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方法文章

测量多种细菌的迁移与生物膜形成

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DOI：

10.3791/63595

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2022年5月2日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Southern University of Science and Technology, 2Desa Mahkota Form Six College, Ministry of Education Malaysia, 3Department of Critical Care Medicine, The Second Affiliated Hospital School of Medicine, Southern University of Science and Technology

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于分离和鉴定宿主内微生物的实用方法。通过该方法，可清晰描述微生物的理化特性及其在宿主内的可能生存方式。

摘要

由于在宿主体内生长的微生物通常具有促进其存活的适应能力，因此对这些微生物进行分类和鉴定的方法将有助于其特性表征。目前大多数研究仅关注某一种特定的表征方法；然而，从宿主体内分离和鉴定微生物是一个连续的过程，通常需要多种组合表征方法。本文介绍了用于鉴定微生物生物膜形成能力、微生物呼吸状态及其趋化行为的方法。这些方法被用于鉴定五种微生物，其中三种分离自Sprague-Dawley（SD）大鼠的骨组织（Corynebacterium stationis、Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus 和 Enterococcus faecalis），另外两种来自美国典型培养物保藏中心（ATCC）——Staphylococcus aureus ATCC 25923 和 Enterococcus faecalis V583。从SD大鼠骨组织中分离的微生物均为革兰氏阳性菌。这些微生物已适应在骨基质中具有应激性和营养受限的环境中生长。本文旨在为读者提供在实验室条件下确定分离微生物特性和行为的具体技术方法。

引言

人体作为哺乳动物宿主，含有大量微生物。这些微生物广泛分布于宿主的口腔、消化道、肠道和血液中，对宿主健康产生不同影响。口腔中栖息着多种多样的微生物，可调节宿主对感染的易感性。例如，某些微生物如 链球菌 例如， S. mitis/oralis, S. pseudopneumoniae，以及 S. infantis）和 普雷沃氏菌属 spp. 定植于口腔，在舌面形成多物种生物膜，导致口臭，并作为微生物感染的储存库。这些病原体可通过侵入将牙根固定于颌骨中的牙周韧带，进而感染颌骨1从宿主体内分离出的这些微生物的鉴定通常是一个繁琐的过程，尤其是当微生物表现出需要特定处理和培养条件的个体特征时。例如，某些病原性微生物 幽门螺杆菌，艰难梭菌 和 具核梭杆菌在肠道严苛的环境中生存的微生物具有特定的氧气、营养和生长需求，这给其表征过程带来了挑战，尤其是在研究这些微生物的致病性时。因此，科学家和医学工作者亟需一种标准化的方法来分离和研究这些微生物，以推动新型医学治疗手段的开发。

本实验方案利用在大鼠骨基质中生长的微生物。传统上，除颌骨（作为骨骼系统的特例）外，一般认为宿主健康的骨骼是无菌环境；由于牙齿的存在，颌骨的骨基质比其他骨骼更易受到感染1。然而，研究发现微生物可通过肠壁进入体循环，最终影响骨矿化过程2。作为概念验证，我们采用本方案对健康SD大鼠股骨和胫骨中分离的微生物（Corynebacterium stationis、Staphylococcus cohnii subsp. 和 Enterococcus faecalis）进行生化特性表征。由于骨骼是一个封闭且缺氧的环境，从骨骼中分离和表征这些微生物具有较大挑战性。已有多种文献详细描述了研究此类微生物的方法，但能够提供完整流程以鉴定宿主来源微生物的报道仍较为罕见。

在建立适当的培养条件时，需要通过使用流体硫乙醇酸盐培养基（FTM）来了解微生物的氧气需求。具有不同氧气需求的微生物会在透明的FTM液体中形成分层结构3。根据分层特征，可进一步研究微生物细胞的生长情况。在FTM液体表面生长旺盛的微生物为专性需氧菌，而在底部生长的微生物为专性厌氧菌。在FTM液体中呈悬浮状态生长的微生物则属于兼性厌氧菌或耐氧厌氧菌。通过观察微生物细胞的指数生长期，可确定其生长速率。随后将生长特征与微生物的生物膜形成能力进行比较。生物膜通常由多种微生物组成，它们之间会直接或间接地影响彼此的生理状态。在此过程中，微生物群落间的有益相互作用促进了细胞的附着，形成有利于主动互惠关系演化的空间结构。例如，Paenibacillus amylolyticus 与 Xanthomonas retroflexus 在静态环境中共培养时表现出兼性共生关系，从而促进生物膜的快速形成13。微生物通过形成生物膜以适应宿主组织，实现长期定植，同时保护自身免受恶劣环境的影响并逃避免疫系统的攻击4,5,6,7。生物膜通常为致密的多层结构，有助于微生物抵抗外界亚致死性刺激；例如，牙髓中的 E. faecalis 在接触低于抑制浓度的四环素和万古霉素时，会增强生物膜的形成，从而提高其对抗生素的耐受性8。

趋化性使微生物能够根据化学梯度进行移动，这种信号通路在多种致病菌中广泛存在。一些致病性微生物在化学信号的引导下迁移到特定部位，从而引发感染性疾病14。例如，Xanthomonas spp. 在宿主中表达19种趋化受体和11种鞭毛蛋白，触发细菌黏附并最终导致溃疡形成15。细菌中还存在某些特定蛋白（如果胶结合蛋白），可引导细菌向营养物质定向迁移，从而促进其更优生长16。这对于可能存在于贫营养环境中的细菌尤为重要。微生物细胞通常依赖趋化运动趋向有利于生长的环境，同时避开有害的捕食细胞和损害细胞活力的毒素。在已有软琼脂方法测定趋化性的基础上，我们开发了一种可扩散的方法，用于建立化学引诱物梯度，以检测微生物的趋化性。

本文描述了利用以下方法测定细菌的生长条件、生物膜形成及化学趋向性的实验方案 棒状杆菌属星状种，科氏葡萄球菌，粪肠球菌，金黄色葡萄球菌 ATCC 25923，以及 Enterococcus faecalis V583 作为示例（参见 图1）。微生物生长条件的优化采用FTM来确定该微生物的氧气需求，而生物膜形成则使用玻璃表面作为固体支撑，生物膜量通过结晶紫染色进行反染。该微生物的化学趋向性依赖于其趋化行为，通过3D打印（补充图 S1），采用标准化方法在软琼脂基质中为趋化因子生成化学储库（补充图 S2).

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方案

注意：有关本实验方案中使用的所有材料和设备的详细信息，请参见材料表。请采用无菌技术操作，避免污染。

1. 细菌复苏以获得单菌落

  1. 制备固体琼脂平板。
    1. 制备含琼脂的 terrific broth（TB）培养基，每升液体中含有 11.8 g 胰蛋白胨、23.6 g 酵母提取物、9.4 g K2HPO4、2.2 g KH2PO4 和 15 g 琼脂，pH = 7。
    2. 使用透气瓶盖或带通气孔的封口膜，在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。
    3. 在液体冷却并凝固之前，将含琼脂的 TB 培养基以每皿 25 mL 的体积倒入 10 cm 塑料培养皿中。
      注意：培养基温度低于 60 °C 时会开始凝固，因此应在凝固前完成倾注。操作过程中采用无菌技术以防止污染。
  2. 细菌接种至平板
    1. 从 −80 °C 取出目标菌株，在生物安全柜中室温解冻。
    2. 使用 10 µL 移液器吸取 10 µL 菌液，通过划线法将其均匀涂布于 TB 平板上。
    3. 密封平板以防止污染，将平板置于 37 °C 生化培养箱中培养。约 24 小时后肉眼观察菌落生长情况，挑取单菌落并通过 PCR 扩增验证其是否为单一菌种。

2. 细菌液体培养至对数生长期

  1. 准备液体培养基。
    1. 参照步骤 1.1.1 中固体琼脂平板的制备方法，配制 1 L TB 液体培养基，其中包含 11.8 g 胰蛋白胨、23.6 g 酵母提取物、9.4 g K2HPO4 和 2.2 g KH2PO4，pH 约为 7。
      注意：不要添加琼脂。细菌在液体营养环境中生长更快。
    2. 使用透气瓶盖或带通气孔的封口膜密封，于 121 °C 高压灭菌 20 分钟。
    3. 将液体培养基在 4 °C 下保存。
  2. 细菌接种与培养
    1. 在生物安全柜中，用接种环或 10 µL 移液器挑取单菌落，接种至已准备好的 TB 液体培养基的锥形瓶中。
    2. 用纱布密封锥形瓶，并置于 37 °C 摇床（200 rpm）中培养细菌。
      ​注意：液体培养基在约 5 小时内逐渐变浑浊；浑浊所需时间因细菌种类而异。

3. FTM 实验与生长曲线测定

  1. 流体硫乙醇酸盐培养基（FTM）的制备
    1. 制备巯基乙酸盐培养基（TM），每升含有胰蛋白胨 15 g、酵母提取物 5 g、葡萄糖 5 g、L-半胱氨酸 0.5 g、巯基乙酸钠 0.5 g、氯化钠 2.5 g、刃天青 0.001 g 和琼脂 0.75 g。
      注意：市售固体培养基可直接加水重悬，并进行灭菌（步骤 3.1.2）。
    2. 称取29.3 g硫乙醇酸盐培养基粉末，加入1 L蒸馏水，加热并搅拌至完全溶解，直至溶液变为粉红色。
    3. 向带密封塞的试管中加入 TM（19 mL）。密封后，使用带通气孔的透气瓶盖或封口膜，在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。
      注意：加热后，溶液变为浅黄色。
  2. 细菌的接种、培养与观察
    1. 在液体TB培养基中制备菌液，使其生长至OD值为0.6–0.8（见步骤2.2）。
    2. 在生物安全柜内无菌条件下打开试管密封塞，尽快向含有FTM的试管中加入1 mL细菌培养物，并立即重新密封试管。
    3. 轻轻振荡试管，确保细菌在液体中均匀分布，然后将试管置于37 °C条件下静置培养。
    4. 孵育48小时后，观察不同细菌在各试管FTM中的生长情况，并拍照记录。
  3. 有氧条件下生长曲线的测定
    1. 制备初始菌液至合适的OD值（见步骤2.2），并将细菌培养至对数生长期。
      注意： 棒状杆菌属 stationis，科氏葡萄球菌，粪肠球菌，金黄色葡萄球菌 ATCC 25923，以及 粪肠球菌 本方案中使用的V583菌株约需5小时达到对数生长期。
    2. 将200 µL来自步骤3.3.1的TB液体培养基中的细菌培养物以每组三个复孔的方式加入96孔板的各孔中。使用酶标仪测定600 nm处的OD值，并将不同细菌培养物进行稀释，使含不同细菌的孔与TB液体培养基（空白）之间的OD差值控制在0.01至0.02之间。
    3. 取一个新的96孔板，加入TB培养基，将3.3.2步骤中不同稀释度的细菌培养物以每组三个重复的方式转移至孔板中，并置于超净工作台内。
    4. 用封板膜密封96孔板，放入酶标仪中，并按如下程序设置：
      1. 设定 温度 到 37 °C ± 0.5.
      2. 设置 动力学循环 总共 60 个循环，每个用于 30 min.
      3. 设置 吸光度 到 600 nm.
      4. 设置 振荡 到 1,600 s 在一个循环中。
      5. 运行程序，并在生长曲线达到平台期时停止。
  4. 厌氧条件下生长曲线的测定
    1. 按照步骤3.3操作，但在用封板膜密封前，将含有TB培养基和细菌悬液的96孔板置于厌氧培养箱中。用氮气对厌氧箱进行抽气和充气，以将氧气浓度降低至 <3%。用封板膜密封96孔板，并将其置于厌氧箱中。

4. 生物膜形成能力检测

  1. 将细菌在液体培养基中培养至对数生长期。
    1. 参照第2节，将细菌接种于TB液体培养基中。
    2. 在37 °C条件下，于摇床中过夜培养细菌，确保菌液的OD600值介于0.6至0.8之间。
  2. 将菌液分组，并在不同条件下进行培养。
    1. 当菌液的OD600值达到0.6至0.8时，取10 mL该菌悬液加入玻璃试管中。
    2. 将每份菌液分为两组：有氧组和厌氧组，所有操作均设三个重复。
      1. 对于有氧组，用锡箔纸包裹含有菌悬液的试管，并将其置于37 °C恒温水浴中培养。
      2. 对于厌氧组，用锡箔纸包裹含有菌悬液的试管，转移至厌氧培养箱中。在厌氧培养箱内去除锡箔纸，通过抽气并充入氮气将培养箱内氧气浓度降低至<3%。用磨砂玻璃塞密封试管，取出后置于37 °C水浴中培养。
    3. 每隔6小时，从两组（有氧/厌氧）中各取出三支试管，观察底部生物膜的生长情况，并按步骤4.3进行染色。
  3. 弃去菌悬液并干燥生物膜。
    1. 在不同时间点取出试管，小心吸除上层菌悬液。观察附着在试管底部的白色生物膜。
      注：吸除菌悬液时注意不要扰动生物膜。
    2. 沿试管壁小心加入2 mL磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻振荡以洗去吸附在生物膜上的浮游细菌，再小心吸除PBS缓冲液。
    3. 将底部附有生物膜的试管放入烘箱中干燥30分钟。
  4. 染色
    1. 取出试管，向每支试管中加入2 mL 0.1%结晶紫染色液，在室温下染色30分钟。
    2. 用移液器小心吸除结晶紫染液。沿试管壁小心加入蒸馏水冲洗残留的结晶紫染液，重复3至5次，直至加入的蒸馏水几乎无色。观察试管底部的紫色生物膜。
    3. 再次将试管干燥。
  5. 用95%乙醇溶解生物膜，并测定生物膜溶液的OD600值。
    1. 取出干燥后的试管，向每支试管中加入10 mL 95%乙醇，充分振荡，确保结晶紫完全溶解于乙醇中。
    2. 每孔200 µL，将含结晶紫的乙醇溶液加入96孔板中，在600 nm波长下测定其吸光度。
      ​注：根据朗伯-比尔定律，吸光度与溶液浓度呈线性关系，因此OD600值可反映结晶紫的浓度，进而反映不同时间点菌悬液中生物膜的量。

5. 细菌趋化性实验

  1. 制备差异富营养琼脂平板。
    1. 参考步骤1制备含0.5%琼脂的半剂量MH培养基，每升含有11.8 g胰蛋白胨、23.6 g酵母提取物、9.4 g K2HPO4、2.2 g KH2PO4和5 g琼脂，pH值约为7。
    2. 参考步骤1制备含0.5%琼脂的5倍TB培养基，每升含有59 g胰蛋白胨、118 g酵母提取物、47 g K2HPO4、11 g KH2PO4和5 g琼脂，pH值约为7。
    3. 使用透气瓶盖或带通气孔的封口膜，在121 °C条件下高压灭菌20分钟。
    4. 在液体冷却凝固前，每块平板倒入25 mL半剂量MH肉汤（含0.5%琼脂），用3D打印的盖子盖住平板，并置于生物安全柜中。冷却后取下盖子，观察半固体培养基中的圆柱形孔（直径1.4 cm）。
      ​注意：树脂材料制成的3D打印盖子不能使用高温蒸汽灭菌。为杀灭表面细菌，可用95%乙醇喷洒后，在生物安全柜中用紫外灯照射30分钟。取下盖子时，应沿垂直方向施力，小心提起，避免损坏半固体琼脂。
    5. 在5倍TB肉汤（含0.5%琼脂）凝固前，使用移液器将TB肉汤加入半固体平板的孔中，直至肉汤液面与培养基表面齐平。
    6. 将平板置于生物安全柜中冷却，获得含富营养体的半固体琼脂平板。注意避免环境微生物污染平板。
      注意：半固体培养基仍具有一定流动性，因此必须完全冷却后才能倒置存放。
  2. 细菌接种、培养与拍照
    1. 将含半固体培养基的琼脂平板置于生物安全柜中，在紫外照射下冷却约30分钟，以防止细菌污染。
    2. 使用10 µL移液器吸取4 µL OD值约为0.6–0.8的细菌悬液，将移液器吸头插入塑料培养皿中心，缓慢释放细菌悬液。
    3. 等待细菌悬液被培养基吸收1分钟。待悬液完全吸收后，将平板分为两组（需氧/厌氧），每组设三个重复。
    4. 用封口膜密封需氧组，将平板倒置放入37 °C生化培养箱中静置培养。将厌氧组按步骤4.2所述方法密封于厌氧箱中，并在37 °C倒置培养。
    5. 每隔12小时（0 h、12 h、24 h、36 h和48 h）观察细菌的扩散与迁移情况，并使用成像系统拍摄平板图像。
  3. 使用ImageJ软件计算细菌迁移距离。
    1. 导入使用成像系统获取的图像文件。
    2. 设置比例尺并应用于所有图像。
      1. 拍摄图像时加入标尺，创建一条线段，选择直线段（例如1 cm），将该线段长度设为1 cm，并标记板上长度。
      2. 打开Set Scale窗口；点击Analyze | Set Scale。
      3. 在Known distance和Unit of length中输入实际长度。
      4. 勾选Global。
      5. 输入原始图像的文件夹地址和输出文件地址。
    3. 使用直线工具逐一选择菌落，并调整容差，使直线工具的线段贴合细菌菌落向两侧延伸的边界。
    4. 分别测量菌落从中心到两端的迁移距离，并通过点击Analyze | Measure获得直线长度。
    5. 重复步骤5.3.3–5.3.4，直至完成所有菌落的测量，并将结果保存为.csv文件以供进一步分析。

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结果

本研究描述了对宿主微生物组中分离出的微生物进行表征所采用的方法图1）。作为概念验证，从SD大鼠宿主中分离出三种微生物（C. stationis，S. cohnii 和 E. faecalis），以及两种 commercially 获得的微生物（S. aureus ATCC 25923 和 E. faecalis V583) 使用该方案测试了这些微生物。为了利用FTM确定单个微生物的氧气需求，我们添加了两种对照生物体，一种专性厌氧菌（具核梭杆菌 ATCC 25586）和一种兼性厌氧菌（铜绿假单胞菌 PAO1）。结果表明，所测试的五种微生物均为兼性厌氧菌（图2A)，与先前报道的这些微生物的特征一致11为了阐明其对氧气的需求，将微生物在有氧和无氧条件下进行培养。所有测试的微生物在有氧和无氧条件下均表现出S形生长曲线；然而，微生物密度（以OD值表示）

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讨论

我们通过连续的方法分离并鉴定了五种细菌。细菌的生长对营养需求极低：最低培养基是指仅含有无机盐、碳源和水的培养基。尽管实验组中的细菌是在MH固体平板上发现的，但我们使用半剂量MH培养基验证了细菌的趋化性，并取得了良好的结果。同时，我们也使用最低培养基进行了对照实验。实验中采用了M9基础培养基（其成分和含量见表1），而营养琼脂块仍使用5x TB琼脂。实验结果如补充图S3所示。尽管这些细菌（除E. faecalis外）在M9培养基中生长缓慢且运动缓慢，但在这些实验中仍表现出总体相似的趋势（即趋向于向营养琼脂生长）。然而，E. faecalis V583在M9最低培养基中无法生长，可能是由于M9培养基中缺乏E. faecalis生长所需的某些组分。因此，我们建议使用半剂量MH培养基作为营养缺乏的基质，以模拟细菌在营养缺乏条件下的生长和迁移情况。这也有利于使用ImageJ软件测量细菌趋向迁移的距离。

生物膜通常被定义为与表面相关的微生物群落，是微生物重要的生存策略。例如<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本技术的开发得到了中国国家自然科学基金国际青年科学家研究基金（22050410270）、深圳市海外高层次人才孔雀团队创新创业专项资金（KQTD20170810111314625）以及广东省创新创业研究团队项目（2019ZT08Y191）的资助。我们衷心感谢陈欣怡女士在文档校对和实验室管理方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
化学试剂/溶液
1% 结晶紫染色液SolarbioG1062100 mL
琼脂Sigma-AldrichV900500用于制备半固体培养基，20 g
离心管Corning43079015 mL
液体硫乙醇酸盐培养基KinghuntK000129.3 g
MHⅡ肉汤培养基（Mueller Hinton II Broth medium）SolarbioNO.11865100 g
培养皿BkmanB-SLPYM90-15塑料培养皿，圆形，90 mm × 15 mm
氯化钾VETECWXBC4493V0.2 g
磷酸二氢钾aladdin04-11-77580.24 g
氯化钠MacklinS8052758.0 g
磷酸氢二钠aladdin7558-79-41.44 g
优质肉汤培养基（Terrific Broth medium）SolarbioLA2520200 g
试剂盒/仪器
厌氧培养箱Longyue
生化培养箱Blue pardLRH-70
酶标仪Spark
Tanon 5200multi 成像系统Tanon5200CE
恒温水浴箱JinghongDK-S28

参考文献

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