Name: 发育（青蛙）胚胎中的细胞谱系引导质谱蛋白质组学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 了解谱系引导质谱蛋白质组学方法，用于Xenopus laevis胚胎发育生物学研究。该技术实现细胞谱系的时空分辨蛋白质分析，揭示组织诱导和细胞命运决定的分子机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢马里兰大学帕克分校的 Jie Li 在胚胎解离和流式细胞分选（FACS）方面的宝贵讨论。感谢 Vi M. Quach 和 Camille Lombard-Banek 在先前研究中对样本制备和数据收集提供的帮助，这些研究展示了本实验方案中重点介绍的蛋白质组学应用。本工作的部分内容得到了美国国家科学基金会 IOS-1832968 CAREER 项目（授予 P.N.）、美国国立卫生研究院 R35GM124755 项目（授予 P.N.）、马里兰大学与美国国家癌症研究所合作项目（授予 P.N.）以及 COSMOS Club Foundation 研究奖（授予 A.B.B. 和 L.R.P.）的支持。

作者声明无竞争利益。

本方案可实现对爪蟾（Xenopus）物种胚胎中已鉴定细胞谱系的蛋白质表达进行表征。该方法源于高分辨质谱（HRMS），结合了分子鉴定的极高特异性、无需分子探针即可同时检测多种蛋白质（通常为数百至数千种不同蛋白质）的能力，以及定量分析能力。该技术可与细胞和发育（神经）生物学中的经典工具和工作流程相兼容，从而将HRMS蛋白质组学拓展至一系列引人注目的应用，包括对脊椎动物非洲爪蟾（X. laevis）胚胎中干细胞分化的整体性表征。
本步骤描述了在X. laevis胚胎中进行的细胞谱系导向蛋白质组学研究。作为示例，我们展示了神经命运单细胞及其谱系的分析，并通过公共数据存储库提供了相应的毛细管电泳和纳米液相色谱高分辨质谱数据集（参见PRIDE）。该方法可轻松适用于多种细胞类型（及谱系）中蛋白质时空调控的研究。在发育胚胎中进行的时空导向蛋白质组学还可拓展至转录组学和代谢组学研究，以促进对细胞分化及关键器官（如神经系统）发育的分子系统生物学理解。
本方案为生物分析增添了新的维度。细胞培养，...

我们对细胞分化以及组织和器官发生的理解，是数十年来对基因及其产物进行精细靶向筛选的结果。深入了解重要细胞事件过程中所有生物分子及其含量，将有助于揭示控制脊椎动物体轴时空模式形成的分子机制。目前，能够实现分子扩增与测序的技术已可常规检测大量基因和转录本，从而支持基础生物学和转化研究中的假设驱动型研究。为了理解发育系统，鉴于转录与翻译之间存在复杂的关联，有必要对多种蛋白质及其翻译后修饰进行直接分析。基于全局蛋白质组学的 体外 生物系统，例如诱导多能干细胞，开始阐明组织诱导的机制1,2在复杂的生物体（如脊椎动物胚胎）中，发育过程依赖于形态发生素在时空背景下的浓度梯度3因此，了解细胞分化形成特化组织（如神经组织）过程中的蛋白质组变化，是揭示控制正常与异常发育的分子程序并指导下一代治疗策略的关键。
非洲爪蟾（Xenopus laevis）是一种在细胞与发育生物学、神经生物学以及再生生物学研究中广泛应用的脊椎动物模式生物。约翰·戈登爵士因发现体细胞核具有多能性而获得2012年诺贝尔生理学或医学奖4,5，这一成果凸显了该模型在基础研究和转化研究中的重要性。Xenopus 胚胎在母体外发育，便于对细胞、细胞克隆以及基因表达在不同发育阶段进行直接操作。其不对称的色素分布和模式化的细胞分裂使得研究人员能够绘制出可重复的细胞命运图谱，最早可追溯至16-6 和32-细胞7,8 阶段的胚胎。对于基于高分辨率质谱（HRMS）的蛋白质组学研究，该模型的其他优势还包括胚胎体积相对较大（直径约1 mm），可提供充足的蛋白质用于分析（早期卵裂阶段胚胎约含130 µg蛋白质，16-细胞胚胎的单个细胞约含10 µg蛋白质）9,10。
目前，高分辨质谱（HRMS）是检测蛋白质的首选领先技术。该技术能够直接、灵敏且特异地检测和定量多种蛋白质，通常可同时分析数百至数千种不同的蛋白质11。基于HRMS的自下而上蛋白质组学包含一系列相互关联的步骤。首先从细胞或组织样本中提取蛋白质，随后使用蛋白酶（如胰蛋白酶）对其进行酶解消化（即自下而上蛋白质组学）。所产生的肽段根据其不同的理化性质进行分离，这些性质包括疏水性（反相液相色谱，LC）、净电荷（离子交换色谱）、分子大小（尺寸排阻色谱）或电泳迁移率（毛细管电泳，CE）。肽段随后被电离，通常采用电喷雾电离（ESI）技术，生成的肽离子通过串联高分辨质谱（HRMS）在气相中发生碎片化，从而实现检测与测序。所获得的肽段数据被映射至研究对象生物体的蛋白质组。由于蛋白质特异性（蛋白质原型）肽离子信号强度与蛋白质浓度相关，因此可进行无标记或基于标记（多重定量）的蛋白质定量分析。HRMS蛋白质组学提供了关于研究体系分子状态的丰富信息，有助于提出科学假设并开展后续功能研究。
<img alt="细胞微吸与分离示意图；从胚胎到原肠胚，通过FACS分选，实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：时空可扩展的蛋白质组学技术，实现发育中（青蛙）胚胎中基于细胞谱系指导的高分辨质谱蛋白质组分析。（A）使用体视显微镜（2）观察样本（1），并通过由移液台（4）控制的自制微移液管（3）对特定细胞进行注射（插图）。（B）从16细胞期胚胎中对左侧D11细胞进行亚细胞取样。（C）从16细胞期胚胎中完整分离出D11细胞。（D）利用荧光（绿色）标记追踪32细胞期胚胎中左侧和右侧D111细胞的后代，以指导在原肠胚（第10期）中神经外胚层（NE）的显微解剖，并通过FACS从蝌蚪中分离其衍生组织。比例尺：胚胎为200 µm，离心管为1.25 mm。图示经参考文献15,19,21,59许可改编。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
本方案实现了基于高分辨质谱（HRMS）对发育中X. laevis胚胎内已鉴定细胞/组织中大量蛋白质进行定量分析。该方法建立在精确的细胞鉴定、可重复的细胞命运图谱以及在此生物模型中已确立的细胞谱系追踪技术基础之上6,7,8。如图1所示，我们通过全细胞解剖或毛细管微量取样吸取细胞内容物，从而对单个细胞的蛋白质组进行研究。通过追踪细胞谱系，可研究在原肠胚形成过程中细胞形成组织时蛋白质组的时空动态演变。细胞后代通过注射与惰性葡聚糖偶联的荧光染料或荧光蛋白mRNA（例如绿色荧光蛋白GFP）进行荧光标记。在选定的发育时间点分离标记的细胞后代。在原肠胚形成期间，紧密聚集的细胞克隆可通过解剖法分离；原肠胚形成之后，由于细胞迁移运动，细胞克隆可能分散于胚胎中，此时可通过荧光激活细胞分选（FACS）从解离的组织中分离。这些细胞和组织中的蛋白质通过自下而上（bottom-up）蛋白质组学方法进行检测，采用HPLC或CE进行分离，并利用ESI串联高分辨质谱（HRMS）进行鉴定。基于细胞谱系引导的HRMS蛋白质组学技术可扩展应用于胚胎内不同大小和类型的细胞及其谱系，具有特异性、高灵敏度和定量能力。通过本文展示的若干示例，我们还进一步证明了该方案具有良好的可扩展性，并可广泛适用于多种类型的细胞及细胞谱系。
<img alt="细胞和组织解剖工作流程图，包含肽段消化、色谱分析、电喷雾高分辨质谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：生物分析工作流程。 通过显微解剖与毛细管抽吸，或借助荧光激活细胞分选（FACS）获取细胞及克隆来源的蛋白质样品。去除高丰度卵黄蛋白后，采用毛细管电泳（CE）或纳流液相色谱（LC）分离，结合电喷雾电离（ESI）高分辨质谱（HRMS）提高鉴定（ID）灵敏度。定量分析揭示了表达失调情况，结合基因本体（GO）已有信息，为假设驱动型研究提供新的线索。图示经参考文献15许可改编。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>乙腈（LC-MS级）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0492</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Fisher Scientific</td><td>A643-500</td><td></td></tr><tr><td>分析柱</td><td>Thermo Scientific</td><td>164941</td><td></td></tr><tr><td>分析型微量天平</td><td>Mettler-Toledo</td><td>XSE105DU</td><td></td></tr><tr><td>自动肽段分离平台</td><td>Agilent</td><td>1260 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐毛细管</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐毛细管（用于制作Emmitter）</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>C18离心柱（用于脱盐）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>电喷雾监测相机</td><td>Edmund Optics Inc.</td><td>EO-2018C</td><td></td></tr><tr><td>康普拉他汀A4</td><td>Millipore Sigma</td><td>C7744</td><td></td></tr><tr><td>商用CESI系统</td><td>AB SCIEX</td><td>CESI</td><td></td></tr><tr><td>环己氨基丙磺酸（CAPS）</td><td>VWR</td><td>97061-492</td><td></td></tr><tr><td>细胞松弛素D</td><td>Millipore Sigma</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖，Alexa Fluor 488标记；分子量10,000，阴离子型，可固定</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D22910</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0861</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ62786AP</td><td></td></tr><tr><td>落射荧光光源</td><td>Lumencore</td><td>AURA III</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind微量离心管：蛋白用&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-698-793</td><td></td></tr><tr><td>甲酸（LC-MS级）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>冷冻冰箱（-20 &amp;deg;C）</td><td>Fisher Scientific</td><td>97-926-1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>超低温冰箱（-80 &amp;deg;C）</td><td>Thermo Scientific</td><td>TSX40086A</td><td></td></tr><tr><td>熔融石英毛细管</td><td>Molex</td><td>1088150596</td><td></td></tr><tr><td>加热金属块</td><td>Benchmark</td><td>BSH300</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱系统</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem</td><td></td></tr><tr><td>高压电源</td><td>Spellman</td><td>CZE1000R</td><td></td></tr><tr><td>高分辨率质谱仪</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td><td></td></tr><tr><td>HPLC瓶盖</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4013-40A</td><td></td></tr><tr><td>HPLC小瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4013-11</td><td></td></tr><tr><td>照明装置（例如鹅颈灯）</td><td>Nikon</td><td>C-FLED2</td><td></td></tr><tr><td>Ingenuity通路分析软件</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC122275000</td><td></td></tr><tr><td>甲醇（LC-MS级）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456</td><td></td></tr><tr><td>甲醇（LC-MS级）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>微毛细管拉制仪</td><td>Suttor Instruments</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>显微注射器</td><td>Warner Instrument, Handem, CT</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>质谱数据分析软件，商业版</td><td>ProteomeDiscoverer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>质谱数据分析软件，开源版</td><td>MaxQuant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>非离子型去污剂替代物NP-40</td><td>Millipore Sigma</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（60 mm和80 mm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>S08184</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 10 &amp;micro;L填料Zip-tip（用于脱盐）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>87782</td><td></td></tr><tr><td>Pierce二辛可宁酸蛋白检测试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce定量比色肽检测试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23275</td><td></td></tr><tr><td>Pierce胰蛋白酶（质谱级）</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI90058</td><td></td></tr><tr><td>蛋白LoBind样品瓶</td><td>Eppendorf</td><td>0030108434&lt;br/&gt; , 0030108442</td><td></td></tr><tr><td>制冷离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>制冷培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>PR505755R/3721</td><td></td></tr><tr><td>异乙磺酸钠</td><td>Millipore Sigma</td><td>220078</td><td></td></tr><tr><td>焦磷酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221368-100G</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢BGE样品瓶</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>不锈钢样品瓶</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜（10倍物镜）</td><td>Nikon</td><td>SMZ 1270, SZX18</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>VWR</td><td>97063-790</td><td></td></tr><tr><td>注射泵（2台）</td><td>Harvard Apparatus</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>气密性注射器：500&amp;ndash;1000 &amp;micro;L</td><td>Hamilton</td><td>1750TTL</td><td></td></tr><tr><td>移液管（塑料，一次性）</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>捕获柱</td><td>Thermo Scientific</td><td>164750</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl（1 M溶液）</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ22638AP</td><td></td></tr><tr><td>可在4&amp;ndash;10 &amp;deg;C运行的真空浓缩仪</td><td>Labconco</td><td>7310022</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Benchmark</td><td>BS-VM-1000</td><td></td></tr><tr><td>水（LC-MS级）</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>水（LC-MS级）</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>XYZ三维平移台</td><td>Thorlabs</td><td>PT3</td><td></td></tr><tr><td>XYZ三维平移台</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于细胞谱系引导的质谱蛋白质组学在发育中（青蛙）胚胎中的应用

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

细胞发育为组织和器官过程中的分子事件表征，有助于更深入理解正常发育机制，并为疾病设计高效的治疗方案。能够精确鉴定和定量大量及多种类型蛋白质的技术，将提供目前尚缺失的、关于组织和生物体在时空上协调发育的分子机制信息。本文介绍一种基于质谱的实验方案，可在Xenopus laevis（青蛙）胚胎中对已知细胞谱系的数千种蛋白质进行定量检测。该方法基于可重复的细胞命运图谱，结合已建立的技术，用于识别、荧光标记、追踪以及采样特定细胞及其后代（克隆），这些技术均来自脊椎动物发育的经典模型。通过显微取样、解剖分离或荧光激活细胞分选获取细胞内容物后，提取蛋白质并进行自下而上（bottom-up）的蛋白质组学分析。采用液相色谱和毛细管电泳实现蛋白质的可扩展分离，进而利用高分辨质谱（HRMS）进行高精度的蛋白质检测与定量。本文以神经组织命运决定细胞的蛋白质组学表征为例，展示了该方法的应用。这种基于细胞谱系指导的高分辨质谱蛋白质组学技术可适用于不同组织和生物体，具有足够的灵敏度、特异性和定量能力，可用于深入探究脊椎动物发育过程中蛋白质组的时空动态变化。

该方案使得在单细胞及其谱系形成组织的过程中对蛋白质进行研究成为可能 X. laevis 胚胎 图1 展示了该方法在研究神经组织命运细胞及胚胎中新诱导的神经外胚层中蛋白质的一种应用。如图所示 图1A生物分析工作流程结合了细胞与发育生物学的传统工具，用于识别、注射/吸取细胞以及采集样本。 图1B 显示对左侧背侧动物极（D11) 16细胞胚胎中的细胞 体内 使用显微注射仪；实验结束后，胚胎成功发育为具有正常解剖结构的蝌蚪56. 大型胚胎细胞（约100-250 µm 直径）也适用于手工显微解剖。对右侧背侧-动物极中线（D11) 细胞从16细胞期胚胎中示出 图1C该装置还允许通过向已鉴定的前体细胞注射荧光示踪剂来追踪克隆轨迹。如图所示 <strong ...

本文描述了一种基于质谱的蛋白质组学方法，用于对具有已知组织命运的脊椎动物Xenopus laevis胚胎中的细胞谱系进行表征。

表征细胞形成组织和器官过程中的分子事件，有助于更深入地理解正常发育过程，并为设计……

这种基于细胞谱系的研究方法能够在脊椎动物胚胎内以空间和时间分辨率对重要的发育事件进行蛋白质组学分析，提供通过整体胚胎测量无法获得的信息。该方法可轻松扩展应用于研究胚胎细胞在发育过程中分化时的蛋白质、代谢物和转录本。此技术有助于加深我们对调控正常发育与疾病发生分子机制的理解，包括早期发育过程中组织诱导和细胞命运决定的机制。使用毛细环将每个胚胎引导至孔中，并轻轻调整其位置，使目标细胞与显微针成合适的角度。参照非洲爪蟾（xenopus laevis）的组织命运图谱，确定所关注谱系的前体细胞。使用两把锋利的镊子轻轻去除包围胚胎的卵黄膜。使用镊子通过手工解剖从胚胎中分离单个细胞。首先准备含有谱系示踪剂溶液的注射针，将显微注射针安装到由多轴显微操作器控制的微移液管固定器中。将微量移液器固定器连接至显微注射仪，并通过施加负压使针头充满谱系示踪剂。校准针头，调整针尖大小和注射时间，以注入约一纳升谱系示踪剂溶液（以矿物油中测量为准）。确保所注射液滴体积准确，必要时调整注射仪参数。用3% fCAL溶液充满显微注射用黏土培养皿，使用转移移液管将约10个胚胎转移至该培养皿中。向目标细胞注射约1纳升荧光葡聚糖或200皮克GFP mRNA。在体视显微镜下观察，确认细胞标记成功。确保仅对目标细胞进行注射。根据机构规定，弃去含有受损或标记错误细胞的胚胎。将注射后的胚胎转移至含有0.5x Steinberg溶液的培养皿中。在14至25°C条件下培养，直至达到所需的发育阶段。将3至5个胚胎转移至含有0.2x Steinberg溶液的琼脂培养皿中，用于显微解剖。使用镊子从胚胎中解剖出标记的克隆。使用0.5至10微升移液器收集解剖后的组织，并将其转移至微量离心管中。用移液器吸除收集到的组织周围的培养基，以减少样品中的盐分，避免对高分辨质谱（HRMS）分析产生干扰。将样品管置于干冰或液氮上，立即冷冻保存分离的细胞。将样品在负80摄氏度下保存，直至进行质谱分析。对于通过毛细管电泳处理的单细胞样品，通过将样品加热至60摄氏度约15分钟使蛋白质变性。然后将样品在室温下平衡5分钟，并向样品中加入胰蛋白酶以进行消化。进行NanoLC分析时，将最多五份解剖组织在50微升裂解缓冲液中裂解。通过反复吹打样品以促进裂解过程。处理解剖组织时，将裂解液在4摄氏度下孵育10分钟。然后在 4 摄氏度下以 4,500 RCF 离心，沉淀细胞碎片和卵黄小板。将上清液转移至洁净的微量离心管中，并加入 10% SDS，使裂解液中 SDS 的终浓度为 1%。对于组织样品，向裂解液中加入 0.5 摩尔的二硫苏糖醇，使其终浓度约为 25 毫摩尔。然后将裂解液在60摄氏度下孵育30分钟，以化学还原蛋白质中的二硫键。加入0.5摩尔的碘乙酰胺，使裂解液中终浓度约为75毫摩尔，并将混合物在室温下避光孵育15分钟。加入与初始体积相同的0.5摩尔二硫苏糖醇，以淬灭烷基化反应中剩余的反应物。按照文本方案所述，用丙酮过夜沉淀蛋白质，并用 0.5 摩尔碳酸氢铵重新溶解。加入胰蛋白酶进行样品消化，并将样品管在 37 摄氏度下孵育。为使用毛细管电泳分离肽段，将消化后的蛋白质重新溶解于一至两微升的样品溶剂中。将混合样品涡旋振荡，并在4°C条件下以10,000 RCF离心两分钟，以沉淀细胞碎片。通过用BGE冲洗CE毛细管来启动CE-ESI仪器。取1微升样品加入样品瓶中，并通过流体动力学进样将1至10纳升样品注入CE分离毛细管中。将毛细管电泳分离毛细管的进样端插入背景电解质溶液（BGE）中。通过逐步升高毛细管电泳分离电压（从接地电位开始）启动电泳分离。采用20至28千伏的电压，电流低于10微安，可确保仪器在分析过程中具有稳定且可重复的性能。使用纳米液相色谱（Nano LC）进行分离时，将肽样品重新悬浮于流动相A中。样品的浓度和进样体积取决于所用的液相色谱系统和色谱柱。将样品转移至液相色谱小瓶中。将约200纳克至2微克的肽样品加载至C18分析柱，并按照文本稿件中所述的梯度洗脱程序，以300纳升/分钟的流速分离肽段。使用相机检查液体在电喷雾发射器中的流动情况，并目视检查装置是否存在可能的泄漏。按照文稿中所述方法获取质谱事件并测序肽段。利用毛细管电泳-电喷雾-高分辨质谱法（CE-ESI-HRMS）检测了从不同胚胎中分离的D11细胞之间的基因翻译差异。通过液相色谱-高分辨质谱法（LC-HRMS）分析了谱系标记的分离细胞克隆。蛋白质通路分析显示，在脊索中胚层与神经外胚层中，蛋白质翻译和能量代谢相关蛋白表达上调。神经外胚层原肠富含与细胞内蛋白质货物核转运相关的蛋白，可能提示信号传导后的下游事件。分子功能富集分析显示，翻译起始、RNA结合以及蛋白酶体复合物的结合均出现上调，提示动态蛋白质转换在斯佩曼组织者发育过程中发挥重要作用。为提高实验的可重复性及结果解读的准确性，本方案应仅选用具有典型表型的胚胎。解剖所得组织应转移至样品瓶中，并尽可能减少培养基缓冲液的残留，立即冷冻，以最大限度降低缓冲盐带来的污染。这种方法使我们能够在活体胚胎中研究已鉴定细胞及细胞谱系中的蛋白质动态变化。我们所获得的关于发育组织中重要蛋白质时空表达的新信息，使我们能够设计有针对性的实验来评估其生物学功能。

cell-lineage-guided-mass-spectrometry-proteomics-developing-frog

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

发育（青蛙）胚胎中的细胞谱系引导质谱蛋白质组学

活细胞成像与胚胎上皮细胞的定量分析 Xenopus laevis

单个胚胎细胞的命运可能受到继承分子和/或邻近细胞信号的影响。利用卵裂期非洲爪蟾胚胎的命运图谱，可以鉴定出单个卵裂球并进行分离培养，以评估继承分子与细胞间相互作用各自的贡献。...

用于检测胚胎发育过程中细胞命运决定的卵裂球外植实验

染色质调控因子和染色质状态如何影响基因组的问题 在体 对于理解发育中胚胎早期细胞命运决定机制至关重要。本文概述了在全基因组水平上研究染色质特征最常用的方法——ChIP-Seq。 非洲爪蟾...

通过ChIP-Seq获得的Xenopus胚胎中染色质调控因子和状态的全基因组快照

本文提供了一套简单的方法，用于分析荧光标记配体在非洲爪蟾（Xenopus）中的分泌与扩散。该方法可用于检测其他蛋白质对配体分布的调控能力，并支持开展有助于揭示形态发生素梯度调控机制的实验。...

使用非洲爪蟾（Xenopus laesvis）的共聚焦分析研究Wnt与Shh形态发生素梯度的调控因子

本方案介绍了一种进行定量、单细胞分析的方法 原位...

小鼠植入前胚胎谱系特化过程中蛋白质表达的定量分析

我们描述了实现快速的步骤 原位...

用于活体非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎单细胞代谢组学的微探针毛细管电泳质谱分析

本文介绍了一种多重化的单细胞mRNA测序方法，用于分析小鼠胚胎组织中的基因表达。基于微滴的单细胞mRNA测序（scRNA-Seq）方法结合多重化策略，可同时对来自多个样本的单细胞进行分析，显著降低了试剂成本，并最大限度地减少了实验批次效应。...

小鼠胚胎细胞多重单细胞mRNA测序分析

我们提出了一项分为两个部分的实验方案，该方案结合了荧光钙成像与原位杂交技术，使实验人员能够在单细胞水平上将钙活动模式与基因表达谱相关联。...

荧光钙成像与后续原位杂交用于神经前体细胞表征 Xenopus laevis

光片荧光显微镜是发育生物学中最有价值的工具。在比较研究中，一个主要问题是环境变异。我们的实验方案描述了一种可同时对多个样本进行活体成像的实验框架，从而主动解决了这一问题。...

基于样品腔的光片荧光显微镜中对多个昆虫胚胎进行同步活体成像

斑马鱼靶向反应性亲电体和氧化剂（Z-REX）是一种基于化学生物学的方法，用于研究反应性小分子信号传导。该技术可应用于不同发育阶段的活体斑马鱼。在此，我们将斑马鱼中的标准检测方法与Z-REX相结合，用于信号通路分析。...

监测斑马鱼幼虫中的靶向信号响应——Z-REX揭示亲电性药物与代谢物的精确作用机制

本文展示了一种有效的快速血液灌注方案，用于制备非洲爪蟾组织样本，以进行转录组学和蛋白质组学研究。...

Xenopus 中有效的快速血液灌注

了解谱系引导质谱蛋白质组学方法，用于Xenopus laevis胚胎发育生物学研究。该技术实现细胞谱系的时空分辨蛋白质分析，揭示组织诱导和细胞命运决定的分子机制。

基于细胞谱系引导的质谱蛋白质组学在发育中（青蛙）胚胎中的应用

探索更多视频