Name: 从哺乳动物细胞中纯化泛素化p53蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学习从哺乳动物细胞中纯化泛素化p53蛋白的方法，该方法通过转染和免疫沉淀技术保留泛素连接模式，为研究蛋白质功能调控中的泛素化作用提供可靠实验方案。

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本工作由国家自然科学基金（81972624）向 D.L. 提供资助。

注意：H1299 细胞由中科院干细胞库惠赠，并已证实无支原体污染。
1. 细胞培养
<ol>
	<li>初次培养时，将1 × 106个人类肺腺癌细胞系H1299细胞接种于一个10 cm培养皿中，加入10–12 mL RPMI 1640培养基，培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、1%谷氨酰胺添加剂、1%丙酮酸钠以及抗生素（100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素）。将细胞置于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中培养。根据细胞生长情况，当细胞融合度达到80%–90%时，每2–3天传代一次。</li>
	<li>转染前一天，为三个10 cm培养皿准备6–9 × 106个细胞，将2–3 × 106个细胞接种至单个含10–12 mL培养基的10 cm培养皿中，使转染时细胞融合度达到70%–90%。 
	&#8203;注意：由于HEK293T细胞具有较高的转染效率和蛋白表达水平，也可用于纯化泛素化蛋白。</li>
</ol>
2. 质粒转染
<ol>
	<li>在三个15 mL离心管中各加入1.5 mL低血清培养基。</li>
	<li>将用于转染的质粒DNA分别加入各管中，配制如下稀释液：1号管：1 µg Flag-p53质粒，12 µg空载体；2号管：1 µg Flag-p53质粒，3 µg His-HA-Ub（HH-Ub）质粒，9 µg空载体；3号管：1 µg Flag-p53质粒，3 µg HH-Ub质粒，9 µg Mdm2质粒。每管中均加入总共0.2 µg绿色荧光蛋白（GFP）质粒，以监测转染效率。 
	注意：应先进行预实验，以确定在细胞中实现目标蛋白高效表达所需的质粒最佳用量。</li>
	<li>在另一离心管中，将78 µL脂质体转染试剂加入4.5 mL低血清培养基中以稀释脂质体。通过轻弹管壁充分混匀，并在室温（RT）下静置5分钟。</li>
	<li>将1.5 mL稀释后的脂质体溶液分别加入步骤2.2中含1.5 mL稀释DNA溶液的各管中。充分混匀，并在室温下使质粒与脂质体交联至少20分钟。每次转染的质粒DNA与脂质体比例为1:2（µg:µL）。</li>
	<li>弃去培养皿中的原培养基，每皿加入9 mL低血清培养基。向每皿中加入3 mL脂质体-DNA混合物，并通过轻轻前后晃动培养板3次，再左右晃动3次，使混合物在培养皿中均匀分布。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中培养。转染4–6小时后更换培养基，并继续培养24–36小时。</li>
</ol>
3. 细胞收集
<ol>
	<li>培养24-36小时后，用MG132处理细胞，终浓度为10 µM，处理4-6小时。 
	注意：MG132是一种肽醛类化合物，可有效抑制26S蛋白酶体复合物的蛋白水解活性。经MG132或其他蛋白酶体抑制剂处理后，细胞中通过赖氨酸-48（K48）连接的多聚泛素链泛素化的蛋白水平会升高。</li>
	<li>弃去培养基，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞2次（注意避免冲走细胞），并用血清移液管吸出细胞。</li>
	<li>向培养皿中加入1 mL PBS，用洁净的细胞刮棒刮下细胞，将细胞悬液转移至微量离心管中。在700 × g 条件下离心5分钟，收集细胞沉淀。</li>
</ol>
4. 非变性条件下泛素化蛋白的纯化
<ol>
	<li>使用前，将蛋白酶抑制剂混合物新鲜加入 Flag 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl (pH 7.9)、137 mM NaCl、10 mM NaF、1 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)、1% Triton X-100、0.2% sarkosyl 和 10% 甘油）中。</li>
	<li>向每管细胞中加入 800 µL 冰冷的 Flag 裂解缓冲液，使用涡旋振荡器或移液枪混匀细胞，然后在 4 °C 下于旋转仪上孵育 30 分钟。</li>
	<li>将混合物进行 5–10 次短暂超声处理。在冰上以 20 kHz 频率和 80% 振幅进行超声，每次脉冲持续 1 秒。随后将混合物在 4 °C 下以 40 转/分钟 (rpm) 在旋转仪上孵育 30 分钟。</li>
	<li>将超声处理后的样品在 4 °C 下以 8,000 × g 离心 20–30 分钟。将上清液转移至新的微量离心管中。</li>
	<li>取 80 µL（1/10）细胞提取物，加入 20 µL 5× 十二烷基硫酸钠 (SDS) 上样缓冲液。在 98 °C 下煮沸 5 分钟，冰上冷却 2 分钟，然后储存于 -20 °C 待用。将这些样品作为输入组以监测蛋白表达水平。</li>
	<li>向剩余的细胞提取物中加入 30 µL 抗 Flag M2 抗体偶联（Flag/M2）磁珠，在 4 °C 下旋转孵育至少 4 小时或过夜。</li>
	<li>在 4 °C 下以 1,500 × g 离心 2 分钟以收集磁珠。向磁珠中加入 1 mL 冰冷的 Flag 裂解缓冲液，并通过反复倒置试管数次进行混匀。</li>
	<li>在 4 °C 下以 1,500 × g 离心 2 分钟以收集磁珠。重复步骤 4.7 共 4–6 次。</li>
	<li>向磁珠中加入 40 µL Flag 多肽，终浓度为 200 ng/µL，在 4 °C 下旋转孵育 2 小时，以洗脱结合的蛋白。</li>
	<li>在 4 °C 下以 1,500 × g 离心 5 分钟。将上清液转移至新的微量离心管中。</li>
	<li>加入 10 µL 5× SDS 上样缓冲液，在 98 °C 下煮沸 5 分钟，冰上冷却 2 分钟，储存于 -20 °C 用于 Western 印迹分析。或者，可将步骤 4.10 所得洗脱液直接储存于 -80 °C，用于其他下游实验。 
	&#8203;注：可通过增加转染质粒的细胞数量和用量来放大纯化的泛素化蛋白产量。可采用表位标签策略，在天然纯化条件下纯化特异性结合泛素化 p53 的细胞复合物。通过共表达 Flag-p53、mdm2 和 HA-泛素，可在哺乳动物细胞中利用连续的 Flag 和 HA 抗体偶联琼脂糖对泛素化 p53 蛋白复合物进行免疫沉淀。为保留泛素化 p53 蛋白的结合伙伴，纯化过程中应使用较温和的 BC100 裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl (pH 7.9)、100 mM NaCl、10% 甘油、0.2 mM EDTA、0.2% Triton X-100 和 1× 蛋白酶抑制剂）。HA 多肽洗脱液可用于质谱分析，以鉴定所有特异性结合泛素化 p53 的蛋白伙伴。</li>
</ol>
5. 变性条件下泛素化蛋白的纯化
<ol>
	<li>向步骤 3.3 中获得的细胞沉淀加入 1 mL 冰冷的 PBS，混匀。取 100 µL 细胞悬液（1/10 体积）分装至微量离心管中，作为输入样品。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 700 × g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀。向输入样品中加入 80 µL Flag 裂解缓冲液，使用涡旋振荡器或移液枪混匀细胞，并在冰上裂解 1 小时。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 8,000 × g 离心 20–30 分钟。取 80 µL 上清液转移至新的微量离心管中。</li>
	<li>向上清液中加入 20 µL 5× SDS 上样缓冲液，在 98 °C 下煮沸 5–10 分钟，冰上冷却 2 分钟，然后于 -20 °C 保存备用。</li>
	<li>将剩余的 900 µL 细胞悬液在 4 °C 条件下以 700 × g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀。向细胞沉淀中加入 1 mL 泛素化缓冲液 1（UB 缓冲液 1；6 M 盐酸胍、0.1 M Na2HPO4、6.8 mM NaH2PO4、10 mM Tris-HCl（pH 8.0）和 0.2% Triton X-100，临用前新鲜添加 10 mM β-巯基乙醇和 5 mM 咪唑），通过反复吹打混匀数次，使细胞均匀分散。 
	注意：咪唑浓度可在 5 mM 至 20 mM 范围内调整，以减少蛋白质在镍螯合树脂上的非特异性结合。泛素化缓冲液含有盐酸胍，可使泛素连接酶和去泛素化酶（DUBs）失活。β-巯基乙醇为无色透明液体，具有类似臭鸡蛋的强烈刺激性气味。高浓度溶液会对黏膜、上呼吸道、皮肤和眼睛造成严重损伤。操作时应佩戴手套和护目镜，并在通风橱内进行。</li>
	<li>将细胞裂解物进行 10–20 次超声处理，直至溶液不再黏稠。在冰上进行超声，超声频率为 20 kHz，振幅为 80%，每次脉冲持续 1 秒。在室温下以 8,000 × g 离心 20–30 分钟，将上清液转移至新的微量离心管中。</li>
	<li>向上清液中加入 30 µL 镍螯合树脂，在 15 rpm 转速的旋转仪上孵育 4 小时或过夜（室温）。在室温下以 1,500 × g 离心 2 分钟，收集树脂珠。</li>
	<li>向树脂珠中加入 1 mL UB 缓冲液 1，在摇床上室温旋转孵育 10 分钟，然后在室温下以 1,500 × g 离心 2 分钟，收集树脂珠。</li>
	<li>向树脂珠中加入 1 mL 泛素化缓冲液 2（UB 缓冲液 2；8 M 尿素、0.1 M Na2HPO4、6.8 mM NaH2PO4、10 mM Tris-HCl（pH 8.0）和 0.2% Triton X-100），在摇床上室温旋转孵育 10 分钟，然后以 1,500 × g 离心 2 分钟收集树脂珠。重复此步骤一次。</li>
	<li>向树脂珠中加入 1 mL PBS，在摇床上室温旋转孵育 10 分钟，然后在室温下以 1,500 × g 离心 2 分钟收集树脂珠。重复此步骤一次。</li>
	<li>加入终浓度为 0.5 M 的咪唑溶液 40 µL，与树脂珠在室温下孵育 1 小时，以洗脱结合的蛋白质。在室温下以 1,500 × g 离心 2 分钟。</li>
	<li>将上清液转移至洁净的微量离心管中，加入 10 µL 5× SDS 上样缓冲液，在 98 °C 下煮沸 5 分钟，冰上冷却 2 分钟，然后于 -20 °C 保存用于 Western 印迹分析。或者，也可将未处理的洗脱液于 -80 °C 保存，用于其他下游实验。</li>
</ol>
6. 通过蛋白质印迹法检测纯化的泛素化蛋白
<ol>
	<li>采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离步骤 4.11 和 5.12 的样品，然后通过蛋白质印迹法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，使用相应的抗体检测目标蛋白，方法如文献18所述。</li>
	<li>简言之，将膜浸入含有 5% 脱脂奶粉的 TBST 缓冲液（15 mM Tris-HCl；pH = 7.6，4.6 mM Tris-碱，150 mM NaCl，使用前新鲜添加 0.1% Tween-20）中 20 mL，在室温下封闭 1 小时。随后，在室温下与一抗孵育 2 小时，或在 4 °C 下过夜孵育。每组使用以下抗体，所有一抗均按 1:1000 稀释：
	<ol>
		<li>使用抗-p53 单克隆抗体，在经 Flag/M2 琼脂糖珠免疫沉淀后检测总 p53 蛋白（包括泛素化 p53）。</li>
		<li>使用抗-HA 抗体或抗-泛素抗体，在经 Flag/M2 琼脂糖珠免疫沉淀后检测泛素化 p53 蛋白。</li>
		<li>使用抗-p53 单克隆抗体，在经镍离子树脂亲和沉淀后检测泛素化 p53 蛋白。</li>
		<li>使用抗-HA 抗体或抗-泛素抗体，在经镍离子树脂亲和沉淀后检测总泛素化蛋白。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 TBST 缓冲液洗涤膜 3 次，每次 5 分钟，随后在室温下与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育 1 小时，所有二抗均按 1:3000 稀释。然后，在轻度振荡条件下用 TBST 缓冲液洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>启动化学发光成像系统以检测蛋白质印迹信号。通过将溶液 A 和溶液 B 按 1:1 比例混合，配制 HRP 用底物溶液。</li>
	<li>将硝酸纤维素膜正面朝上置于暗箱中，使用移液枪均匀涂布底物溶液。选择自动曝光程序采集化学发光信号，并手动调节曝光时间，直至获得理想的信号图像。</li>
</ol>

<ol><li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).</li>
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<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mono-+versus+polyubiquitination%3A+differential+control+of+p53+fate+by+Mdm2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2.</a> Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).</li>
<li>Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+purification+of+ubiquitinated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the purification of ubiquitinated proteins.</a> Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).</li>
<li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+M+%22Molecular+Cloning+A+Laboratory+Manual.+%28Fourth+Edition%29%22">Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition)</a>. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. 28(2012).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

泛素化在几乎所有生理和病理性的细胞过程中都起着关键作用2。近年来，在理解泛素在信号通路中的分子作用以及泛素系统的变化如何导致不同人类疾病方面已取得重大进展2。纯化泛素化蛋白有助于深入揭示泛素化在这些过程中的确切功能。泛素偶联蛋白的混合物可从细胞中在非变性和变性条件下进行纯化。在变性条件下，可使用镍树脂的IMAC&#160;方法纯化带有多聚组氨酸标签的蛋白。在变性条件下纯化泛素化蛋白的目的是去除与目标蛋白相互作用的伴侣分子。在变性条件下，所有与目标蛋白结合的细胞组分都会在洗脱过程中被去除。相比之下，在天然条件下，部分与目标蛋白结合的细胞蛋白可能仍保留在洗脱液中，从而可能干扰后续实验。即使存在强变性剂，泛素化蛋白仍可被有效纯化，这显著减少了非特异性蛋白与镍树脂的结合。相反，包括其泛素化形式在内的全部目标蛋白，可在非变性条件下利用抗体偶联的琼脂糖微珠通过表位标签策略进行纯化。由于该过程采用抗体介导的亲和纯化，蛋白纯化在较温和的条件下进行。目标蛋白及其泛素化形式可通过特异性识别蛋白或泛素的抗体进行检测。HA标签和Myc标签蛋白可使用相同的抗体偶联琼脂...

泛素是一种由76个氨基酸组成的进化保守蛋白1,2,3泛素通过激活酶（E1）、结合酶（E2）和连接酶（E3）参与的级联反应，共价结合至靶蛋白的赖氨酸残基上。泛素首先由E1酶激活，随后转移至E2结合酶。接着，E3泛素连接酶同时与携带泛素的E2酶及底物蛋白相互作用，介导泛素C末端与底物蛋白中某个赖氨酸残基之间形成异肽键。1,2,3,4,5泛素化是指将泛素分子共价连接到底物蛋白的赖氨酸残基上或泛素自身，从而导致蛋白质发生单泛素化或多聚泛素化。该泛素化过程发生在真核细胞内，调控多种多样的生物学过程。泛素化可导致底物蛋白的降解。 通过 泛素-蛋白酶体系统1,2,3,4,5此外，泛素化可调节蛋白质的亚细胞定位、蛋白质复合物的形成以及细胞内蛋白质的转运3,5底物蛋白上连接的泛素基团可由去泛素化酶（DUBs）去除6,7值得注意的是，泛素链组装方式的多样性为调控各种生物过程提供了多种机制。1,5泛素化在调控底物蛋白功能中的确切作用至今仍未完全阐明。泛素化蛋白的纯化有助于揭示蛋白质泛素化对多种细胞过程的影响。
p53蛋白是最重要的肿瘤抑制蛋白之一，在几乎所有人类癌症中均表现出基因突变或失活8,9,10,11p53 的稳定性与活性受到精细调控 体内 通过翻译后修饰，包括泛素化、磷酸化、乙酰化和甲基化12,13p53蛋白在不同细胞中的半衰期较短，约为6至40分钟，这主要归因于其发生多聚泛素化后被蛋白酶体降解10,12小鼠双微粒体2（Mdm2）是一种p53的E3泛素连接酶，可结合p53的N端以抑制其转录活性。12,14,15Mdm2 促进 p53 的多聚泛素化及蛋白酶体降解以调控其稳定性，并介导 p53 的单泛素化以促进其核输出12,14,15,16此处以Mdm2介导的p53泛素化为例，详细介绍一种从哺乳动物细胞中纯化泛素化蛋白的方法。利用该方法可鉴定影响靶蛋白泛素化状态的调控因子。 在体 在哺乳动物细胞中过表达或敲低/敲除时进行泛素化检测。此外，泛素化蛋白可用作底物用于 体外 去泛素化实验。可通过将泛素化底物与各个去泛素化酶（DUB）分别孵育，进行高通量筛选以鉴定特定靶蛋白对应的DUB。细胞中，泛素化蛋白可能作为支架招募下游信号蛋白。在天然纯化条件下，可通过连续免疫沉淀纯化泛素化靶蛋白复合物，并通过质谱分析进行鉴定。本方案可广泛用于研究受泛素化调控的细胞蛋白。

关键词：去泛素化实验，高通量筛选，去泛素化酶（DUB），泛素化底物，免疫沉淀，质谱分析，泛素化蛋白，信号转导，蛋白复合物，天然纯化条件
已建立多种方法用于纯化泛素化蛋白，包括使用亲和标签标记的泛素、泛素抗体、泛素结合蛋白以及分离的泛素结合结构域（UBDs）17在此，我们提供一种利用亲和标签标记的泛素作为介导物，在哺乳动物细胞中纯化泛素化蛋白的实验方案。使用多聚组氨酸（poly-His）标签标记的泛素相较于其他方法具有多项优势。泛素化蛋白的纯化可在强变性剂存在下进行，这有助于使细胞内蛋白线性化并破坏蛋白-蛋白相互作用，从而显著降低非特异性蛋白与镍螯合树脂的结合。相比之下，若采用泛素抗体、泛素结合蛋白或分离的泛素结合结构域（UBD）作为介导物，则必须在较为温和的条件下进行纯化，难以有效排除目标蛋白的结合伙伴。此外，这些介导物在纯化过程中还可能导致无关蛋白的非特异性结合增加。同时，泛素结合蛋白或分离的UBD对不同类型的泛素链连接形式（包括单泛素化和多泛素化）均存在结合倾向，影响纯化特异性。17使用带有多聚组氨酸标签的泛素有助于沉淀所有细胞内的泛素化蛋白。 alternatively，使用市售的与琼脂糖偶联的抗Flag或抗HA抗体，可在非变性条件下更便捷地免疫沉淀大规模的Flag或HA标签目标蛋白。 第二步纯化，例如通过针对带有多聚组氨酸标签泛素的镍离子螯合树脂，可用于获得高纯度的泛素化目标蛋白，以用于后续实验。 值得注意的是，当无法获得能有效免疫沉淀目标蛋白的特异性抗体时，可采用表位标签纯化策略。 最后，与纯化相比，哺乳动物细胞中泛素化蛋白的纯化 体外在更接近生理条件的情况下，保留了靶蛋白的泛素连接方式。

<table><tbody><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sangon Biotech</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL 小鼠 IgG，HRP 标记全抗体（来自绵羊）</td><td>GE healthcare</td><td>NA931</td><td>二抗</td></tr><tr><td>Amersham ECL 大鼠 IgG，HRP 标记全抗体（来自驴）</td><td>GE healthcare</td><td>NA935</td><td>二抗</td></tr><tr><td>Anti-Flag M2 亲和凝胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td>FLAG/M2 琼脂糖珠</td></tr><tr><td>抗 GFP 单克隆抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9996</td><td>一抗</td></tr><tr><td>抗 HA 高亲和力抗体</td><td>Roche</td><td>11867423001</td><td>一抗</td></tr><tr><td>抗 Mdm2 单克隆抗体（SMP14）</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-965</td><td>一抗</td></tr><tr><td>抗 p53 单克隆抗体（DO-1）</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td>一抗</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Alddich</td><td>E5134</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>VivaCell</td><td>C04001-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>FLAG 肽段</td><td>Sigma-Alddich</td><td>F3290</td><td>洗脱缓冲液配制</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>添加剂</td></tr><tr><td>盐酸胍</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100287-0500</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>H1299</td><td>中国科学院干细胞库</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Lab</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500529-0100</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>Immobilon Western 化学发光 HRP 底物</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 试剂</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>MG132</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-13259</td><td>蛋白酶体抑制剂</td></tr><tr><td>Na₂HPO₄</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501727-0500</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610476-0005</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Alddich</td><td>201154</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>NaH₂PO₄</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501726-0500</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>Ni-NTA 琼脂糖</td><td>QIAGEN</td><td>30230</td><td>镍离子负载树脂</td></tr><tr><td>硝酸纤维素印迹膜</td><td>GE healthcare</td><td>10600002</td><td>0.45 &amp;micro;m 孔径</td></tr><tr><td>Opti-MEM 低血清培养基</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>转染培养基</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-cv</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607011-0100</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Biological Industries</td><td>01-100-1ACS</td><td>培养基</td></tr><tr><td>Sarkosyl</td><td>Sigma-Alddich</td><td>L5777</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>SDS 上样缓冲液</td><td>Beyotime</td><td>P0015L</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>添加剂</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501492-0005</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610103-0250</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech</td><td>A110694-0500</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100777-0500</td><td>添加剂</td></tr><tr><td>超灵敏化学发光成像系统</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>ChemiDoc XRS+</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sangon Biotech</td><td>A510907-0500</td><td>溶剂</td></tr></tbody></table>

从哺乳动物细胞中纯化泛素化p53蛋白

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

泛素化是一种翻译后修饰，不仅调控底物蛋白的稳定性，还调控其定位和功能。泛素化过程发生在真核细胞内，几乎调控所有基本的细胞生物学过程。纯化泛素化蛋白有助于研究泛素化在调控底物蛋白功能中的作用。本文以p53肿瘤抑制蛋白为例，详细描述了一步一步纯化哺乳动物细胞中泛素化蛋白的实验流程。泛素化的p53蛋白在严格的非变性条件和变性条件下均实现了纯化。在非变性条件下，利用抗Flag抗体偶联的琼脂糖树脂纯化全细胞中的Flag标签p53蛋白。 alternatively，在变性条件下，利用镍离子负载的树脂纯化全细胞中的His标签泛素化蛋白。通过特异性抗体可在洗脱液中成功检测到泛素化的p53蛋白。采用该方法，可从哺乳动物细胞中高效纯化特定蛋白的泛素化形式，从而促进对泛素化调控蛋白功能作用的研究。

示意图显示了带 Flag 标签的 p53（Flag-p53）和带 His/HA 双标签的泛素（HH-Ub）蛋白（图 1A）。用于纯化泛素化蛋白的实验流程总结于 图 1B。在哺乳动物细胞中，带有 Poly-His 标签的泛素可连接至靶蛋白。泛素化蛋白可在非变性条件下使用 Flag/M2 琼脂糖微珠进行纯化，或在变性条件下通过固定化金属离子亲和层析（IMAC）进行纯化（图 1B）。在非变性条件下，从 H1299 细胞中使用 Flag/M2 微珠免疫沉淀总 p53 蛋白（包括泛素化的 p53）。泛素化 p53 蛋白在免疫印迹上表现为从低到高分子量的弥散条带，当在这些细胞中外源表达 Mdm2 时，该信号显著增强，表明泛素化 p53 蛋白已从细胞中被有效纯化（图 2）。接下来，在变性条件下裂解细胞，并使用镍离子负载树脂下拉总细胞泛素化蛋白。通过抗 HA 单克隆抗体进行 Western 印迹检测总细胞泛素化蛋白，...

本方案描述了一种从哺乳动物细胞中纯化泛素化蛋白的逐步方法，并以p53肿瘤抑制蛋白为例。在严格的非变性与变性条件下，从细胞中纯化出泛素化的p53蛋白。

泛素化是一种翻译后修饰，不仅调控底物蛋白的稳定性，还调控其定位和功能……

通过本方案，可从哺乳动物细胞中高效纯化特定蛋白质的泛素化形式，有助于研究泛素化在调控蛋白质功能中的作用。与体外纯化相比，从哺乳动物细胞中纯化泛素化蛋白质能够更真实地保留目标蛋白质的泛素连接模式。首先，在三个15毫升离心管中各加入1.5毫升低血清培养基。向每支离心管中加入可用于转染的质粒DNA，并加入0.2微克绿色荧光蛋白质粒以监测转染效率。在另一支离心管中，将78微升脂质体转染试剂加入4.5毫升低血清培养基中以稀释脂质体。通过轻弹管壁充分混匀，然后在室温下静置5分钟。向每支含有1.5毫升稀释DNA溶液的试管中加入1.5毫升稀释的脂质体溶液。充分混匀，并在室温下孵育至少20分钟，使质粒与脂质体交联。弃去培养皿中的原培养基，每皿加入9毫升低血清培养基。加入3毫升脂质体DNA混合物，通过轻轻前后摇晃培养板三次，再左右摇晃三次，使混合物在培养板上均匀分布。将细胞置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中培养。4至6小时后更换培养基，继续培养细胞24至36小时。在24至36小时后，用MG132处理细胞，终浓度为10 µM，处理4至6小时。弃去培养基，用预冷的PBS洗涤细胞两次。向培养皿中加入1毫升PBS。用洁净的刮刀刮下细胞，将细胞悬液转移至微量离心管中。在700 ×g下离心5分钟，收集细胞沉淀。向每管细胞中加入800 µL预冷的含蛋白酶抑制剂混合物的FLAG裂解缓冲液。使用涡旋振荡器或移液枪混匀细胞，然后将混合物置于旋转仪上，在4 °C条件下孵育30分钟。在冰上进行超声处理，每次脉冲持续1秒，对混合物施加5至10次短脉冲。将混合物置于40 RPM的旋转仪上，在4 °C条件下孵育30分钟。然后在4°C条件下，以8,000 G离心超声处理后的样品20至30分钟。将上清液转移至新的微量离心管中。取80微升细胞提取物，与20微升5X SDS上样缓冲液混合。将样品在 98 摄氏度下煮沸 5 分钟。在冰上冷却 2 分钟，然后于 -20 摄氏度保存备用。将这些样品用作输入组以监测蛋白表达水平。接下来，向剩余的细胞裂解液中加入 30 µL 与抗 FLAG M2 抗体偶联的磁珠，在 4 °C 条件下于旋转仪上孵育至少 4 小时或过夜。在 4 °C 下以 1,500 ×g 离心 2 分钟，收集磁珠。向磁珠中加入 1 mL 冰冷的 FLAG 裂解缓冲液，通过反复倒置离心管混匀。重复此步骤四到六次，然后向珠子中加入 40 微升 FLAG 肽，终浓度为每微升 200 纳克。如前所述，在旋转仪上孵育两小时，随后在相同温度下离心。将上清液转移至新的微量离心管中，并加入 10 微升 5X SDS 上样缓冲液。将混合物在98摄氏度下煮沸五分钟，然后在冰上冷却两分钟。向细胞沉淀中加入一毫升冰冻的PBS，混匀。取100微升细胞悬液分装至微量离心管中作为输入样品，在4摄氏度下以700 ×g离心五分钟，收

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从哺乳动物细胞中纯化泛素化p53蛋白

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