脓毒症小鼠盲肠结扎穿刺模型中可靠生物标志物的评估
2022年12月9日
本方案介绍了在脓毒症小鼠模型中进行盲肠结扎穿刺（CLP）的操作细节。CLP是建立脓毒症动物模型最常用的实验技术之一。因此，为获得可靠的研究结果，需要采用标准化的CLP操作流程。
本研究的主要目的是利用盲肠结扎穿刺诱导脓毒症的小鼠模型，评估可靠的脓毒症血液生物标志物。盲肠结扎穿刺（Cecal ligation and puncture），简称 CLP，是一种具有临床相关性的脓毒症模型。CLP 是脓毒症研究中常用的模型。
瓜氨酸化组蛋白 H3（CitH3）来源于脓毒症诱导的中性粒细胞胞外诱捕网形成（NETosis）。我们之前的研究表明，CitH3 是脓毒症可靠的诊断生物标志物。选取雄性 C57BL/6 小鼠。
称量小鼠体重，并通过吸入1.5%异氟烷对小鼠进行麻醉。将小鼠固定在加热垫上。在腹部涂抹脱毛膏，停留时间不超过一分钟，随后去除脱毛膏及毛发。
准备适用于啮齿类动物手术的无菌外科器械。用碘对腹部皮肤消毒至少三次。用适当的无菌手术巾覆盖手术区域。
使用无菌手术剪沿腹白线在腹壁上做一个约两厘米的切口。用无菌镊子将盲肠从腹腔中识别并分离出来。用4-0丝线结扎盲肠近端75%的部位。
不要结扎肠系膜血管。需要注意的是，结扎盲肠的百分比不同，会导致脓毒症的严重程度不同。结扎25%引起轻度脓毒症，50%引起中度脓毒症，75%引起重度脓毒症。
使用21号针头在盲肠尾端与结扎点之间的中点处进行一次贯穿性穿刺，刺破盲肠。通过穿刺孔轻轻挤压盲肠，使粪便排出。需要注意的是，挤入腹腔的粪便量应保持一致，因为粪便量也决定了脓毒症的严重程度。
将盲肠及粪便轻柔地放回腹腔内。使用6-0丝线缝合腹肌层和皮肤层。用碘伏对切口进行消毒。
应在腹部左下象限注射酮洛芬，剂量为每千克体重5毫克，以避免损伤盲肠。将小鼠置于加热垫上直至完全恢复。小鼠饲养于温度可控的环境中，并可自由获取食物和水。
根据本研究设定的预定义终点，出现败血症相关症状的动物将通过过量二氧化碳实施安乐死。小鼠被随机分为假手术组、CLP组以及CLP联合Cl-amidine或YW3-56治疗组。假手术组小鼠接受除盲肠结扎和穿刺以外的所有CLP操作。
术后24小时采集外周血，通过离心制备血清。采用Western印迹法和自行开发的ELISA试剂盒测定CitH3浓度。如图2所示，假手术组未检测到CitH3。
CLP 术后 CitH3 水平升高，而 PAD 抑制可显著减弱该升高。根据我们的数据，我们得出结论：循环中的 CitH3 是脓毒症可靠的诊断生物标志物。
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概述
本方案介绍了在脓毒症小鼠模型中进行盲肠结扎穿刺（CLP）的操作细节。CLP是建立脓毒症动物模型最常用的技术之一，需要采用标准化的实验方案以获得可靠的研究结果。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 脓毒症研究
背景
- 盲肠结扎穿刺（CLP）是一种具有临床相关性的脓毒症模型。
- CLP 在脓毒症研究中被广泛使用。
- 可靠的生物标志物对于脓毒症的诊断至关重要。
- 瓜氨酸化组蛋白 H3（CitH3）与脓毒症诱导的中性粒细胞胞外诱捕网形成（NETosis）相关。
研究目的
- 利用小鼠模型评估脓毒症可靠的血液生物标志物。
- 建立标准化的盲肠结扎穿刺（CLP）实验方案，以确保研究的一致性。
- 探究瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3）在脓毒症中的诊断潜力。
使用的方法
- 选择雄性 C57BL/6 小鼠用于本研究。
- 通过盲肠结扎穿刺法诱导脓毒症。
- 检测诱导后血液生物标志物。
- 比较 CitH3 水平以评估诊断可靠性。
主要结果
- 证明CitH3作为一种可靠的诊断生物标志物。
- 标准化的CLP实验方案可获得一致的结果。
- 在模型中鉴定出脓毒症诱导的NETosis现象。
- 验证该小鼠模型适用于未来的脓毒症研究。
结论
- CLP 模型对研究脓毒症具有良好的效果。
- CitH3 可作为脓毒症诊断的潜在生物标志物。
- 标准化操作流程可提高研究的可靠性。
常见问题
行业应用价值
可靠的早期生物标志物对于降低脓毒症药物研发风险，并实现从临床前模型到临床研究的转化连续性至关重要。结合定量检测CitH3的盲肠结扎穿刺（CLP）小鼠模型，为脓毒症研究中的靶点验证和机制探究提供了标准化平台。该方法有助于在研发流程的关键转折点上提升预测可信度，并支持研发项目的优先筛选与决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 利用具有临床相关性的动物模型，对脓毒症病理生理学进行严格的假设验证。
- 通过定量检测CitH3作为NETosis的机制性生物标志物，支持靶点的功能验证。
- 有助于对候选靶点进行生物学去风险化及优先级排序，推动后续开发。
筛选与检测方法开发
- 提供一种可重复的系统，用于评估靶向脓毒症机制的候选治疗药物。
- 通过经验证的CitH3 ELISA和蛋白质印迹检测方法，实现生物标志物定量的标准化。
- 能够可靠地比较不同实验组间干预措施的效果。
转化与临床前研究
- 将脓毒症的临床前生物标志物检测结果与临床诊断需求相对应。
- 支持从动物模型研究结果向人类转化生物标志物策略的连续性。
- 通过建立稳健且与疾病相关的终点指标，降低转化风险。
流程与工作流整合
该模型和生物标志物工作流程连接了脓毒症研究中的早期发现、先导物识别和临床前验证。
- Discovery Biology： 可实现对脓毒症诱导的中性粒细胞胞外诱捕网（NETosis）的机制性假设验证和通路解析。
- 筛选： 提供定量的瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3）读数，用于标准化检测方法的开发和化合物评估。
- 分析： 提供可重复的生物标志物测量结果，用于比较干预措施的有效性和疾病严重程度。
- 转化研究： 促进临床前生物标志物数据与临床诊断策略的对接。
- 企业级复用： 建立可重复使用、标准化的平台，支持持续开展脓毒症研究和治疗评估。
运营与企业影响
- 科学价值：提高脓毒症靶点验证的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：增强不同研究团队和研究项目之间的可重复性与标准化水平。
- 战略价值：通过实现早期基于生物标志物的分诊，改善决策中的“推进/终止”判断，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：支持根据风险调整对脓毒症项目进行优先排序和推进。
实施注意事项
- 需要具备动物手术、生物标志物检测方法开发和定量分析方面的专业知识。
- 需要获得经过验证的ELISA试剂盒、蛋白质印迹实验设备以及标准化的动物饲养设施。
- 要求不同研究团队在盲肠结扎穿刺（CLP）操作参数和生物标志物检测流程方面进行严格统一的标准化。
- 若将该方法应用于其他疾病模型或物种，可能需要对实验方案进行优化和验证。
- 局限性包括因手术技术差异导致的模型变异性，以及对一致终点判断标准的需求。
