斑马鱼暴露于铂基和钌基化合物后通过电感耦合等离子体质谱法检测剂量摄取及其更广泛的应用

斑马鱼是一种具有吸引力的模式生物，但科学家尚不清楚该生物通过水生环境给药时吸收了多少物质。我们开发了一种在暴露后消化组织并通过电感耦合等离子体质谱法（ICPMS）定量金属含量的技术。该技术使我们能够利用ICPMS准确定量并验证剂量反应关系。

该方法具有很大的潜力。可在动物模型中从细胞水平到整个器官系统水平施加药物或环境中的金属暴露。向15毫升聚丙烯离心管中加入约0.25毫升高纯度硝酸，用于处理最多10只幼虫。

超声处理一小时以对样品进行预消化。进行超声处理时，在耐酸微波消解仪中采用短时间循环消化组织，每次间隔5分钟，直至所有组织明显被氧化，形成均匀的澄清黄色溶液。需密切监测管子的完整性，防止破裂，并在每个循环之间于离心机中进行短暂离心。

当组织明显氧化后，在通风橱中加入6.75毫升高纯水，将样品稀释至3.5%硝酸浓度，并涡旋充分混匀。随后建立基质匹配的7点校准曲线，以校正可能存在的同量异位素干扰。使用水相认证元素标准储备液，取0.1毫升等分试样，用移液器转移至新的15毫升离心管中。

用3.5%硝酸稀释至终体积10毫升，配制10十亿分之一（ppb）的标准溶液。使用10 ppb的储备液，在3.5%硝酸中进行系列稀释，配制0.1、1.0和5.0 ppb的标准溶液。使用0.1 ppb的储备液，在3.5%硝酸中进行系列稀释，配制0.001、0.005和0.01 ppb的标准溶液。

然后，在准备ICPMS仪器进行样品分析之前，确保氩气阀门已打开，所有管路均已牢固连接且清洁，样品分析间隙使用5%硝酸冲洗管路和玻璃器皿。检查炬管和锥体的状况，并确保炬管箱已牢固扣紧。同时，确保雾化室排液管已正确连接至蠕动泵。

打开软件，检查真空读数，并确保所有涡轮泵均以100%运行。在等离子体控制系统状态窗口中点击“START”以启动启动程序。打开等离子体泵和等离子体冷却器，放置雾化器并点燃等离子体。当状态窗口显示启动程序已完成时，等待等离子体点燃并稳定。

此时，观察系统状态窗口上的绿色圆点，以确认所有电源均已开启。在菜单栏中，单击“控制”，然后从下拉菜单中选择“自动进样器”。输入装有5%硝酸的试管所对应的自动进样器架位，使酸进入等离子体。

在菜单栏中，点击“Scans”，然后在下拉菜单中选择“Magnet”。在 MagnetScan 窗口中，将“Marker Mass Position”设置为 115，然后按回车键。在仪器预热期间，让磁体在质量范围内扫描 30 分钟。

30分钟后，使用自动进样器控制将位置移至十亿分之一浓度的多元素调谐溶液。吸入调谐溶液并对仪器进行调谐以优化信号读数。在等离子体控制窗口中调整炬管的X、Y、Z坐标位置，使炬管与锥口中心对齐，并调节雾化器流量。

在离子光学调谐窗口中对源、检测器和分析器进行必要的调整。信号读数优化后，单击磁扫描窗口中的“停止”按钮，单击“校准磁体”，并在弹出窗口中选择“低分辨率”。单击“确定”，然后打开质量校准 smc 文件以校准磁体。

单击“保存并使用”以将当前磁体校准应用于分析。当测量浓度范围较大的未知样品时，需进行检测器校准，以比较低浓度下的离子脉冲计数信号与高浓度下衰减的离子信号。通过单击“数据采集”开始样品分析，然后在下拉菜单中单击“方法设置”。

使用制造商提供的现有方法，或根据感兴趣的元素创建新方法。如有必要，调整分析模式、驻留时间、切换延迟、扫描次数和循环次数、分辨率、检测模式以及偏转器设置中的停泊质量。单击“保存”以记录方法设置。

针对每种金属和同型对照优化参数。在菜单栏中，点击“数据采集”，然后在下拉菜单中点击“批量运行”。

或者，单击菜单栏下方的 BATCH 图标，在批处理运行窗口中从电子表格导入批处理参数，或创建序列。输入样品类型、自动进样器样品架位置、转移时间、清洗时间、重复次数、样品编号和方法文件。按顺序安排批处理运行：先进行用于校准曲线的标准溶液，接着是质量控制标准品，最后是未知样品。

每5至10个样品中加入一个0.5十亿分之一的质量控制标准品，以监测仪器漂移和样品重复性。组织摄取研究通过水相暴露顺铂和一种新型钌基抗癌化合物PMC79进行。针对顺铂的名义浓度评估了致死率和孵化延迟情况。

0、3.75、7.5、15、30 和 60 毫克/升的顺铂。通过 ICPMS 分析测定生物组织中的铂积累量，生物组织中相应的铂含量分别为每生物体 0.05、8.7、23.5、59.9、193.2 和 461.9 纳克。在所有顺铂浓度下均观察到孵化延迟现象。

去绒毛膜后，分别收集绒毛膜并单独分析其中的铂含量。用于去绒毛膜研究的顺铂非致死剂量结果显示，顺铂总给药量的93%至96%累积在绒毛膜中，其余部分存在于幼鱼组织内。斑马鱼幼体暴露于0、3.1、6.2、9.2和12.4毫克/升的PMC79中。

这些浓度经分析测定分别含有 0、0.17、0.44、0.66 和 0.76 毫克/升的钌。与顺铂不同，在暴露于PMC79的幼体中未观察到孵化延迟现象。由于卵膜在幼体收集前已自然降解，因此未将其纳入钌含量分析。

在每种浓度下分析的幼虫组织中的金属含量分别为每只幼虫0.19、0.41和0.68纳克钌。暴露实验方案中添加的任何试剂都可能产生同量异位素干扰。在可行的情况下，可考虑使用快速冷却等替代方法，而非三卡因（tricaine）。

该方法可实现对高等脊椎动物中毒性、药效等实验的金属剂量进行定量比较。我们尤其感到兴奋的是，所确定的阈值剂量与给予患者的剂量处于同一数量级。