使用Sigma公司的Extract-N-Amp组织PCR试剂盒快速对小鼠组织进行基因分型

您好，我叫Linda，我在加州大学欧文分校Edwin Niki博士的实验室工作。今天我将向您展示如何使用Stigma的Cyber Green提取组织PCR试剂盒，快速对转基因小鼠进行基因分型。通常情况下，当我在进行急性分离细胞培养时，会使用该试剂盒对胚胎小鼠进行基因分型，以便快速确定小鼠的基因型。

但就今天的目的而言，我们准备了成年小鼠的尾组织，以便向您展示我如何使用该试剂盒。本实验方案包括快速蛋白酶消化和DNA提取，随后进行快速中和步骤。我们提取的DNA将用于实时PCR，以监测PCR扩增产物。

那么，如果你已准备就绪，我们就正式开始。在开始之前，我们需要确保热块仪已预热至 95 °C，SYBR Green 染料已经解冻并置于冰上保存，直到使用时取出，其他试剂也正在室温下解冻。在我的冰桶中，放有即将用于基因分型的两种引物，它们是针对我们的目标基因特异性设计的，并已验证适用于 qPCR。

我还准备了目的基因的阳性对照和阴性对照，以及一份已从成年小鼠采集的组织样本。现在，当你采集组织样本时，必须非常严格。我们在采集小鼠胚胎尾组织时，每次采集前以及每次采集之间，都会先用70%乙醇冲洗镊子。

我们总是先用 TBS 清洗尾部样本，你需要为每份尾部样本配制组织预处理和 DNA 提取的混合液。每份样本需要 100 微升提取液和 25 微升组织预处理液。我将使用 P200 移液器和带滤芯的吸头，向一个新的 eppendorf 管中加入 100 微升提取液和 25 微升组织预处理液。你需要通过上下吹打来混匀你的混合液。

因此，您需要将125 µL的主混合液加入到您感兴趣的样本中，并确保如果样本为成年小鼠尾部，则切割端完全浸没在主混合液中，可用手指轻轻涡旋混匀，然后在室温下孵育10分钟。在10分钟孵育期间，我将配制我常用的绿色主混合液，其中包括试剂盒提供的Cider Green主混合液、超纯水（milli Q水）或PCR级水，以及我们的引物，包括一些PCR级水、上游引物（forward primer）和下游引物（reverse primer）。就这样。

10分钟孵育结束后，需在95摄氏度加热并激活反应3分钟。3分钟的灭活步骤完成后，现在加入试剂盒中提供的中和溶液，每反应加入100 µL，并通过涡旋振荡充分混匀。加入中和缓冲液后，DNA样本可保存在4摄氏度，直至准备使用。

我们实际上希望立即获得基因型。因此，我们直接进入qPCR步骤，我的尾部组织已中和并准备就绪。我的SYBR Green PCR预混液已准备好，PCR管也已在冷块上放置完毕。

我现在要做的就是向每个孔中加入 16 µL 的主混合液，然后向每个孔中加入 4 µL 的中和后提取物，或 4 µL 的阳性或阴性对照。实际上，我只是向每个孔中加入 16 µL 的主混合液。随后，我将向孔中 60 µL 的主混合液加入 4 µL 的中和后提取物，最终反应体系总体积为 20 µL。

对于阳性和阴性对照，我也将进行相同的操作：向16微升的PPR预混液中加入4微升。所有样品加样完毕后，可用光学透明的八联管盖条进行封盖。

操作时需注意不要触碰覆盖在样品上的盖帽的光学透明部分。因此，我使用无尘纸按压盖帽，以确保其密封。接下来，我已轻轻涡旋混匀PCR和DNA混合物，并进行离心，现在可以将样品放入QPCR仪中了。

我们将首先把样品加入Opticon PCR仪中，并新建一个孔板设置，其中第一个孔为我们的样品，第二个孔为阳性对照，第三个孔为阴性对照。反应体系总体积为20 µL。接下来，我将加载一个专为快速基因分型设计的程序。

本方案包括一个三分钟的变性步骤，随后进行循环：15 秒变性、15 秒退火，然后 20 秒延伸。实际上，延伸时间可缩短至约 10 秒，从而使每个循环总时长仅为 40 秒。每个循环的这三个步骤共重复约 40 次，类似于常规 PCR，最后进行熔解曲线分析。

现在我们已经准备好了反应板，并加载了实验程序。接下来只需运行QPCR，程序将从3分钟的变性步骤开始。根据我的经验，使用我当前的引物、尾部样本以及我所检测的目标基因，我知道阳性信号大约会在第25个循环左右出现，即跨越显著性的循环阈值。

现在，出现交叉点的时间高度依赖于您的组织样本类型、检测目标以及初始存在的DNA含量。因此，我们已经可以看到阳性对照出现了扩增曲线，而我们的样本看起来也是阳性。如您所见，它在阳性对照之后稍晚一点也开始出现上升趋势。

我们仍然需要继续等待，因为目前只有 27 个循环，但希望再经过几个循环后，我们就能确定样本确实是阳性，之后我就可以继续进行我的实验。此时，你可以看到阴性对照刚开始出现信号，这是因为我在操作中取用了过量的尾部组织。这有助于确认：任何早于这个过量阴性尾部样本出现的信号都应为阳性结果。

因此，在此时，任何在阴性对照之前出现的信号，我都视为阳性，并继续进行我的实验。PCR 完成扩增循环后，仪器会进行熔解曲线分析。这将帮助你确定扩增产物的组成和纯度。

通过这一点，可以判断您是否正确选择了阳性与阴性样本。例如，阳性样本会显示出一个特定的、尖锐的熔解温度峰，对应于在 PCR 过程中扩增出的特定 PCR 产物。而任何阴性样本则会呈现出非特异性的、宽泛的熔解温度峰，对应于 PCR 扩增过程中产生的非特异性 DNA。

我刚刚向您展示了如何使用Sigma的Cyber Green提取试剂快速对成年小鼠尾部进行基因分型。但该试剂盒也可用于多种动物组织、毛发、唾液，我用它对小鼠胚胎尾部进行基因分型。我们喜欢使用该试剂盒的原因在于其快速高效。

我可以在一小时内获得我的基因型结果，而且操作非常方便、简单。感谢观看，祝您好运。