Name: 通过电感耦合等离子体质谱法对斑马鱼中铂基和钌基化合物暴露的剂量吸收，具有更广泛的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学习使用电感耦合等离子体质谱法测定斑马鱼组织中铂基和钌基化合物的金属吸收剂量。该方法通过组织消解技术准确量化水暴露剂量，为神经科学、环境毒理学和药理学研究提供可靠的剂量反应验证手段。

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基金支持：NJAES-罗格斯大学 NJ01201、NIEHS 培训基金 T32-ES 007148、NIH-NIEHS P30 ES005022。此外，Brittany Karas 获得来自 NINDS、NIH 的培训基金 T32NS115700 的支持。作者感谢 Andreia Valente 及葡萄牙科学技术基金会（Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT；项目编号 PTDC/QUI-QIN/28662/2017）提供 PMC79。

所有实验均使用AB品系斑马鱼（Danio rerio）（见材料表），饲养方案（#08-025）已获罗格斯大学动物护理与设施委员会批准。
1. 斑马鱼养殖
<ol>
	<li>在循环水生栖息系统中饲养并维持斑马鱼，光照周期为14小时光照：10小时黑暗。
	<ol>
		<li>通过砂滤和活性炭过滤净化市政自来水，获得养鱼用水。将水生系统水温维持在28 °C，亚硝酸盐浓度&#60;0.05 ppm，氨浓度&#60;0.2 ppm，pH值介于7.2至7.7之间。</li>
		<li>以孵化的卤虫卵囊、丰年虾和鱼用薄片饲料喂养斑马鱼。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 斑马鱼剂量-反应实验方案（图1）
<ol>
	<li>制备斑马鱼卵水溶液，可使用E3培养基或由浓缩海盐配制的卵水，即将海盐以60 µg/mL的浓度溶解于去离子水中18。避免使用亚甲基蓝。 
	注意：通过ICPMS检测发现，斑马鱼卵水中的锶氧化物存在同量异位素干扰，会与钌的某一同位素信号重叠。在后续分析前对幼鱼进行充分冲洗可缓解此问题。由于市售海盐成分不公开，E3培养基对部分实验者而言可能是更简便的选择。</li>
	<li>将金属或金属基化合物溶解于E3培养基或卵水中，涡旋振荡以打碎任何聚集物并使溶液均一。 
	注意：在下述实验中，PMC79和顺铂的最大溶解浓度分别为12.4 mg/L和60 mg/L，同时使用不超过0.5%的二甲基亚砜（DMSO）以防止沉淀。
	<ol>
		<li>用E3培养基或卵水稀释重金属或金属基化合物（如PMC79和顺铂），至少配制5个不同浓度梯度。
		<ol>
			<li>先用纯溶剂（如DMSO）配制低浓度母液，再用E3培养基或卵水稀释。需仔细考虑最终体系中溶剂的浓度。 
			注意：某些金属基化合物（如顺铂）极易降解，其溶液必须每日新鲜配制。警告：操作重金属及化疗药物时应格外小心，请查阅目标金属的材料安全数据表（MSDS）。顺铂可能引起眼睛和皮肤刺激，吞食可致死亡，并可能导致肾脏、血液、造血器官及胎儿组织毒性。避免吸入其蒸气，避免接触眼睛、皮肤和衣物。操作时应佩戴不渗透性手套和防护服，以及安全眼镜或护目镜19。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在实验前一天下午设置繁殖缸，按2雌:1雄的理想比例将斑马鱼分开放入同一缸中，并用隔板隔离20。
	<ol>
		<li>在早晨光照周期开始时移除隔板。</li>
		<li>让斑马鱼进行繁殖。 
		注意：繁殖时间长度取决于所需的初始暴露阶段。若需在受精后3小时（3 hpf）开始处理，则繁殖时间约为2小时。在收集和分离卵后，卵将处于3 hpf阶段。</li>
		<li>将繁殖后的成鱼转移至清洁的鱼缸中。</li>
		<li>通过将缸内水倒入滤网的方式收集卵。</li>
		<li>将滤网倒置于培养皿上方，使用装有E3培养基或卵水的冲洗瓶将卵冲洗入培养皿中。</li>
		<li>在用于实验前，清除培养皿中的食物残渣和代谢废物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用移液管和少量水，将每个剂量组约二十个3 hpf胚胎随机分配至独立的玻璃小瓶中。</li>
	<li>所有胚胎转移至小瓶后，吸除全部卵水，并加入足够量的处理溶液，使液面高出卵的高度约1英寸。 
	注意：是否需要去壳（脱膜）应谨慎评估。详见讨论部分。</li>
	<li>每日观察胚胎是否出现病变或死亡。由于斑马鱼胚胎发育迅速，应使用任意明场显微镜/相机系统每日拍摄图像，以便识别不同天数之间的细微病变。</li>
	<li>在剂量反应实验结束时（受精后4–5天[dpf]，依据经济合作与发展组织[OECD]指南21），将3–5条幼鱼合并，用于复合取样，随后通过液氮速冻实现快速冷却以实施安乐死。 
	注意：使用过量MS-222或三卡因甲磺酸盐（tricaine methanesulfonate）进行安乐死可能干扰后续ICPMS分析。本方案推荐采用快速冷却法以降低干扰风险。</li>
	<li>使用高纯度水（如反渗透水）对组织进行3次洗涤，以去除组织表面残留的化合物。</li>
	<li>将样品转移至耐酸且可微波处理的15 mL聚丙烯离心管中。务必彻底去除所有过量水分，因为残留液体可能稀释硝酸，从而降低酸在组织消解过程中的氧化能力。 
	注意：此时样品可在-20 °C条件下储存，直至进一步分析。对于天然丰度较高的金属，建议在使用前将离心管置于5%硝酸浴中清洗，以降低环境背景水平。</li>
</ol>
3. 组织消化与ICPMS评估（图2）
<ol>
	<li>向15 mL聚丙烯离心管中加入约0.25 mL高纯度硝酸（69%），用于消化最多10只幼虫（约100 µg）。使用以下参数进行1小时超声预消化：超声波清洗器输出功率：85 W；频率：42 kHz ± 6%；温度范围：19–27 °C。 
	警告：超声处理期间请佩戴听力保护装置。硝酸可引起严重的呼吸道、眼睛和皮肤灼伤。操作时必须穿戴全套防护装备，并在通风橱或通风良好的环境中进行。硝酸可能与其他物质发生可燃反应。消化过程中应始终在通风橱内操作，以避免接触产生的蒸气。切勿吸入或吞食。
	<ol>
		<li>在耐酸微波消解仪中进行短周期组织消解（每次5分钟），直至所有组织明显被氧化（即溶液呈均匀的淡黄色）。 
		注意：建议按照表1中的微波消解程序重复操作三次，每次加热步骤之间包含5分钟冷却间隔。</li>
		<li>仔细监测离心管的完整性，防止破裂；每个消解周期之间进行短暂离心（313 × g，1分钟），以使冷凝的酸液重新聚集至管底。 
		注意：若组织难以消解（尤其是卵膜），可在酸消解后使用30%高纯度过氧化氢。用过氧化氢（6.75 mL）将酸浓度稀释至3.5%，并在通风橱中静置过夜。过氧化氢会分解为H2O，适用于ICPMS分析。此外，某些金属可能在盐酸或盐酸与硝酸混合液（即王水）中溶解效果更佳。过氧化氢吞食有害，并可造成严重眼损伤。操作时必须佩戴皮肤和眼部防护装备22,23。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当组织明显被氧化（即溶液呈均匀的淡黄色）后，在通风橱中用6.75 mL高纯水将样品稀释至3.5%硝酸浓度，并涡旋混匀。 
	注意：此时样品可在室温下保存。若在步骤3.1中已添加过氧化氢以助消解，则此步骤可省略。</li>
	<li>使用经认证的元素标准品（根据检测项目选择Pt或Ru）及目标金属及其最佳同位素，建立与基质匹配的7点校准曲线（浓度范围：0.001–10 ppb），以校正潜在的同量异位素干扰。
	<ol>
		<li>取水相认证元素标准品（Ru、Pt = 1000 ppb）的0.1 mL等分试样，移入新的15 mL离心管中，用3.5%硝酸稀释至终体积10 mL，得到10 ppb的标准溶液。</li>
		<li>以10 ppb储备液为基础，用3.5%硝酸进行系列稀释，制备0.1、1.0和5.0 ppb的标准溶液。</li>
		<li>以0.1 ppb储备液为基础，用3.5%硝酸进行系列稀释，制备0.001、0.005和0.01 ppb的标准溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按以下步骤准备ICPMS仪器（参见材料表）进行样品分析：
	<ol>
		<li>启动仪器前，确保氩气阀门已打开，所有管路连接牢固，并开启5%硝酸用于在样品分析之间冲洗管路和玻璃器皿。</li>
		<li>检查炬管和锥体状态，确认炬管箱已牢固闭合，喷雾室排液管正确连接至蠕动泵。</li>
		<li>打开软件（参见材料表）。</li>
		<li>检查真空读数，确保所有涡轮泵均以100%运行。</li>
		<li>在等离子体控制系统状态窗口中点击START，启动启动序列，开启等离子泵、等离子冷却器，吹扫雾化器并点燃等离子体。等待等离子体点燃并稳定，状态窗口将提示启动序列完成。此时观察系统状态窗口中的绿色圆点，确认所有电源均已开启。</li>
		<li>在菜单栏中点击Control | autosampler。输入装有5%硝酸的离心管在自动进样器上的位置，使酸液进入等离子体。</li>
		<li>在菜单栏中点击Scans | Magnet。在MagnetScan窗口中，将Marker Mass Position设为115并点击enter。仪器预热期间，让磁体在115In的质量范围（114.6083至115.3749）内扫描30分钟。</li>
		<li>30分钟后，使用自动进样器控制将进样针移至1 ppb多元素调谐液的位置。吸入调谐液并调节仪器以优化信号读数。在Plasma control窗口中调整炬管位置（X, Y, Z），使炬管与锥体中心对齐，并调节雾化器流速（~ 30 psi）。在Ion Optics Tuning窗口中对Source、Detector和Analyzer进行必要调整。</li>
		<li>当信号读数优化后（1 ppb 115In的信号约为~1.2 × 106&#160;counts/s），在Magnet Scan窗口中点击Stop。
		<ol>
			<li>点击Calibrate Magnet，在弹出窗口中选择Low Resolution。</li>
			<li>点击OK，并打开&#34;Mass Calibration (Low Resolution).smc&#34;文件以校准磁体。 
			注意：磁体校准将测量counts/s，并拟合一条通过以下质量范围的曲线：7Li至238U。</li>
			<li>点击Save | Use，将当前磁体校准应用于分析。若检测浓度范围极广的未知样品，需进行检测器校准，以比较低浓度下的离子脉冲计数信号与高浓度下的衰减离子信号。调谐和校准完成后即可开始样品分析。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在菜单栏中点击Data Acquisition。
		<ol>
			<li>在下拉菜单中点击Method Setup。使用制造商提供的现有方法，或根据目标元素创建新方法。必要时调整分析模式、驻留时间、切换延迟、扫描/循环次数、分辨率、检测模式以及偏转器设置的停驻质量。</li>
			<li>点击Save以保存方法参数。针对每种金属和同位素优化参数。本研究中使用的具体操作参数见表2。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在菜单栏中点击Data Acquisition。
		<ol>
			<li>在下拉菜单中点击Batch Run，或点击菜单栏下方的BATCH图标。从电子表格导入批处理参数，或在Batch Run窗口中创建序列。输入样品类型、自动进样器架位、转移时间、清洗时间、重复次数、样品编号和方法文件。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>按以下顺序安排批处理运行：校准曲线用标准溶液（0.001–10 ppb Pt或Ru），随后是质量控制标准品，最后是未知样品。 
		注意：标准溶液在ICPMS上以counts/s测量，通过标准品拟合线性回归曲线，相对标准偏差（RSD）&#62; 0.999。未知样品同样以counts/s测量，并利用校准曲线的线性回归方程 y = mx + b 计算其ppb浓度。数据处理也可通过引用的软件完成。</li>
		<li>每分析5–10个样品插入一个0.5 ppb质量控制标准品，以监测仪器漂移和样品重复性。 
		注意：合适的质量控制标准品应为不同于校准曲线所用标准品的认证标准物质。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>瓦特</td>
			<td>功率</td>
			<td>分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300</td>
			<td>50%</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300</td>
			<td>75%</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300</td>
			<td>0%</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300</td>
			<td>75%</td>
			<td>5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：幼虫组织样品的微波消解方案。斑马鱼幼虫样品在0.25 mL硝酸中进行消解。本表格经24修改。

<ol><li>Rehman, K., Fatima, F., Waheed, I., Akash, M. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+exposure+of+heavy+metals+and+their+impact+on+health+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Prevalence of exposure of heavy metals and their impact on health consequences.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (1), 157-184 (2018).</li>
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</ol>

所有作者均无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案旨在确定含铂（Pt）或钌（Ru）的金属类抗癌药物的递送与摄取情况。尽管这些方法此前已有发表，本方案进一步探讨了将该方法学适用于多种化合物时所需的重要考量与技术细节。结合经合组织（OECD）协议、组织消解及电感耦合等离子体质谱（ICPMS）分析，我们发现PMC79的效力高于顺铂，且在不同组织中的蓄积情况存在差异，提示二者可能具有不同的作用机制。此外，由于顺铂的给药剂量得到了准确定量，剂量-反应结果可外推至患者人群。亚致死剂量（例如LOAEL）与患者静脉给药的浓度相当24。
尽管该方法可应用于多种金属及金属基化合物，但仍需仔细考虑分析物的理化性质。金属基化合物可能极难溶解，因此可使用多种分散剂来避免此问题。分散剂的浓度（如DMSO）可能需要高于OECD方案中的推荐浓度。因此，必须通过密切监测对照组胚胎的发育情况来维持无毒剂量；在暴露期间持续振荡胚胎可减少沉淀产生。此外，有机金属化合物在水溶液中可能不稳定。若其降解过程尚不明确，可考虑采用每24小时更换溶液的实验方案，或将其结果与不更换溶液的剂量-反应曲线进行比较。
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金属及金属化合物在药理学和毒理学中持续具有重要意义。自20世纪60年代以来，重金属暴露的普遍性及其对健康的影响促使相关科学研究急剧增加，并于2021年达到历史最高水平。全球范围内，饮用水、空气污染及职业暴露中的重金属浓度已超过监管限值，砷、镉、汞、铬、铅及其他金属的暴露问题仍然严峻。目前对量化环境暴露水平和分析病理发展过程的新方法仍存在迫切需求1,2,3。
相反，医学领域已利用多种金属的物理化学性质进行临床治疗。以金属为基础的药物（metallodrugs）在药用方面具有悠久的历史，并对多种疾病表现出治疗活性，其中作为化疗药物的应用最为成功4。最著名的金属药物顺铂（cisplatin）是一种基于铂（Pt）的抗癌药物，被世界卫生组织（WHO）列为全球基本药物之一5。2010年，顺铂及其铂类衍生物在多种癌症治疗中的成功率高达90%，并应用于约50%的化疗方案中6,7,8。尽管铂类化疗药物取得了无可争议的成功，但其剂量限制性毒性推动了对其他金属类药物的研究，以实现更优化的生物递送和活性。在这些替代金属中，基于钌（Ru）的化合物已成为最受关注的一类9,10,11,12。
为了跟上金属药物和毒物动力学研究需求的增长速度，需要开发新的模型和方法。斑马鱼模型兼具复杂性和高通量优势，是一种繁殖力高的脊椎动物，其基因同源性与人类保守程度达70%13。该模型在药理学和毒理学研究中具有重要价值，已被广泛用于多种化合物的高通量筛选，以实现先导化合物发现、靶点鉴定及作用机制研究14,15,16,17。然而，化学物质的高通量筛选通常依赖于水相暴露方式。由于化合物在溶液中的理化性质（如光降解性、溶解度）可能影响其吸收程度，这在剂量传递与效应关联方面可能构成主要局限性。
为了克服这一局限性，以便与高等脊椎动物的剂量进行比较，本研究设计了一种方法，用于分析斑马鱼幼体组织中的痕量金属浓度。本文评估了顺铂及新型钌基抗癌化合物在致死和亚致死终点上的剂量-反应曲线。针对顺铂，在0、3.75、7.5、15、30和60 mg/L的名义浓度下评估了致死性和孵化延迟效应。通过ICPMS分析测定生物体组织中铂的积累量，各剂量组生物体的铂摄取量分别为每只0.05、8.7、23.5、59.9、193.2和461.9 ng（Pt）。此外，斑马鱼幼体还暴露于0、3.1、6.2、9.2、12.4 mg/L的PMC79。经实测，这些浓度分别含有0、0.17、0.44、0.66和0.76 mg/L的Ru。该方案还可区分滞留在幼体卵膜中的铂浓度与斑马鱼组织中的铂浓度。该方法能够为一种已确立的化疗药物与一种新型化合物之间的药代动力学和毒代动力学活性比较提供可靠且稳健的数据。该方法可广泛应用于多种金属及其金属基化合物的研究。

<table><tbody><tr><td>AB品系斑马鱼（&lt;em&gt;Danio rerio&lt;/em&gt;）</td><td>斑马鱼国际资源中心</td><td>野生型AB</td><td>野生型AB斑马鱼</td></tr><tr><td>ACS级硝酸</td><td>VWR BDH Chemicals</td><td>BDH3130-2.5LP</td><td>硝酸（68–70%）；用于配制10% HNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;酸浴溶液，用于浸泡/预清洗离心管</td></tr><tr><td>Aquatox鱼粮（薄片状）</td><td>Zeigler Bros, Inc.</td><td></td><td>薄片饲料，按Aquatox鱼粮与TetraMin热带薄片饲料1:4的比例混合后用作饲料</td></tr><tr><td>卤虫卵（丰年虾卵）</td><td>PentairAES</td><td>BS90</td><td>以15盎司真空罐装出售的丰年虾卵，需孵化后用作饲料</td></tr><tr><td>ASX-510 ICP-MS自动进样器</td><td>Teledyne CETAC</td><td></td><td>具有可编程XYZ运动、流动清洗站和0.3 mm内径探针的自动进样器。可与Nu AttoLab软件兼容，用于程序化批量分析。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>CL 2</td><td>Thermo Scientific CL 2型紧凑式台式离心机，转速可调，最高达5200 rpm；用于在微波消解间隔期间将样品和酸冷凝物沉降至离心管底部，有助于样品保留</td></tr><tr><td>离心管</td><td>VWR</td><td>21008-105</td><td>超高性能聚丙烯材质离心管，带平盖；容量15 mL；锥形底，防漏</td></tr><tr><td>A级透明玻璃螺口小瓶</td><td>Fisherbrand</td><td>03-339-25B</td><td>用于暴露实验的单个玻璃小瓶</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Millipore Sigma</td><td>D8418</td><td>疏水性化合物的溶剂或载体</td></tr><tr><td>固定转速涡旋混合器</td><td>VWR</td><td>10153-834</td><td>涡旋混合器；用于酸消解及稀释后样品的均质化</td></tr><tr><td>高纯度过氧化氢</td><td>Merk KGaA, EDM Millipore</td><td>1.07298.0250</td><td>Suprapur级过氧化氢（30%）；用于样品消解</td></tr><tr><td>高纯度硝酸</td><td>EDM Millipore</td><td>NX0408-2</td><td>Omni Trace Ultra级硝酸（69%）；用于样品消解</td></tr><tr><td>Instant Ocean海水盐</td><td>Spectrum Brands, Inc.</td><td>Instant Ocean&amp;reg; 海水盐</td><td>卵水溶液中含有Instant Ocean海水盐，终浓度为60 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Mars X微波消解系统</td><td>CEM, Matthews, NC</td><td></td><td>微波酸消解系统，用于在统一条件下对样品进行消解和均质化。本方法采用一次性聚丙烯离心管，在低功率（300 W）下完成敞口消解。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>多元素溶液3</td><td>SPEX CertiPREP</td><td>CLMS-3</td><td>含10 mg/L Au、Hf、Ir、Pd、Pt、Ru、Sb、Sr、Te、Sn，溶剂为10% HCl/1% HNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;；用作Pt和Ru分析的质量控制标准</td></tr><tr><td>Nu Instruments AttoM高分辨率电感耦合等离子体质谱仪（HR-ICP-MS）</td><td>Nu Instruments/Amatek</td><td></td><td>双聚焦磁扇区电感耦合等离子体质谱仪，配备灵活的低至高分辨率狭缝系统和动态范围检测器系统。数据处理与定量分析通过NuQuant配套软件完成。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>铂（Pt）标准溶液，NIST 3140</td><td>美国国家标准与技术研究院</td><td>3140</td><td>由安瓿瓶中含9.996 mg/g Pt（溶于10% HCl）的溶液配制而成；用作Pt分析的质量控制标准</td></tr><tr><td>铂（Pt）单元素标准溶液</td><td>High Purity Standards</td><td>100040-2</td><td>含1000 mg/L Pt，溶于5% HCl</td></tr><tr><td>钌（Ru）单元素标准溶液</td><td>High Purity Standards</td><td>100046-2</td><td>含1000 mg/L Ru，溶于2% HCl</td></tr><tr><td>TetraMin热带薄片饲料</td><td>Tetra</td><td>77101</td><td>薄片饲料，按Aquatox鱼粮与TetraMin热带薄片饲料1:4的比例混合后用作饲料</td></tr><tr><td>痕量金属级硝酸</td><td>VWR BDH Chemicals</td><td>87003-261</td><td>Aristar Plus级硝酸（67–70%）；用于ASX-510自动进样器的冲洗溶液</td></tr><tr><td>超声水浴</td><td>VWR</td><td>B2500A-DTH</td><td>超声水浴，用于微波消解前辅助酸消解</td></tr></tbody></table>

斑马鱼暴露于铂基和钌基化合物后通过电感耦合等离子体质谱法检测剂量摄取及其更广泛的应用

Dose Uptake of Platinum- and Ruthenium-based Compound Exposure in Zebrafish by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry with Broader Applications

金属及金属化合物是一类多样化的药理活性物质和具有毒理学意义的外源性物质。从重金属毒性到化学治疗药物，这些化合物的毒物代谢动力学在历史上和现代研究中均具有重要意义。斑马鱼已成为研究环境暴露和临床转化中药物代谢动力学与毒物代谢动力学的优选模式生物。尽管斑马鱼研究相比啮齿类动物模型具有通量更高的优势，但该模型仍存在若干重要局限性。
其中一个局限性源于水相给药方案本身。这些研究中的水相浓度无法外推以获得可靠的体内剂量。对金属化合物进行直接测量，可更好地关联化合物相关的分子和生物学反应。为了克服金属及金属化合物研究中的这一局限性，已开发出一种技术：在暴露后消化斑马鱼幼体组织，并通过电感耦合等离子体质谱法（ICPMS）定量组织样本中的金属浓度。
采用ICPMS方法测定斑马鱼组织中顺铂中的铂（Pt）以及多种新型钌（Ru）基化疗药物中的钌（Ru）的金属浓度。此外，本方案可区分幼鱼卵膜中蓄积的铂与斑马鱼组织中的铂浓度。结果表明，该方法可用于定量幼鱼组织中存在的金属剂量。此外，该方法可经调整后用于在多种暴露和给药研究中鉴定特定金属或金属化合物。

这些结果此前已发表24。组织摄取研究通过水相暴露顺铂和一种新型钌基抗癌化合物PMC79进行。评估了顺铂在0、3.75、7.5、15、30和60 mg/L等标称浓度下的致死效应和孵化延迟。通过ICPMS分析测定生物体组织中的铂（Pt）积累量，组织中相应的Pt剂量分别为每生物体0.05、8.7、23.5、59.9、193.2和461.9 ng（Pt）（图3）。由于顺铂具有已知的稳定性，未对顺铂的标称浓度进行实际分析测定。
在所有顺铂浓度下均观察到孵化延迟。针对铂浓度，额外开展了有无手工去壳膜的实验。去壳膜后，分别收集并分析了壳膜中的铂含量。用于去壳膜研究的非致死剂量顺铂实验结果表明，顺铂总给药量的93-96%累积在壳膜中，其余剂量存在于幼虫组织内（图4）。
斑马鱼幼...

斑马鱼中金属及金属化合物的药物毒物动力学分析速率提高，有利于环境与临床转化研究。通过采用电感耦合等离子体质谱法对消化后的斑马鱼组织进行痕量金属分析，克服了水生暴露吸收量未知的局限性。

金属及金属基化合物包含多种具有药理活性和毒理学特性的外源性物质。从重金属毒性到化学治疗药物，……

斑马鱼是一种具有吸引力的模式生物，但科学家尚不清楚该生物通过水生环境给药时吸收了多少物质。我们开发了一种在暴露后消化组织并通过电感耦合等离子体质谱法（ICPMS）定量金属含量的技术。该技术使我们能够利用ICPMS准确定量并验证剂量反应关系。该方法具有很大的潜力。可在动物模型中从细胞水平到整个器官系统水平施加药物或环境中的金属暴露。向15毫升聚丙烯离心管中加入约0.25毫升高纯度硝酸，用于处理最多10只幼虫。超声处理一小时以对样品进行预消化。进行超声处理时，在耐酸微波消解仪中采用短时间循环消化组织，每次间隔5分钟，直至所有组织明显被氧化，形成均匀的澄清黄色溶液。需密切监测管子的完整性，防止破裂，并在每个循环之间于离心机中进行短暂离心。当组织明显氧化后，在通风橱中加入6.75毫升高纯水，将样品稀释至3.5%硝酸浓度，并涡旋充分混匀。随后建立基质匹配的7点校准曲线，以校正可能存在的同量异位素干扰。使用水相认证元素标准储备液，取0.1毫升等分试样，用移液器转移至新的15毫升离心管中。用3.5%硝酸稀释至终体积10毫升，配制10十亿分之一（ppb）的标准溶液。使用10 ppb的储备液，在3.5%硝酸中进行系列稀释，配制0.1、1.0和5.0 ppb的标准溶液。使用0.1 ppb的储备液，在3.5%硝酸中进行系列稀释，配制0.001、0.005和0.01 ppb的标准溶液。然后，在准备ICPMS仪器进行样品分析之前，确保氩气阀门已打开，所有管路均已牢固连接且清洁，样品分析间隙使用5%硝酸冲洗管路和玻璃器皿。检查炬管和锥体的状况，并确保炬管箱已牢固扣紧。同时，确保雾化室排液管已正确连接至蠕动泵。打开软件，检查真空读数，并确保所有涡轮泵均以100%运行。在等离子体控制系统状态窗口中点击“START”以启动启动程序。打开等离子体泵和等离子体冷却器，放置雾化器并点燃等离子体。当状态窗口显示启动程序已完成时，等待等离子体点燃并稳定。此时，观察系统状态窗口上的绿色圆点，以确认所有电源均已开启。在菜单栏中，单击“控制”，然后从下拉菜单中选择“自动进样器”。输入装有5%硝酸的试管所对应的自动进样器架位，使酸进入等离子体。在菜单栏中，点击“Scans”，然后在下拉菜单中选择“Magnet”。在 MagnetScan 窗口中，将“Marker Mass Position”设置为 115，然后按回车键。在仪器预热期间，让磁体在质量范围内扫描 30 分钟。30分钟后，使用自动进样器控制将位置移至十亿分之一浓度的多元素调谐溶液。吸入调谐溶液并对仪器进行调谐以优化信号读数。在等离子体控制窗口中调整炬管的X、Y、Z坐标位置，使炬管与锥口中心对齐，并调节雾化器流量。在离子光学调谐窗口中对源、检测器和分析器进行必要的调整。信号读数优化后，单击磁扫描窗口中的“停止”按钮，单击“校准磁体”，并在弹出窗口中选择“低分辨率”。单击“确定”，然后打开质量校准 smc 文件以校准磁体。单击“保存并使用”以将当前磁体校准应用于分析。当测量浓度范围较大的未知样品时，需进行检测器校准，以比较低浓度下的离子脉冲计数信号与高浓度下衰减的离子信号。通过单击“数据采集”开始样品分析，然后在下拉菜单中单击“方法设置”。使用制造商提供的现有方法，或根据感兴趣的元素创建新方法。如有必要，调整分析模式、驻留时间、切换延迟、扫描次数和循环次数、分辨率、检测模式以及偏转器设置中的停泊质量。单击“保存”以记录方法设置。针对每种金属和同型对照优化参数。在菜单栏中，点击“数据采集”，然后在下拉菜单中点击“批量运行”。或者，单击菜单栏下方的 BATCH 图标，在批处理运行窗口中从电子表格导入批处理参数，或创建序列。输入样品类型、自动进样器样品架位置、转移时间、清洗时间、重复次数、样品编号和方法文件。按顺序安排批处理运行：先进行用于校准曲线的标准溶液，接着是质量控制标准品，最后是未知样品。每5至10个样品中加入一个0.5十亿分之一的质量控制标准品，以监测仪器漂移和样品重复性。组织摄取研究通过水相暴露顺铂和一种新型钌基抗癌化合物PMC79进行。针对顺铂的名义浓度评估了致死率和孵化延迟情况。0、3.75、7.5、15、30 和 60 毫克/升的顺铂。通过 ICPMS 分析测定生物组织中的铂积累量，生物组织中相应的铂含量分别为每生物体 0.05、8.7、23.5、59.9、193.2 和 461.9 纳克。在所有顺铂浓度下均观察到孵化延迟现象。去绒毛膜后，分别收集绒毛膜并单独分析其中的铂含量。用于去绒毛膜研究的顺铂非致死剂量结果显示，顺铂总给药量的93%至96%累积在绒毛膜中，其余部分存在于幼鱼组织内。斑马鱼幼体暴露于0、3.1、6.2、9.2和12.4毫克/升的PMC79中。这些浓度经分析测定分别含有 0、0.17、0.44、0.66 和 0.76 毫克/升的钌。与顺铂不同，在暴露于PMC79的幼体中未观察到孵化延迟现象。由于卵膜在幼体收集前已自然降解，因此未将其纳入钌含量分析。在每种浓度下分析的幼虫组织中的金属含量分别为每只幼虫0.19、0.41和0.68纳克钌。暴露实验方案中添加的任何试剂都可能产生同量异位素干扰。在可行的情况下，可考虑使用快速冷却等替代方法，而非三卡因（tricaine）。该方法可实现对高等脊椎动物中毒性、药效等实验的金属剂量进行定量比较。我们尤其感到兴奋的是，所确定的阈值剂量与给予患者的剂量处于同一数量级。

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