Name: 用于泪腺干细胞的三维无血清培养系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 学习使用无血清三维培养系统分离和培养泪腺干细胞，实现长期扩增及向腺泡和导管样细胞分化。该方法为泪腺修复和再生医学研究提供重要模型。

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本工作得到了国家自然科学基金（编号：31871413）以及广东省科学技术计划项目（2017B020230002 和 2016B030231001）的资助。我们衷心感谢在研究过程中给予我们帮助的研究人员，以及动物中心工作人员在动物饲养方面提供的支持。

<ol><li>Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+injection+of+interleukin-1+induces+reversible+aqueous+tear+deficiency%2C+lacrimal+gland+inflammation%2C+and+acinar+and+ductal+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation.</a> Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).</li>
<li>Gromova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+repair+using+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland repair using progenitor cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).</li>
<li>Buzhor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapy+approaches%3A+the+hope+for+incurable+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases.</a> Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).</li>
<li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PLoS One. 7 (1), 29458(2012).</li>
<li>You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+propagation+of+mesenchymal+stem+cells+from+the+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).</li>
<li>Ackermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+investigation+of+presumptive+murine+lacrimal+gland+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Lugli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin+1+and+noggin+facilitate+expansion+of+resident+stem+cells+from+non-damaged+gallbladders%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders.</a> EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1), 299-312 (2015).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1), 324-338 (2015).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%2B%28ve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Linnemann, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+regenerative+potential+in+primary+human+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells.</a> Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).</li>
<li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vitro+expansion+of+salivary+gland+stem+cells+driven+by+Wnt+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).</li>
<li>Xiao, S., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+long-term+serum-free+culture+for+lacrimal+gland+stem+cells+aiming+at+lacrimal+gland+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20(2020).</li>
<li>Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+progenitor+cells+in+uninjured%2C+adult+rat+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).</li>
<li>Mishima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+side+population+cells+restores+the+function+of+damaged+exocrine+glands+through+clusterin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin.</a> Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).</li>
<li>Aluri, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+improves+tear+production+in+a+mouse+model+of+sj%C3%B6gren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome.</a> Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).</li>
<li>Dietrich, J., Schrader, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+lacrimal+gland+regeneration%3A+current+concepts+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches.</a> Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+growing+organoids+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: growing organoids from stem cells.</a> Cell. 161 (7), 1700(2015).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+matrix+%28BME%29+has+multiple+uses+with+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争利益。

已有成熟的方法用于分离和纯化 体外 用于泪腺干细胞培养及泪腺损伤修复的泪腺干细胞培养。Shatos 等17 和 Ackermann等6 成功通过二维培养方法分别对大鼠和小鼠的泪腺干细胞进行了培养与传代，使得利用泪腺干细胞移植治疗干燥性角结膜炎（ADDED）成为可能。干细胞相关研究18 和间充质干细胞19,20 二维培养的LG细胞显示，移植这些细胞可在一定程度上缓解ADDED症状。通过荧光激活细胞分选，Gromova等2 从表达LG前体细胞标志物的小鼠LG中筛选出干细胞，并将其分化为导管和腺泡 体外成功实现了成体干细胞向功能性睑板腺细胞的分化。研究还表明，在小鼠模型中移植足量的干细胞可缓解干燥性角结膜炎（ADDED）症状。
<p class="jove_c...

泪腺干细胞（LGSCs）维持泪腺（LG）细胞的更新，并是腺泡细胞和导管细胞的来源。因此，LGSC移植被视为治疗严重炎症性损伤和水液缺乏型干眼症（ADDED）的一种替代方法1,2,3已采用多种培养方法来富集低级别浆液性癌细胞（LGSCs）。Tiwari 等人. 采用胶原蛋白I和基质凝胶并补充多种生长因子分离并培养原代泪腺细胞；然而，泪腺细胞无法实现连续传代培养4采用二维（2D）培养方法，You 等人分离获得了小鼠泪腺来源的干细胞。5 以及 Ackermann 等人.6，发现表达干细胞/祖细胞标志基因， Oct4, Sox2, Nanog，以及 nestin，且可进行传代培养。然而，目前尚无明确证据表明这些细胞能够分化为腺泡细胞或导管细胞，也缺乏移植实验以验证其分化潜能 体内.
最近，c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34-/CD45- 通过流式细胞术从小鼠LG中分离出细胞，发现其表达LG前体细胞标志物（如Pax6和Runx1），并可分化为导管和腺泡 体外在患有ADDED的小鼠中，通过原位注射这些细胞可修复受损的泪腺并恢复其分泌功能2然而，通过该方法分离得到的干细胞数量较少，且目前尚无适合的培养条件用于扩增分离出的LGSCs。综上所述，需要建立一种合适的培养体系，以有效分离和培养成体LGSCs，并实现其稳定、持续的扩增，从而推动LGSCs在治疗ADDED中的研究。
源自干细胞或多能干细胞的类器官是一类在组织学上与相应器官相似且能够自我更新的细胞群。2009年Sato等人成功培养出小鼠肠道类器官7后，基于Sato的培养体系，相继实现了其他器官类器官的培养，如胆囊8、肝脏9、胰腺10、胃11、乳腺12、肺13、前列腺14和唾液腺15。由于在类器官培养中细胞分化前成体干细胞比例较高，三维（3D）类器官培养方法被认为是分离和培养泪腺成体干细胞的最佳方案。
本研究通过优化三维无血清培养方法，建立了成年小鼠泪腺干细胞（LGSC）培养体系。结果证明，源自正常小鼠和ADDED小鼠的LGSC均表现出稳定的自我更新和增殖能力。将LGSC移植至ADDED小鼠的泪腺后，细胞定植于受损泪腺并改善了泪液分泌。此外，从ROSA26小鼠中分离出表达红色荧光的LGSCmT/mG 小鼠和培养细胞。本研究为低级别浆液性癌（LGSC）的富集提供了可靠的参考依据 体外 以及LGSC自体移植在ADDED治疗中的临床应用。

<table><tbody><tr><td>&lt;u&gt;&lt;em&gt;动物（小鼠）&lt;/em&gt;&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balb/c</td><td>南京大学模式动物研究中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57 BL/6J</td><td>中山大学实验动物中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOD/ShiLtJ</td><td>南京大学模式动物研究中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSA26&lt;sup&gt;mT/mG&lt;/sup&gt;</td><td>南京大学模式动物研究中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;u&gt;&lt;em&gt;仪器设备&lt;/em&gt;&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分析天平</td><td>赛多利斯</td><td></td><td></td></tr><tr><td>自动脱水机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>BLAU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞计数仪</td><td>CountStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 恒温培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECL 凝胶成像系统</td><td>GE 医疗</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴电热器</td><td>Yiheng Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电泳装置</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光定量PCR仪</td><td>罗氏</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻组织切片机</td><td>Lecia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水平离心机</td><td>CENCE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>尼康</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>激光层扫显微图像</td><td>卡尔·蔡司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>液氮容器</td><td>赛默飞世尔科技（Thermo）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低温高速离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微波炉</td><td>松下</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 紫外分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>测定RNA浓度</td><td></td></tr><tr><td>石蜡切片机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR扩增仪</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH值测试仪</td><td>赛多利斯</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &amp;deg;C 冰箱</td><td>Haier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>恒温培养振荡器</td><td>ZHICHENG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织石蜡包埋仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;-80&amp;deg;C 超低温冰箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;-20&amp;deg;C 超低温冰箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超纯水净化系统</td><td>ELGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;u&gt;&lt;em&gt;试剂&lt;/em&gt;&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;动物实验&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCG</td><td>Sigma</td><td>9002-61-3</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>14158-65-7</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Sigma</td><td>57-33-0</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 I</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>BD</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D0697</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500895</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050087</td><td></td></tr><tr><td>人成纤维细胞生长因子10</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel（基质胶）</td><td>BD</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>小鼠Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 Wnt3A</td><td>PeproTech</td><td>315-20</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin 1</td><td>PeproTech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂（TI）</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td>源自 &lt;em&gt;大豆&lt;/em&gt;；对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和纤溶酶的抑制作用较弱。1 mg 可抑制 1.0–3.0 mg 胰蛋白酶。</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;T4799</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;HE染色 &amp;amp; 免疫染色&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-21202</td><td>使用稀释度：IHC 2 &amp;mu;g/mL,（免疫荧光） 0.2 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗兔 IgG</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-21206</td><td>使用稀释度：（IHC） 2 &amp;mu;g/mL,（免疫荧光） 2 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 驴抗小鼠 IgG</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-10037</td><td>使用稀释度：（IHC） 2 &amp;mu;g/mL,（免疫荧光） 2 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 驴抗兔IgG</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-10042</td><td>使用稀释度：（IHC） 2 &amp;mu;g/mL,（免疫荧光） 4 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>抗AQP5兔抗体</td><td>Abcam</td><td>ab104751</td><td>使用稀释度：（IHC） 1 &amp;mu;g/mL,（免疫荧光） 0.1 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>抗E-钙黏蛋白大鼠抗体</td><td>Abcam</td><td>ab11512</td><td>使用稀释度：（免疫荧光）&amp;nbsp; 5 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>兔抗角蛋白14抗体</td><td>Abcam</td><td>ab181595</td><td>使用稀释度：（IHC） 1 &amp;mu;g/mL,（免疫荧光） 2 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>兔抗 Ki67 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>使用稀释度：（IHC） 1 &amp;mu;g/mL,（免疫荧光） 1 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>抗mCherry小鼠抗体</td><td>Abcam</td><td>ab125096</td><td>使用稀释度：（IHC） 2 &amp;mu;g/mL,（免疫荧光） 2 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>抗mCherry兔抗体</td><td>Abcam</td><td>ab167453</td><td>使用稀释度：（免疫荧光）&amp;nbsp; 2 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501702-0500</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sangon Biotech</td><td>201-069-1</td><td></td></tr><tr><td>DAB试剂盒（20倍浓缩）</td><td>CWBIO</td><td>CW0125</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>伊红</td><td>BASO</td><td>68115</td><td></td></tr><tr><td>荧光封片剂</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501912-0500</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>使用稀释度： 2 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td>使用稀释度： 2 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>苏木精</td><td>BASO</td><td>517-28-2</td><td></td></tr><tr><td>Histogel（包埋用凝胶）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>HG-400-012</td><td></td></tr><tr><td>30% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>广州化学</td><td>KD10</td><td></td></tr><tr><td>30% 过氧化氢溶液</td><td>广州化学</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>广州化学</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501293-0500</td><td></td></tr><tr><td>中性树胶</td><td>上海易阳</td><td>YY-中性树胶</td><td></td></tr><tr><td>非免疫山羊血清</td><td>BOSTER</td><td>AR0009</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Sangon Biotech</td><td>A601891-0500</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>DAMAO</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>广州化学</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠三水合物</td><td>Sangon Biotech</td><td>200-675-3</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>广州化学</td><td>IB11-AR-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.T.C. 包埋剂</td><td>SAKURA</td><td>SAKURA.4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>丁国</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>广州化学</td><td>128686-03-3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RT-PCR &amp;amp; qRT-PCR&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>酒精</td><td>广州化学</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>广州化学</td><td>865-49-6</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Sangon Biotech</td><td>214-984-6</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>广州化学</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td><td>罗氏</td><td>488735200H</td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td><td>TOYOBO</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA聚合酶</td><td>TAKARA</td><td>R10T1</td><td></td></tr><tr><td>Goldview（核酸染料）</td><td>BioSharp</td><td>BS357A</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Magen</td><td>R4801-02</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;载体构建 &amp;amp; 细胞转染&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>氧化</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma</td><td>56-75-7</td><td></td></tr><tr><td>无内毒素质粒提取试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A36227</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Sigma</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Lipo3000 质粒转染试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>LR反应试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11791019</td><td></td></tr><tr><td>质粒提取试剂盒</td><td>TIANGEN</td><td>DP103</td><td></td></tr><tr><td>Trans5&amp;alpha; 化学感受态细胞</td><td>转基因</td><td>CD201-01</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>氧化</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>氧化</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;引物与序列&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;引物&lt;/strong&gt;AQP5&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;序列&lt;/strong&gt;:&lt;br/&gt; F：CATGAACCCAGCCCGATCTT&lt;br/&gt; R：CTTCTGCTCCCATCCCATCC</td><td>合成生物技术</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;引物&lt;/strong&gt;: &amp;beta;-肌动蛋白&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;序列&lt;/strong&gt;:&lt;br/&gt; F：AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT&lt;br/&gt; R：AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT</td><td>合成生物技术</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;引物&lt;/strong&gt;Epcam&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;序列&lt;/strong&gt;:&lt;br/&gt; F：CATTTGCTCCAAACTGGCGT&lt;br/&gt; R：TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG</td><td>合成生物技术</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;引物&lt;/strong&gt;Krt5&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;序列&lt;/strong&gt;:&lt;br/&gt; F：AGCAATGGCGTTCTGGAGG&lt;br/&gt; R：GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC</td><td>合成生物技术</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;引物&lt;/strong&gt;Krt14&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;序列&lt;/strong&gt;:&lt;br/&gt; F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA&lt;br/&gt; R：GCCACCTCCTCGTGGTTC</td><td>合成生物技术</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;引物&lt;/strong&gt;Krt19&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;序列&lt;/strong&gt;:&lt;br/&gt; F：TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG&lt;br/&gt; R：TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT</td><td>合成生物技术</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;引物&lt;/strong&gt;Ltf&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;序列&lt;/strong&gt;:&lt;br/&gt; F：CACATGCTGTCGTATCCCGA&lt;br/&gt; R：CGATGCCCTGATGGACGA</td><td>合成生物技术</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;引物&lt;/strong&gt;Nestin&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;序列&lt;/strong&gt;:&lt;br/&gt; F：GGGGCTACAGGAGTGGAAAC&lt;br/&gt; R：GACCTCTAGGGTTCCCGTCT</td><td>合成生物技术</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;引物&lt;/strong&gt;P63&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;序列&lt;/strong&gt;:&lt;br/&gt; F：TCCTATCACGGGAAGGCAGA&lt;br/&gt; R：GTACCATCGCCGTTCTTTGC</td><td>合成生物技术</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;u&gt;&lt;em&gt;载体&lt;/em&gt;&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLX302 慢病毒空载载体</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pENRTY-mCherry</td><td>中山大学秦晓峰实验室</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

三维无血清泪腺干细胞培养系统

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

基于泪腺干细胞的治疗是泪腺疾病的一种有前景的策略。然而，目前缺乏一种可靠且无血清的培养方法来获得足够数量的泪腺干细胞（LGSCs），这成为进一步研究和应用的障碍。本文展示了已建立完善的成年小鼠泪腺干细胞三维（3D）、无血清培养方法。该方法中的泪腺干细胞可实现连续传代，并可被诱导分化为腺泡样或导管样细胞。
对于泪腺干细胞（LGSC）原代培养，取6至8周龄小鼠的泪腺（LGs），用中性蛋白酶（dispase）、I型胶原酶（collagenase I）和胰蛋白酶-EDTA进行消化。将总计1 × 104个单细胞接种至24孔板的每孔中，每孔含有80 µL基质凝胶-泪腺干细胞培养基（LGSCM）混合物，该孔预先包被有20 µL基质凝胶-LGSCM混合物。在37 °C孵育20分钟后，混合物凝固，随后加入600 µL LGSCM培养基。
对于LGSC的维持培养，将已培养7天的LGSCs用dispase和胰蛋白酶-EDTA消化为单细胞。单细胞按照LGSC原代培养的方法进行接种和培养。LGSC可连续传代超过40次，并持续表达干细胞/祖细胞标志物Krt14、Krt5、P63和nestin。在LGSCM培养基中培养的LGSC具有自我更新能力，可分化为腺泡样或导管样细胞 体外 和 体内.

建立三维无血清培养体系 
本研究开发了含有EGF、Wnt3A、FGF10和Y-27632的培养基用于小鼠泪腺干细胞（LGSCs）的培养，并通过三维培养方法成功分离和培养了LGSCs（图1A）。利用该方法，已成功建立了来自C57BL/6小鼠、NOD/ShiLtJ小鼠、BALB/c小鼠以及ROSA26mT/mG小鼠的LGSCs的三维无血清培养体系16。对于雄性小鼠，通过解离两只泪腺可获得1.5–2 × 106个细胞。在培养开始时接种1 × 104个泪腺细胞，经过一周培养后可形成30–60个类球体。此外，采用该方法培养的细胞表达Epcam、Krt5、Krt14、P63、nestin及其他干细胞标志物16，表明所获得的细胞具有LGSCs的特性。培养7天后形成的全部类球体均表达Krt14和Ki67（图1B），表明LGSCs具有自我...

成年泪腺（LG）干细胞的三维无血清培养方法已较为成熟，可用于诱导LG类器官形成，并分化为腺泡样或导管样细胞。

基于泪腺干细胞的治疗是泪腺疾病的一种有前景的策略。然而，目前缺乏一种可靠的无血清培养方法……

本方案提供了一种有效富集泪腺干细胞的策略，用于泪腺的再生与重建。泪腺干细胞具有长期扩增能力及分化潜能。该技术的主要优势在于泪腺干细胞培养基为无血清培养基，对泪腺修复具有重要价值。首先获取一只安乐死的6至8周龄雄性BALB/c小鼠，剪开耳后皮肤以暴露泪腺及其周围的结缔组织。用镊子进行钝性分离，剥离结缔组织，取出泪腺。将泪腺置于直径六厘米的培养皿中，加入四毫升75%乙醇浸泡10秒，随后立即用10毫摩尔PBS溶液冲洗两次。将泪腺切成约1立方毫米大小的小块。将它们转移至无菌的15毫升离心管中，加入500微升浓度为25单位/毫升的dispase和500微升0.1% I型胶原酶，在37摄氏度下处理1小时。用1毫升0.05%胰蛋白酶EDTA在37摄氏度下处理泪腺组织碎片10分钟，并通过反复吹打将组织碎片解离为单细胞。将细胞悬液经70微米滤网过滤，收集滤液至无菌的15毫升离心管中，以150 × g离心5分钟。离心后，弃去上清液，加入10毫升10毫摩尔的PBS溶液洗涤细胞沉淀，将悬浮液在150 × g条件下离心5分钟。重复洗涤细胞沉淀一次。然后，弃去上清液，加入1毫升1:1比例的Dulbecco改良Eagle培养基与Ham's F-12培养基，重悬细胞沉淀。在24孔板的孔中央加入20微升基质凝胶泪腺干细胞培养基基质。用移液枪头将其铺展成直径约6至8毫米的圆形，于37摄氏度孵育20分钟，以预包被孔板。使用细胞计数仪确定细胞数量，将总共10,000个细胞重悬于40微升泪腺干细胞培养基（LGSCM）中，再加入40微升基质凝胶中。用移液器轻轻混匀。使用移液器小心地将80微升混合物滴加到24孔板每个孔的预包被区域。在37摄氏度下孵育20分钟，然后加入600微升LGSCM。每隔两天更换各孔中的培养基。培养七天后，在倒置显微镜下寻找直径为100至300微米的LGSC球体。使用本方案分离并培养Rosa26和NOD小鼠的原代泪腺干细胞。培养7天后，从球体培养孔中移除培养基。在37摄氏度下，用20微升含10单位/毫升分散酶和100微升10毫摩尔PBS溶液孵育30分钟，使低级别浆液性癌（LGSC）球体解聚。将悬液转移至15毫升离心管中，在150 × g条件下离心4分钟。弃去上清液。加入1 mL 0.05%胰蛋白酶EDTA，于37°C处理5分钟。加入1 mL 0.05%胰蛋白酶抑制剂，反复吹打以中和胰蛋白酶，并将细胞球解离为单细胞。在150 ×g条件下离心5分钟，弃去上清液，收集LGSC细胞沉淀。加入 1 毫升 LGSCM 以重悬泪腺干细胞沉淀，并按照先前所述方法接种细胞。若执行方案一，使用泪腺干细胞培养体系将 LGSCs 的培养时间从 7 天延长至 14 天，以诱导随机分化。对于方案二，在泪腺干细胞培养开始时，将基质胶与 LGSCM 的比例从 1:1 调整为 1:2，以促进导管细胞的分化。将泪腺干

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

用于泪腺干细胞的三维无血清培养系统

利用完整的组织类器官进行原代细胞培养，提供了一种模拟多细胞体内微环境的模型系统。我们建立了一种无血清的原代乳腺上皮组织培养模型，该模型可在不进行酶解组织解离的情况下长期维持混合细胞谱系，并表现出分化形态。乳腺类器官的存活时间可超过&gt;6个月。...

非侵袭性乳腺病变的非酶解、无血清组织培养以自发生成乳腺球

泪腺是一种分支状器官，可产生泪液中的水性成分，对维持视觉和眼健康至关重要。本文描述了小鼠泪腺的解剖及 离体...

操控小鼠泪腺

本文报道了一种由人诱导性多能干细胞（hiPSCs）建立三维（3-D）培养体系的方案，称为无血清拟胚体（SFEB）。该三维模型可类似于器官型脑片培养，用于模拟人类大脑皮层发育过程，并对发育中的神经环路进行生理学研究。...

开发源自人诱导多能干细胞的无血清拟胚体，用于通过生理相关性检测方法研究三维干细胞培养

本方案介绍了一种在无异种成分且无饲养层细胞的培养条件下，将人多能干细胞分化为角膜缘上皮干细胞的简单两步法。此处提供的细胞培养方法能够以较低成本大规模生产具有临床质量的细胞，适用于角膜细胞治疗。...

高效且可扩展的临床兼容性角膜缘上皮干细胞从人多能干细胞的定向分化

本方案描述了一种利用定义明确的培养系统和细胞自组装方法，从人多能干细胞生成肝细胞球的策略。该方案在多种细胞系中具有可重复性，成本效益高，并可实现用于生物医学应用的稳定人肝细胞球的制备。...

从多能干细胞无血清生成三维人肝细胞球

本方案描述了如何建立、维持、基因改造、分化、功能表征以及移植源自小鼠和人类原代组织的泪腺类器官。...

小鼠与人泪腺类器官的建立、维持、分化、遗传操作及移植

本文介绍了一种利用水凝胶作为脂肪源性干细胞（ADSC）三维（3D）细胞培养支架的实验方案，并引入光生物调节（PBM）以增强ADSCs在3D培养环境中的增殖能力。...

脂肪源性干细胞在光生物调节增强的水凝胶中的三维细胞培养

本方案描述了一种优化的分离老龄小鼠泪腺以获取可用于单细胞RNA测序的活单细胞的方法。通过依次进行酶消化并配合轻柔操作，可保持细胞完整性，获得高质量的单细胞悬液，适用于分离特定细胞类型，并对泪腺细胞群中与衰老相关的变化进行转录组学分析。...

从老年泪腺和唾液腺中分离肌上皮细胞与成纤维细胞的单细胞解离、RNA测序操作方案

我们介绍一种基于芯片的平台，用于在微型生物反应器中进行细胞的三维培养。一块芯片可容纳多达1000万个细胞，并可在无菌、封闭的循环系统中，对流体流动、氧张力等条件进行精确控制，从而实现细胞培养。...

基于芯片的灌注式微型生物反应器中的三维细胞培养

人血小板裂解液是生长因子的丰富来源，也是细胞培养中一种高效的补充剂。本方案介绍了从富血小板血浆开始，通过多次冻融循环并去除血小板碎片，制备大量人血小板裂解液的过程。...

制备人血小板裂解液（pHPL）作为无动物血清人干细胞培养的高效补充剂

学习使用无血清三维培养系统分离和培养泪腺干细胞，实现长期扩增及向腺泡和导管样细胞分化。该方法为泪腺修复和再生医学研究提供重要模型。

三维无血清泪腺干细胞培养系统

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