合适的长度。可选地，通过将 save_processed_movies 设为 True 来保存背景去除后的视频，以便用于后续的粒子检测和轨迹连接。确保根据处理设备设置 parallel 为 True 且 GPU 为 False（在 CPU 上处理），或相反设置（在 GPU 上处理）。

在整个视频中识别并定位颗粒及其相应位置。通过阈值参数调整颗粒检测的灵敏度，该参数用于通过图像二值化突出候选斑点。在名为“视频可视化”的独立笔记本中，检查不同阈值参数对斑点检测灵敏度的影响。

ipy notebook。将视频加载到帧查看器后，使用阈值滑块调整粒子检测的阈值，找到合适的设定值。返回另一个 notebook，使用 Python 软件包 trackpy，选择三个参数，以在连续帧中将粒子连接成轨迹。

根据预期的最大扩散速度，设置粒子在连续帧之间的最大位移。选择粒子可消失并重新出现但仍被视为同一粒子的最大帧数。为更可靠地确定扩散系数，可使用参数 minimum_trajectory_length 去除轨迹点数过少的轨迹。

通过执行该单元格来固定其中的所有参数。执行下一个单元格，以使用选定的参数分析所有选中的视频。每个处理步骤的进度条将显示在单元格下方。

这可能需要一段时间，具体取决于视频长度、参数设置和硬件条件。在下一步中，软件将根据跳跃距离分布和均方位移分析，确定上一节中找到的轨迹的扩散系数。首先设置视频的 frame_rate（帧率）和 pixel_size（像素尺寸）。

通过执行该单元格来修复它们，然后运行下一个单元格，并选择包含 trackpy 生成的所有 CSV 文件的父目录。找到的 CSV 文件列表将显示在该单元格下方。在下一个单元格中，为用于存储结果的 HDF5 容器选择一个名称并执行该操作。

最后执行单元格 C.4 以进行扩散分析。在单元格 C.5 中输入对比度与质量校准曲线参数（即使用已知质量样品确定的斜率和截距），并执行该单元格，将所有粒子的对比度转换为分子质量。通过执行单元格 C.6 评估膜上粒子的表观密度，该步骤会返回每个帧中检测到的粒子数及存在轨迹的粒子数的中位数密度值，并作为附加列添加至数据框中。

为了生成质量与扩散系数相关性的最终图表，请执行单元格 D.1 以加载文件提示，并指定包含 MSPT 结果的 HDF5 文件；然后通过执行单元格 D.2 选择单个视频的数据集进行绘图，或通过执行单元格 D.3 将多个视频的数据合并为一个单一的数据框。在本示例中，由于所有视频均为相同样本的重复实验，因此将数据集进行了合并。最后，执行单元格 D.4 以绘制二维核密度图。

如果结果满意，请在单元格 D.5 中指定保存绘图的 PDF 文件位置并执行操作。此处展示了在支撑性脂双层形成过程中玻璃盖玻片表面粗糙度、完整的支撑性脂双层，以及在 SLB 上重建的典型蛋白质的代表性图像。所有四个示例均以原生模式显示，该模式可在测量过程中直接获取，同时也展示经过基于中值背景扣除处理后的比率图像。

通过生物素-链霉亲和素-生物素复合物将已知质量的生物分子连接到支持性脂双层（SLB）上，可实现将对比度转化为分子质量的校准。作为一种示例性策略，可以使用生物素化的牛血清白蛋白、蛋白A、碱性磷酸酶和纤连蛋白变体，这些分子可结合到膜中含生物素的脂质所结合的链霉亲和素上。这些示例性大分子逐渐增强的对比度反映了相应生物素化标准品分子量的递增。

通过将对比度直方图中的每个峰分配给标准蛋白质寡聚状态对应的分子量，可揭示对比度与分子量之间的线性关系，并可进一步用于未知大分子体系的分析。此处展示了四价链霉亲和素与生物素化的醛缩酶或与生物素修饰的山羊抗兔IgG抗体形成复合物后，其分子量和扩散系数的二维核密度估计结果。代表性图像显示了四价链霉亲和素与生物素修饰的醛缩酶或IgG形成的复合物的测定寡聚体质量与预期分子量之间的比较。

利用MSPT技术，我们能够直接在脂质膜上追踪生物分子，确定其质量、运动方式以及相互作用。我确信该技术将彻底改变我们对膜上及与膜相关的生物过程的理解。